Name: Kolorektal Kanser Riski ve Yaygınlığının Dışkı DNA Bütünlüğü Saptanması ile Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Keşfedin, dışkı DNA bütünlüğü analiziyle kolorektal kanser riskini ve neoplastik lezyon varlığını invaziv olmayan yöntemle değerlendirin. FL-DNA kiti mevcut tarama testleriyle birlikte kullanıldığında kanser tahmin doğruluğunu artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarların hiçbir takdiri yok.

Hastalar 2013 ve 2015 yılları arasında Meldola'daki (FC, İtalya) Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori'de (IRST) işe alındı. Kayıtlı hastalar IRST Etik Komitesi tarafından onaylanan IRSTB002 protokolüne girmiştir (25/10/2012, ver. 1). Tüm yöntemler ilgili yönerge ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı.
1. Dışkıdan DNA çıkarma
<ol><li>Dışkı örnekleri hazırlamak için bir kit kullanın (Bkz. MalzemeTablosu). Üreticinin talimatlarına göre çıkarma gerçekleştirerek dışkı malzemeseçin ve tedavi. Saflaştırılmış DNA'yı doğrudan yükseltin veya sonraki analizler için -20 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. Pozitif kontrol, standartlar, ani DNA ve klinik örneklerin hazırlanması
<ol><li>Standartların ve numunelerin hazırlanması<ol>
<li>Pozitif kontrolü, standartları, ani DNA'yı ve tüm klinik örnekleri hazırlamak için, pozitif kontrol, standartlar ve ani DNA'nın bir aliquot'unu santrifüj edin, sonra doğru miktarda su ekleyerek her reaktifi askıya alın (aşağıya bakın). Sonra, dikkatlice pozitif kontrol girdap, standart, ve başak-DNA, sonra 10 s santrifüj. Kuru reaktiflerin tamamen yeniden askıya alınmasını sağlamak için sıvı reaktifleri kullanmadan önce 30 dakika oda sıcaklığında (RT) saklayın.<ol>
<li>Pozitif kontrol kuru formatta insan DNA'sudur. Her aliquot'u 750 μL su ile yeniden askıya alın.</li>
			<li>Başak-DNA somon(Oncorhynchus keta) DNA, dışkı çıkarılan DNA örneklerinde inhibitörleri olası varlığını doğrulamak için eksojen bir iç kontrol olarak kullanılır. Her aliquot'u 100°L su ile yeniden askıya alın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Standart eğriyi hazırlamak için, stok çözeltisinden başlayarak dört adet 1:5 seyreltme üretin. Standart noktalar 10 ng/reaksiyon, 2 ng/reaksiyon, 0.4 ng/reaksiyon ve 0.08 ng/reaksiyon olmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1x spike-in DNA'nın hazırlanması<ol>
<li>Kullanmadan önce doğrudan ani DNA kontrolünü hazırlayın.</li>
		<li>5 μL FL-DNa çivisini 20 μL steril suyla karıştırarak 1x ani DNA kontrolünü hazırlayın. 1x spike-in DNA kontrol örneklerinin sayısı analiz edilecek numune lerin sayısına ve pozitif kontrole göre hazırlanacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Örneklerin hazırlanması<ol>
<li>Toplam hacmi 100 μL olan 25 μL 1x spike-in DNA ile numunelerin 75°L'sini (klinik numuneler veya pozitif kontrol) karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. QPCR Easy PGX kullanarak FL-DNA değerinin yükseltilmesi ve tayini
NOT: İnsan DNA'sını ve iç kontrolü hedefleyen spesifik astar ve probları içeren komple amplifikasyon karışımları FL-DNA Mix A ve FL-DNA Mix B. Standartları, pozitif ve negatif kontroller için 8 kuyu şeridinde lyophilised formatında sağlanmaktadır ve numuneler her iki liyofilize karışımla güçlendirilmelidir. Klinik numuneler sadece her iki lyophilized karışımları ile çoğaltılması gerekir.
<ol><li>QPCR cihazı ve işletim yazılımı için Malzeme Tablosuna bakın.<ol>
<li>Çalışma yazılımını açın ve plakayı ve termal profili ayarlayın:<ol>
<li>Plakayı Tablo 1'degösterildiği gibi ayarlayın.<ol>
<li>Sütun 1'deki sekiz pozisyonun yanı sıra kuyu türünü Standartolarak ayarlayın.</li>
				<li>NTColarak A2 ve B2 kuyuları için kuyu türünü ayarlayın.</li>
				<li>C2 ve D2 (pozitif denetimler) için kuyu türünü Bilinmiyorolarak ayarlayın.</li>
				<li>Diğer tüm konumlar için kuyu türünü Bilinmiyor olarak ayarlayın.
</li>
				<li>Tüm 96 pozisyonları seçin ve Boyalar FAM ve HEXekleyin. Plakayı Eşitle'yitıklatın.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Termal profili Tablo 2'yegöre ayarlayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tüpün altına içeriğini getirmek için 10 s için şeritler gerekli sayıda santrifüj.</li>
		<li>İçeriği korumaya dikkat ederken contaları şeritlerden yavaşça çıkarın ve ilgili şeritlere ekleyin: negatif kontrol: 20°L su; örnek: 20 μL DNA; standart eğri: Standart 1, 2, 3 veya 4'ün 20°L'si; pozitif kontrol: 20 μL pozitif kontrol.</li>
		<li>8 şeritli düz optik kapakları ve girdapları kullanarak tüm şeritleri birkaç saniye boyunca dikkatlice kapatın.</li>
		<li>10 s için şeritler santrifüj ve alet içine yükleyin. O zaman koşmaya başla.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Veri analizi
NOT: Veri analizi yazılıma bağlı olarak otomatik olarak veya el ile gerçekleştirilebilir (Bkz. Malzeme Tablosu).
<ol><li>Koşunun sonunda, "FAM: FL-DNA-A" ve "HEX: IC"için A, C, E, G sütunlarını ve "FAM: FL-DNA-B" ve "HEX: IC"sütunlarını seçin.</li>
	<li>Standart Miktar Başlangıç Tutarıiçin aşağıdakileri ayarlayın: A1 ve B1 kuyuları için 10 ng/reaksiyon, C1 ve D1 için 2 ng/reaksiyon, E1 ve F1 için 0,4 ng/reaksiyon ve G1 ve H1 için 0,08 ng/reaksiyon.</li>
	<li>Eşik Floresan değerlerini hem FAM (FL-DNA A ve FL-DNA B) hem de HEX (IC) kanalları için 150'ye ayarlayın.</li>
	<li>Kutuda Sonuç Tablosu, Sütun Seçenekleri' ni tıklatın | Tümünü Seçin | Tamam kendi Cq (』R) ve 』R son değerleri ile her iki kanalda sonuçları elde etmek için. NOT: Bu değerler Gerçek Zamanlı PCR enstrüman yazılımı tarafından sağlanmaktadır. ΔR son floresan değeri son amplifikasyon döngüsüne normale karşılık gelir.</li>
	<li>Sonuç Tablosu kutusunda, bağlam menüsünü açmak için tabloya sağ tıklayın ve ham verileri dışa aktarmak için Excel'e Gönder'i tıklatın.</li>
	<li>Standart eğrinin uygunluğunu doğrulamak için standartların değerlerini kontrol edin.</li>
	<li>Her FL-DNA karışımı için R2 ["R² (』R)" sütununa ve verimliliği ["Verimlilik (%)" sütun] değerleri. Kabul edilebilir bir aralıkta iseler, analize üreticinin talimatlarına göre devam etmek mümkündür (Tablo 3).</li>
	<li>FAM kanalının sonuçları beklenen aralıkta değilse, standart eğrinin bir noktasını atla ve çalıştırmayı yeniden analiz edin.</li>
	<li>"Cq yok" değerlerini sıfır olarak göz önünde bulundurarak negatif ve pozitif denetimlerin değerlerini aşağıdaki formülle belirleyin: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq2.jpg">
</li>
	<li>Elde edilen değerleri Tablo 4'tebildirilenlerle karşılaştırın.</li>
	<li>Reaksiyon kontrolleri beklenen değerler aralığındaysa, örneklerin analizine devam edin. NOT: Elde edilen Cq değerlerinin bir artifadan (doğrusal floresan eğrisi) değil, gerçek bir amplifikasyon reaksiyonundan (sigmoidal floresan eğrisi) üretildiğini doğrulayın.</li>
	<li>Her FL-DNA karışımı için numunenin uygunluğunu analiz etmek için HEX kanalının Cq değerlerini karşılaştırın. Değer ≥16 ise, numunelerin analizine devam edin. Değer &lt;16 ise veya Cq yoksa, büyük olasılıkla FL-DNA Spike'ın dağıtım hatasına bağlıdır. Bu nedenle, örnekleri analiz etmek mümkün değildir.</li>
	<li>Pozitif kontrolün "HEX" kanalındaki Cq değerlerinin ortalamasını aşağıdaki formülü kullanarak hesaplayabilirsiniz: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq3.jpg">
</li>
	<li>Aşağıdaki formülü kullanarak örnek "HEX" kanalındaki Cq değerlerinin ortalamasını hesaplayabilirsiniz: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq4.jpg">
</li>
	<li>CqHEX değerlerini aşağıdaki formüle göre hesaplayın: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq5.jpg">
</li>
	<li>Örneklerin CqHEX değerlerini Tablo 5'tebildirilenlerle karşılaştırın.</li>
	<li>Her karışım için (Mix A ve Mix B), FAM kanalının Cq değerlerini Tablo 6'da bildirilenlerle karşılaştırın.
</li>
	<li>Her uygun numunenin FL-DNA değerini belirlemek için aşağıdaki formülü kullanarak "Cq yok" değerlerini sıfır olarak göz önünde bulundurun: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq6.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59426/59426eq2.jpg"> NOT: Rengucci ve ark.12 tarafından elde edilen Fagan nomogram sonuçlarına göre iFOBT ve FL-DNA değerlendirmelerinin bir fonksiyonudur (Tablo 7).</li>
</ol>

<ol><li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Genetics+of+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular Genetics of Colorectal Cancer.</a> Annual Review of Pathology. 6, 479-507 (2011).</li>
<li>Sears, C. L., Garrett, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbes%2C+Microbiota%2C+and+Colon+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Microbes, Microbiota, and Colon Cancer.</a> Cell Host and Microbe. 15, 317-328 (2014).</li>
<li>SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. National Cancer Institute. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html">http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html</a> (2019).</li>
<li>Levin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+Surveillance+for+the+Early+Detection+of+Colorectal+Cancer+and+Adenomatous+Polyps%2C+2008%3A+A+Joint+Guideline+From+the+American+Cancer+Society%2C+the+US+Multi-Society+Task+Force+on+Colorectal+Cancer%2C+and+the+American+College+of+Radiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Screening and Surveillance for the Early Detection of Colorectal Cancer and Adenomatous Polyps, 2008: A Joint Guideline From the American Cancer Society, the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer, and the American College of Radiology.</a> Gastroenterology. 134, 1570-1595 (2008).</li>
<li>Bosch, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tests+for+colorectal+cancer+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Colorectal+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular tests for colorectal cancer screening.</a> Clinical Colorectal Cancer. 10, 8-23 (2011).</li>
<li>Ahlquist, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+detection+of+colorectal+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Molecular detection of colorectal neoplasia.</a> Gastroenterology. 138, 2127-2139 (2010).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+multiple+molecular+tests+to+detect+colorectal+cancer+in+stool%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fecal multiple molecular tests to detect colorectal cancer in stool.</a> Clinical Gastroenterology and Hepatology. 1, 377-383 (2003).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+colorectal+cancer+by+a+quantitative+fluorescence+determination+of+DNA+amplification+in+stool%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Detection of colorectal cancer by a quantitative fluorescence determination of DNA amplification in stool.</a> Neoplasia. 6, 536-540 (2004).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescence+determination+of+long-fragment+DNA+in+stool+as+a+marker+for+the+early+detection+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescence determination of long-fragment DNA in stool as a marker for the early detection of colorectal cancer.</a> Cellular Oncology. 31, 11-17 (2009).</li>
<li>Calistri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+DNA+for+noninvasive+diagnosis+of+colorectal+cancer+in+immunochemical+fecal+occult+blood+test-positive+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology+Biomarkers+and+Prevention%22%5BJournal%5D)">Fecal DNA for noninvasive diagnosis of colorectal cancer in immunochemical fecal occult blood test-positive individuals.</a> Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 19, 2647-2654 (2010).</li>
<li>De Maio, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+and+stool+nucleic+acid+analysis+for+colorectal+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Circulating and stool nucleic acid analysis for colorectal cancer diagnosis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20, 957-967 (2014).</li>
<li>Rengucci, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+stool+DNA+integrity+method+for+early+colorectal+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiology+Biomarkers+and+Prevention%22%5BJournal%5D)">Improved stool DNA integrity method for early colorectal cancer diagnosis.</a> Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. 23, 2553-2560 (2014).</li>
</ol>

Maura Menghi, Diatech Pharmacogenetics srl şirketinin tam zamanlı çalışanıdır.

Önceki çalışmalar, manuel ve yarı otomatik yaklaşımlar la elde edilen dışkıDNA bütünlüğü analizi kolorektallezyonlarınerken teşhisi için alternatif bir araç temsil edebilir göstermiştir7 ,8,9,10,11,12. Kolorektal kanserin saptanması için yıllar içinde moleküler, noninvaziv tarama testleri geliştirilmiştir, ancak bu yöntemleri...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59426/evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity">Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection</a>. An&#160;affiliation&#160;was&#160;updated.
The first&#160;affiliation was updated from:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST)
to:
Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) IRCCS, Meldola, Italy

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/59426/evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity">Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection</a>. An&#160;affiliation&#160;was&#160;updated.

Erratum: Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Kolorektal kanser (CRC) hangi sağlıklı epitel yavaş yavaş adenomlar veya polipler, zamanla malign karsinomlar içine ilerleme gelişir çok aşamalı bir süreç türetilmiştir1,2. CRC'nin yüksek insidansı oranına rağmen, ölüm lerin yüzdesinde bir düşüş eğilimi gözlenmiştir3. Nitekim tarama programlarında benimsenen erken tanı araçları pre-neoplastik adenomların veya poliplerin erken saptanması ve çıkarılmasına yol açmıştır4. Ancak, farklı teknik sınırlar nedeniyle, bu yöntemlerin hiçbiri en uygun değildir. Nitekim, duyarlılık ve özgüllüğü artırmak için, birçok dışkı DNA testleri tek başına veya mevcut rutin tanı testleri ile birlikte önerilmiştir5,6.
Tipik olarak, sağlıklı mukoza dışkı akışı apoptotik kolonositler içine döker, hastalıklı mukoza non-apoptotik kolonositler eksfoliyates ise. 200 bp veya daha uzun parçaları non-apoptotic DNA karakterize. Bu DNA uzun DNA (L-DNA) olarak adlandırılır ve CRC erken tanısı için kullanılabilir bir biyomarker haline gelmiştir. L-DNA dışkı örneğinden izole edilebilir ve qPCR tarafından in vitro diagnostik FL-DNA kiti7,8,9,10,11,12kullanılarak ölçülebilir.
Test, 138 bp ile 339 bp arasında değişen FL-DNA parçalarının tespiti için iki testten oluşur. Her bir titre fl-DNA (FAM) yanı sıra ani DNA (HEX) amplifikasyon sağlar. Tüm parçaların en iyi şekilde amplifikasyonlanmasını sağlamak için test iki teste ayrılmıştır ("A" ve "B" olarak adlandırılır). A testi, APC geninin 14 ekon 14 bölgesinin iki bölgesini (NM_001127511) ve TP53 geninin (NM_001276760) ekson 7'sinin bir parçasını algılar. B testi, APC geninin 14(NM_001127511) ekson 14'ünün ve TP53 geninin 5 ve 8 ekonlarının iki bölgesinin (NM_001276760) bir parçasını algılar. Tahliller algılanan bölgeler arasında ayrım yapmaz. Ani DNA Oncorhynchus keta somon DNA karşılık gelir ve prosedür düzgün yapılmış ve yanlış negatif sonuçlar verebilir inhibitörleri olası varlığı için kontrol doğrulama sağlar. FL-DNA konsantrasyonu standart eğri yöntemi kullanılarak mutlak niceleme ile değerlendirilir ve ng/reaksiyon olarak ifade edilir.
FL-DNA yöntemi, immünokimyasal tabanlı dışkı okült kan testi (iFOBT) ile birlikte, şu anda CRC tarama programlarında kullanılan ve CRC ve / veya yüksek riskli adenom lezyonları daha iyi tahminler için izin veren non-invaziv ve ucuz dışkı DNA testi12.

<table><tbody><tr><td>1,5 mL ve 2 mL polipropilen bükümlü kilitli tüpler (DNase-, RNase-, DNA-, PCR inhibitörü içermez)</td><td></td><td></td><td>DNA ekstraksiyonu ve Real Time PCR için gerekli sarf malzemeleri</td></tr><tr><td>Mutlak Etanol (analitik derece kalitesi)</td><td></td><td></td><td>DNA ekstraksiyonu için gerekli reaktif</td></tr><tr><td>Masaüstü santrifüj&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Maksimum hız 20000 x g. DNA ekstraksiyonu için gerekli cihaz</td></tr><tr><td>EasyPGX analiz yazılımı sürüm 2.0.0</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT800-SW</td><td>Analiz yazılımı&nbsp;</td></tr><tr><td>EasyPGX santrifüj/vorteks 8 oyuklu şeritler</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT803</td><td>Gerçek Zamanlı PCR testi için önerilen cihaz</td></tr><tr><td>EasyPGX qPCR cihazı 96&nbsp;</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT800-96</td><td>Real Time PCR testi için önerilen cihaz</td></tr><tr><td>EasyPGX ready FL-DNA</td><td>Real Time PCR testi için gerekli</td>olan <td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT029</td> Kiti</tr><tr><td>Mikropipetler (1 ila 1.000 & mikro; L)</td><td></td><td></td> <td>DNA ekstraksiyonu ve Real Time PCR için gerekli sarf malzemeleri</td></tr><tr><td>Pudrasız tek kullanımlık eldivenler</td><td></td><td></td><td>DNA ekstraksiyonu ve Real Time PCR</td></tr><tr><td>QIAamp Fast DNA Taburesi</td> için gerekli sarf malzemeleri <td>Dışkıdan DNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması için önerilen</td><td>Qiagen</td><td>51604</td> Kiti</tr><tr><td>Steril filtre uçları DNase-, RNaz içermez (1 ila 1.000 & mikro arası hacimler; L)</td><td></td><td></td> <td>DNA ekstraksiyonu ve Real Time PCR için gerekli sarf malzemeleri</td></tr><tr><td>Termal blok, örneğin EasyPGX kuru blok,</td><td>Diatech Farmakogenetik</td><td>RT801</td><td>DNA ekstraksiyonu için gerekli cihaz</td></tr><tr><td>, Vorteks, örneğin EasyPGX santrifüj/vorteks 1.5 ml&nbsp;</td><td>Diatech Pharmacogenetics</td><td>RT802</td><td>DNA ekstraksiyonu için gerekli alet</td></tr></tbody></table>

kolorektal kanser riski ve yaygınlığının dışkı dna bütünlüğü saptanması ile değerlendirilmesi

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Günümüzde dışkı DNA'sı çeşitli yöntemlerle izole edilip analiz edilebilir. Dışkıdaki uzun DNA parçaları, pre-neoplastik veya neoplastik kolorektal lezyonların varlığına karşı güvenilir bir olasılık sağlayan bir qPCR testi ile saptanabilir. Floresan uzun DNA (FL-DNA) olarak adlandırılan bu yöntem, primer önleme sistemi üzerinde bir gelişme olan hızlı, non-invaziv bir işlemdir. Bu yöntem, genomik DNA'nın belirli hedeflerinin nicel amplifikasyonu ile dışkı DNA bütünlüğünün değerlendirilmesi üzerine kuruludur. Özellikle 200 bp'den uzun DNA parçalarının değerlendirilmesi, çok yüksek özgüllüğü olan kolorektal lezyonları olan hastaların saptanmasına olanak sağlar. Ancak, bu sistem ve mevcut tüm dışkı DNA testleri ele alınması gereken bazı genel sorunları (örneğin, testlerin yapılması gereken sıklığı ve her birey için her zaman noktasında toplanan dışkı örneklerinin en uygun sayıda) mevcut. Ancak, FL-DNA'nın en büyük avantajı, immünokimyasal tabanlı dışkı okült kan testi (iFOBT) olarak bilinen CRC tarama programında kullanılan bir testle birlikte kullanma imkanıdır. Gerçekten de, her iki test de aynı örnek üzerinde yapılabilir, maliyetleri azaltarak ve kolorektal lezyonların nihai varlığı daha iyi bir tahmin elde.

Bu protokolün iş akışı Şekil 1'degösterilmiştir. İş akışı, bu adım sonuçlarına göre iki denetim adımı ve farklı eylemler sağlar. İlk olarak, bir örnek uygun olmayan denetimler sunuyorsa, amplifikasyon tekrarlanmalıdır. İkinci olarak, amplifikasyon inhibe edilirse, örnek baştan yeniden işlenmeli veya değerli değil olarak sınıflandırılmalıdır.
Şekil 2 pozitif ve negatif örneklerle üretilen floresan eğrilerini göstermektedir. (A) Gösterilen uygun...

Sunulan tanısal FL-DNA kiti kolorektal kanser lezyonlarının varlığı güvenilir olasılığını belirlemek için zaman kazandıran ve kullanıcı dostu bir yöntemdir.

Kolorektal Kanser Riski ve Yaygınlığının Dışkı DNA Bütünlüğü Saptanması ile Değerlendirilmesi

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Bu yöntem, kolorektal neoplastik lezyonlu hastayı non-invaziv bir yaklaşımla saptamaya izin verir. Özellikle, Bu test izin verir, şu anda kolorektal kanser tarama programında kullanılan testler ile birlikte, daha iyi kanser veya anormal lezyonların daha yüksek risk varlığını tahmin etmek için. Bu protokolü başlatmak için, her pozitif kontrol, standart DNA ve spike-in DNA'nın bir aliquot'unu, bir mini santrifüj üzerinde 10 saniye boyunca kuru bir biçimde santrifüj edin.750 mikrolitre su ile pozitif kontrolü yeniden askıya alın. 100 mikrolitre su ile inhibitörlerin varlığını test etmek için eksojen bir iç kontrol olarak kullanılan ani DNA'yı yeniden askıya alın. Standart eğri için, 100 mikrolitre su ile kuru standardı yeniden askıya alın ve stok çözeltisinden başlayarak dört adet 1:5 seyreltme yapın.Daha sonra reaktifleri 15 saniye boyunca dikkatlice girdaplayın ve 10 saniye mini bir santrifüjde santrifüj yapın. Tam bir süspansiyon için, kullanmadan önce 30 dakika oda sıcaklığında sıvı reaktifler saklayın. 1x spike-in DNA kontrolünü hazırlamak için, 5 mikrolitre FL-DNA çivisini 45 mikrolitre steril suyla karıştırın.Numuneler için, her numunenin 75 mikrolitresini 50 mikrolitre 1x başak DNA ile karıştırın ve toplam hacmi 125 mikrolitreye getirin. İlk olarak, qPCR işletim yazılımını açın. Plakayı ayarlamak için, Birinci sütundaki sekiz pozisyonun tümü için Well Type'ı Standart olarak ayarlayın.NTC olarak A2 ve B2 kuyuları için Well Type ayarlayın. Pozitif denetimler için Well Type'ı, C2 ve D2'yi Bilinmiyor olarak ayarlayın. Ve bilinmeyen olarak diğer tüm pozisyonlar için Well Type ayarlayın.96 pozisyonun tümünü seçin. Boyaları, FAM ve HEX'i ekleyin ve Plakayı Eşitle'yi tıklatın. Sonra termal profil, sağlanan ayarlayın.İnsan DNA'sını ve iç kontrolü hedefleyen özel astar ve problarla, tamamen lyophilized amplifikasyon karışımları içeren 8-iyi şeritler istenilen sayıda hazırlayın. Tüplerin altına içeriğini getirmek için, 10 saniye boyunca şeritler santrifüj. Mühürleri şeritlerden yavaşça çıkarın, pelet kaybetmemeye özen.Daha sonra negatif kontrol kuyularına 25 mikrolitre su ekleyin. Kuyuları örneklemek için 25 mikrolitre örnek DNA ve pozitif kontrol kuyularına 25 mikrolitre pozitif kontrol DNA'sı. Standart eğri için, her bir kuyuya 25 mikrolitre standart 1, 2, 3 ve 4 ekleyin.Tüm şeritleri ve girdapları birkaç saniye liğine dikkatlice kapatmak için 8 şeritli düz optik kapaklar kullanın. Şeritleri 10 saniye santrifüj edin, alete yükleyin ve koşmaya başlayın. Çalışma sonunda, FAM FL-DNA A ve HEX IC için, SEÇİlMİş sütunlar, A, C, E ve G.FAM FL-DNA B ve HEX IC için, standart başlayan miktarlar için sütunlar, B, D, F ve H.'yi seçin, A1 ve B1 kuyuları için reaksiyon başına 10 nanogram, C1 ve D1 için reaksiyon başına iki nanogram, E1 ve F1 için reaksiyon başına dört nanogram nokta , ve G1 ve H1 için reaksiyon başına sıfır sekiz nanogram. Daha sonra, hem FAM hem de HEX kanalları için Eşik Floresan değerlerini 150 olarak ayarlayın.Kutu Sonuç Tablosu'nda, gerçek zamanlı qPCR enstrüman yazılımı tarafından sağlanan ilgili Cq ve delta R son değerleri ile her iki kanalda da sonuçları elde etmek için Sütun Seçenekleri'ni tıklatın, ardından Tümü Seç'i ve ardından Tamam'ı tıklatın. Delta R son floresan değeri son amplifikasyon döngüsüne normale karşılık gelir. Sonuç Tablosu kutusunda, bağlam menüsünü açmak için tabloya sağ tıklayın.Ham verileri dışa aktarmak için Excel'e Gönder'i tıklatın. Ve sonra FL-DNA miktarı otomatik hesaplama için özel analiz yazılımı excel dosyası yükleyin. Her hasta için iFOBT ve FL-DNA değerleri tahmini kombinasyonu, kolorektal kanser riski.Uygun pozitif bir numunenin floresan eğrileri, iç kontrol olan HEX kanalındaki örnek sinyalini kabul edilebilir aralıkta gösterir. Pozitif sinyal, hedef genlerin amplifikasyongösteren FAM kanalındaki eşiğin üzerindedir. Uygun bir negatif numunenin floresan eğrileri, hex kanalında kabul edilebilir aralıktaki örnek sinyalini gösterir.Negatif kontrol sinyali FAM kanalındaki eşiğin altındadır. Diğer taraftan, uygun olmayan bir numunenin eğrileri, HEX kanalında kabul edilebilir aralıkta olmayan numune sinyalini gösterir. Büyük ihtimalle olası bir inhibisyona bağlı.Bu nedenle, bu örnek çıkarma başlayarak, tekrarlanmalıdır. Yazılım analizi çıktı tablosu, reaksiyon kontrolleri, klinik numuneler ve işletme kalite kontrol sonuçları için FL-DNA konsantrasyonu açısından hem A hem de Mix B verilerini gösterir. Dört numaralı örnek, kalite denetimini geçemediği için herhangi bir sonuç alamamış.Tekrarlanmalı ve yeniden analiz edilmelidir. Lütfen standart eğriye iniş li kontrol için DNA'yı yeniden askıya alırken dikkatli olun. Ve farklı NA'ları 8-iyi şeritlere dağıtırken, hem de sonuç analizi bölümünde moleküler algılama sırasında.Kolorektal neoplastik lezyonların daha iyi değerlendirilmesi için bu yöntem iFOBT testi ile birlikte yapılmalı, aynı dışkı örneği ile yapılmalıdır.

evaluation-colorectal-cancer-risk-prevalence-stool-dna-integrity

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Pms2 ve / veya bütün kript olarak ERCC1 Küçültülmüş / eksik ifade kolon adenokarsinomların, muhtemelen yüksek değişkenliktir ve kanser ilerleme alanı defekti temelinde her iki tarafında 10 cm içinde sık rastlanan bir olaydır. Ku86 veya CcOI eksikliği, bu alanı defektleri çok daha az sık.

Eksik Pms2 ERCC1, Ku86 Kolon Kanseri ilerleme sırasında Alan Kusur CcOI

Kolorektal kanser (CRC) uygulanabilir tek bir hücre üretmek için, daha sonra yüzey antijenleri (DotScan ÇHS mikroarray) tanıyan özelleştirilmiş antikor mikrodizinlerinde yakalanır ayrıştırılmasıyla için bir prosedür nitelendirdi. Mikroarray bağlı hücrelerin alt popülasyonlarda floresan boya ile monoklonal antikorlar kullanılarak floresans çoklama profilli olabilir.

Kolorektal Kanser Hücre Yüzey Protein Profil Antikor Mikroarray ve Floresans Multiplexing

Bu videoda, kolon tümörü taşıyan farelerin dışkı örneklerinden alınan DNA izolasyon protokolü açıklanmaktadır. Ekstrakte edilen DNA, PCR kullanılarak amplifiye edilir ve ürün, manyetik boncuk bazlı bir yaklaşım kullanılarak daha da temizlenir. Bu yöntem, çevresel zenginleştirmenin kolon mikrobiyotası ve hayvan ölümleri üzerindeki etkisini belirlemek için kullanılabilir.

Dışkı Mikrobiyal DNA İzolasyonu: Murin Tümör Modelinde Çevresel Zenginleştirmenin Mikrobiyom Çeşitliliği Üzerine Etkisinin İncelenmesi

Farelerin potansiyel DNA zarar verici ajanlara maruz kalmasından sonra somatik kolonik kök hücre mutasyonlarının tekrarlanabilir ölçümü için önemli gelişmeler bildiriyoruz.

Kolon Kök Hücre Mutasyonların Kantitasyonu

İdrar örneklerinin hücresiz süpernatan fraksiyonunda DNA bütünlüğünü analiz etmek için bir yöntem önerilmiştir. Yöntem, ürolojik malignitelerin erken teşhisi için uygundur ve mesane kanserinin erken teşhisi için doğruluğu kanıtlanmıştır.

İdrar Örneklerinin Hücre-Free DNA Bütünlüğü Analizi

Çevre zenginleştirme (EE) yaşam tarzı, stres ve hastalık arasındaki bağlantıları altında yatan mekanizmaları ortaya çıkarmak için kullanılan bir hayvan konut ortamdır. Bu iletişim kuralı özellikle hayvan mortalite etkisi olabilir microbiota biyolojik çeşitlilik değişiklikleri tanımlamak için iki nokta üst üste tumorigenesis ve EE bir fare modelini kullanan bir yordam açıklanır.

Çevre zenginleştirme etkileri kolon Microbiome biyolojik çeşitliliğin bir fare kolon tümörü modeli tanımlamak için bir yöntem

Dijital polimeraz zincir tepkimesi (PCR) Tek nükleotid türevleri ve DNA kopyalama numara türevleri yüksek-duyarlı tespiti için yararlı bir araçtır. Burada, biz insan genomu digital PCR ile tüp içinde çip biçimini kullanarak nadir versiyonlarında ölçmek için kritik noktalar göstermek.

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

Burada sunulan kolorektal HT29 hücrelerinden elde edilen kurulan kanser kök benzeri hücreleri koruyan aşırı ifade sürücü genleri keşfetmek için bir protokoldür. RNAseq mevcut biyoinformatik ile araştırılmış ve hedeflenen tümör hücrelerinin hayatta kalma dahil potansiyel bir mekanizma açıklığa kavuşturmak için gen ekspresyonu ağları ekran.

Kolorektal HT29 türetilmiş Kanser Kök Benzeri Tümörkürelerde Sürücü Genlerinin Keşfi

İnsan dışkı örneklerinden yüksek kaliteli viral boyutlu fraksiyon metagenomları (viromlar) üretmek için esnek bir protokol sunuyoruz. Başlangıçta toprak viromikleri için geliştirilen bu protokol, burada dışkı örneklerine başarıyla uygulanarak insan bağırsak virosferinin sağlam bir şekilde karakterizasyonu sağlanmıştır.

İnsan Dışkısı Örnekleri için DNA Viral Boyut Fraksiyonu Metagenomikleri

Farelerin çekumuna tümör hücreleri veya organoidler enjekte edilerek ortotopik kolorektal tümörlerin oluşumunu ve ardından bu modelden dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'lerin) izole edilmesini açıklıyoruz.

Kolorektal kanserli bir Ortotopik Fare Modelinde Dolaşan Tümör Hücrelerinin İzolasyonu

Keşfedin, dışkı DNA bütünlüğü analiziyle kolorektal kanser riskini ve neoplastik lezyon varlığını invaziv olmayan yöntemle değerlendirin. FL-DNA kiti mevcut tarama testleriyle birlikte kullanıldığında kanser tahmin doğruluğunu artırır.

Kolorektal Kanser Riski ve Yaygınlığının Dışkı DNA Bütünlüğü Saptanması ile Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet