Tau Aggregation Lentiviral kullanarak eğitim için bir In vitro modeli-ınsan nöronların aracılı dönüştürücü
23 Mayıs 2019
Bu protokol, insan nöronal kültürlerin mutant insan Tau için lentiviral yapıları ile dönüştürücü olduğu bir prosedür ayrıntıları. Traned kültürler Tau toplamları ve ilişkili patolojileri görüntüler.
Bu protokolde insan tauopatisinin in vitro modelini ayrıntılarıyla anlatacağız. Bu yöntem ilaç taraması ve hastalık mekanizması çalışmaları için yararlı olabilecek bir malzeme ihtiyacını karşılar. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücre kültürü paradigmasının hayvan çalışmalarına göre tau toksisitesi ve potansiyel tau terapötiklerinin daha hızlı değerlendirilmesine olanak sağlamasıdır.
Bir mililitrelik aliquots olun ve eksi 20 veya eksi 70 santigrat derece onları saklayın. Daha sonra, mililitre başına 10 mikrogram konsantrasyonda steril PBS'deki temel fibroblast büyüme faktörünün yeniden oluşturulun. 10 mikrolitrelik aliquots olun ve dört santigrat derece onları saklayın.
Sonra glutamin ile DMEM-F12 yeni bir açılmamış 500 mililitrelik şişe yola. Nöral kök hücre ortamı hazırlamak için 10 mililitre B27, beş mililitre N2 ve beş mililitre penisilin-streptomisin ekleyin. Konik bir tüp içine NSC medya 50 mililitre yerleştirin ve hazırlanan bFGF 10 mikrolitre ekleyin.
Bu NSC artı bFGF ortamını dört santigrat derecede saklayın. İlk olarak, dondurucudan hücre kültürü plakaları için dondurulmuş bazal membran matris kaplama bir aliquot çıkarın ve dört derece santigrat de çözülmesine izin verir. Penisilin-streptomisin içeren dmem-F12 media beş mililitre çözülmüş bodrum membran matris kaplama 385 mikrolitre ekleyin.
Hücreler dondurulmuş NSC stoklarından çözülürse, dondurucudan bir şişe dondurulmuş hücre alın ve şişeyi suda ileri geri hareket ettirerek 37 dereceye ısıtılan bir su banyosunda ısıtın. Bundan sonra,% 70 etanol ile şişe sprey. Daha sonra bir hücre kültürü başlığı altında, penisilin-streptomisin içeren DMEM-F12 medya yaklaşık 10 mililitre hücreleri aktarın.
Oda sıcaklığında santrifüj 1,000 kez g beş dakika. Daha sonra ortamı aspire edin ve NSC medyadaki hücreleri yeniden askıya alın. Kullanılan hücre kültürü damarı için uygun tohumlama yoğunluğunu elde etmek için NSC ortamdaki hücreleri seyreltin.
NSC ortamlarında asma yeterli hücre ekleyin bodrum membran matris kaplı kültür yemekleri tohum. Hücreleri %5 karbondioksitle %75 ila %80 oranında büyütene kadar 37 derecede büyütün ve her gün medyayı değiştirmeyi unutmayın. Lentivirüs ile nöronlar transduce için, hücre başına 340, 000 geçirilebilir birimleri bir titer sayısı kullanın.
Hücre kültürü medyasındaki geçirilebilir birimleri gerekli konsantrasyona seyreltin ve hücrelere ekleyin. Lentivirüs ekledikten iki gün sonra, bFGF içermeyen taze medya ile bir kez hücreleri yıkayın. BFGF olmadan medyada %5 karbondioksit ile hücreleri 37 derecede 37 derecede ekmeye devam edin.
Transdüksiyondan sonra hücreleri yaklaşık sekiz hafta boyunca saklar, hücre kültürü ortamını her gün değiştirdiğinden emin olun. Hücreleri rutin olarak görselleştirmek ve canlılığı sağlamak için bir ışık mikroskobu kullanın. Transdüksiyondan sonra, kültürü steril tutmak için üzerlerindeki kapağı tutmak için kuvözden kültür yemeklerini çıkarın.
514 nanometre uyarma ve 527 nanometre emisyon filtresi ile 10X hedefi altında hücreleri görselleştirmek için canlı hücre görüntüleme yeteneğine sahip bir floresan mikroskop kullanın. Bu çalışmada tau-RDLM-YFP lentivirüs ile transen nöronlar floresan YFP ile etiketlenir. RDLM'den transeksiyonlu kültürlerde transdüksiyon sonrası agregalar görüldüğü görülmektedir.
Bu inkiçeriler tioflavin için pozitif leke. Nöronal farklılaşma kültürlerde nöron spesifik belirteç beta-tubulin III immünetiketleme ile doğrulanır. Floresan etiketli sekonder antikorların YFP ile örtüşmeyen bir uyarma emisyon spektrumuna sahip olması gerektiğini unutmamak gerekir.
Sarı floresan tau agregaları boyama yokluğunda görünür olmasına rağmen, tioflavin de floresan sinyal tau değil, hücresel enkaz olduğunu doğrulamak için görüntüleme için kullanılmalıdır. Tau aşırı ekspres hücreleri nesil sonra, nöronal sağlık ve tau agregasyonu değerlendirmeler bir dizi yapılabilir. Örneğin, bu hücrelerin aksonal dejenerasyon gösterdiğini bulduk.
Hücre kültürü çalışmalarına ek olarak, patojenite ekzozomal türetilmiş tau incelemek için bu yöntemi kullandık.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, mutant insan tau kodlayan lentiviral konstrüktlar ile nöronal kültürlerin transdüksiyonu yoluyla, insan tauopatisi için in vitro bir model oluşturma protokolünü özetlemektedir. Bu model, geleneksel hayvan çalışmalarına kıyasla tau toksisitesinin ve potansiyel terapötiklerin hızlı bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Tauopatiler
Arka Plan
- İnsan tauopatileri, tau protein agregasyonu ile karakterize edilen nörodejeneratif hastalıklardır.
- Geleneksel modeller genellikle uzun zaman çizelgeleri içerir ve her zaman insan patolojisini yansıtmaz.
- Bu protokol, hücre kültürleri aracılığıyla daha hızlı ve daha spesifik bir değerlendirme paradigması sunmaktadır.
- Bu yöntem, tau protein etkileşimlerini incelemede hayvan modellerinin sınırlılıklarını gidermektedir.
Çalışmanın Amacı
- Tau patolojisini incelemek için insan nöronal kültür modeli geliştirmek.
- Tau ile ilişkili hastalıklar için ilaç taramasına yardımcı olmak.
- Tau'nun nörodejenerasyondaki rolünün anlaşılmasını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kullanılan platform, bir insan nöronal hücre kültürü sistemidir.
- Biyolojik model, lentiviral konstrüktler kullanılarak mutant tau ile transduksiyonu yapılmış insan nöronlarından oluşmaktadır.
- Metinde herhangi bir multiomik iş akışından bahsedilmemektedir.
- Hücreler, düzenli ortam değişimleri ile transduksiyondan sonra yaklaşık sekiz hafta boyunca muhafaza edilir.
- Tau agregasyonunu görselleştirmek için ışık ve floresan mikroskobu kullanılır.
Ana Sonuçlar
- Transdükte edilen kültürler, tiyoflavin boyaması ile doğrulanan tau agregatları sergilemiştir.
- Nöronal diferansiyasyon, beta-tubulin III immunolabeling ile valide edilmiştir.
- Gözlemler, tau aşırı ekspresyonu yapan hücrelerde aksonal dejenerasyon olduğunu göstermiştir.
- Çalışma, tau ile ilişkili nöronal sağlığın değerlendirilmesinde bu modelin kullanımının uygulanabilirliğini vurgulamaktadır.
Sonuçlar
- Bu çalışma, tauopatileri araştırmak ve tau toksisitesini değerlendirmek için güvenilir bir in vitro yaklaşım sunmaktadır.
- Geliştirilen model, potansiyel tau terapötiklerinin test edilmesi için yeni yollar açmaktadır.
- Elde edilen bulgular, tau agregasyonu ve nörodejenerasyonun arkasındaki mekanizmaların anlaşılmasını geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörle İlgili Yönetici Özeti
Bu in vitro insan nöron modeli, tau agregasyonu ve nörotoksisitenin hızlı değerlendirmesi için insanla uyumlu bir sistem sağlayarak tauopati araştırmalarındaki kritik bir boşluğu doldurmaktadır. Model, tau hedefli terapötikler için erken aşama hedef doğrulama ve mekanistik risk azaltma süreçlerine olanak tanıyarak, uzun süreli hayvan çalışmalarına olan bağımlılığı azaltır. Bu model, nörodejeneratif hastalık programları için öncü bileşiklerin belirlenmesinde ve preklinik elemelerde öngörüsel güveni destekler.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Terapötik hedefleri doğrulamak ve agregasyon mekanizmalarını aydınlatmak için insan nöronlarındaki patojenik tau mutantlarını inceler.
- Operasyonel Değer: Aksonal uzunluk ve lizozomal hacim değişiklikleri gibi kantitatif okumalar aracılığıyla fonksiyonel hedef doğrulama imkanı sağlar.
- Öngörücü Değer: İnsana özgü tau patolojisini ve toksisite profillerini modelleyerek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Bileşik taraması için YFP ve tiyoflavin boyamasıyla tespit edilebilen, standartlaştırılmış, floresan işaretli tau agregatları üretir.
- Kantitatif Çıktılar: Doz-yanıt analizlerinde bağımlı değişkenler olarak agregasyon yükünün ve nörotoksik fenotiplerin ölçülmesine olanak tanır.
- Ölçeklenebilirlik: Lentiviral transdüksiyon, yüksek içerikli tarama için hastalıkla ilişkili nöronal kültürlerin tutarlı ve ölçeklenebilir şekilde hazırlanmasını sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgili Önem: Alzheimer hastalığının ve ilgili tauopatilerin erken evrelerini modellemek için patojenik tau mutantları eksprese eden insan nöronlarını kullanır.
- Translasyonel Süreklilik: Etki mekanizması çalışmaları için insani bir hücresel sistem sağlayarak keşif ve preklinik çalışmalar arasında köprü kurar.
- Riski Ayarlanmış Kararlar: Tiyoflavin-pozitif agregatlar ve nörit dejenerasyonu sergileyen bir sistemde, tau hedefli bileşiklerin değerlendirilmesine olanak tanır.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Model; hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik etkinlik testlerine kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, tau modülatörleri için tekrarlanan tasarım-üretim-test döngülerini desteklemektedir.
- Keşif Biyolojisi: Agregasyon ve toksisite belirteçlerinin canlı hücre görüntülemesi aracılığıyla tau mutantlarının hipotez testlerini ve yolak aydınlatmasını destekler.
- Tarama: Bileşik kütüphanesi değerlendirmesi için standartlaştırılmış transdüksiyon ve agregasyon fenotiplerine sahip, analize hazır kültürler sağlar.
- Analitik: İstatistiksel karşılaştırma için floresan agregat yükü, aksonal uzunluk ve lizozomal hacim dahil olmak üzere kantitatif bağımlı değişkenler sunar.
- Translasyonel Araştırma: İndirgemeci bir sistemde insan tau patolojisini modelleyerek preklinik doğrulamaya bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Projeler genelinde birden fazla tau konstrüktünün, inhibitörün veya gen düzenleme yaklaşımının test edilmesi için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Patojenik mutantlarla insan tauopatisini modelleyerek ve agregatları tiyoflavin pozitifliği ile doğrulayarak hedef güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış besiyerleri, transdüksiyon protokolleri ve sekiz haftalık kültür zaman çizelgesi ile maliyet etkin ve tekrarlanabilir bir sistem sunar.
- Stratejik Değer: Erken dönem, insanla ilişkili nörotoksisite ve etkinlik verileri sağlayarak go/no-go (devam/durdur) kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Agregasyon ve nörit dejenerasyonu okumalarına dayalı olarak tau terapötiklerinin riskle uyumlu şekilde ilerletilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Nöronal hücre kültürü, lentiviral transdüksiyon ve floresan mikroskopi konularında uzmanlık gerektirir.
- İnsan nöral kök hücrelerine, lentiviral vektörlere ve uygun filtre setlerine sahip görüntüleme ekipmanlarına erişime bağlıdır.
- Transdüksiyon titresinin (340,000 TU/cell) ve besiyeri formülasyonlarının merkezler arasında standardize edilmesini gerektirir.
- tau-RDLM-YFP dışındaki farklı tau mutantları veya raporlayıcı konstrüktler için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Sekiz haftalık kültür süresi ve agregat oluşum verimliliğindeki potansiyel değişkenliklerle sınırlıdır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Title
0:27
Preparation of Media and Reagents
1:41
Culturing Human Neural Stem Cells
3:12
Transduction and Maintenance of Neuronal Cultures
4:05
Live-cell Imaging
4:32
Results: Analysis of Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons
5:22
Conclusion
