Name: Tau Aggregation Lentiviral kullanarak eğitim için bir In vitro modeli-ınsan nöronların aracılı dönüştürücü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Öğrenin, insan nöronlarında lentiviral aracılı mutant tau transdüksiyonu ile tauopati in vitro modeli oluşturmayı. Bu yöntem, tau toksisitesi ve potansiyel tedavilerin hızlı değerlendirilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Tau yapıları sağlamak için PHF-1 ve CP13 antikorları ve Teksas Üniversitesi, Southwestern, Dr Marc Diamond tedarik için Albert Einstein Koleji tıp Dr Peter Davies teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma S.H.Y. için Alzheimer Derneği (NIRG-14-322164) ve California Enstitüsü rejeneratif tıp (TB1-01193) gelen hibe tarafından desteklenen oldu PR

1. medya ve Reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>Bodrum membran matriks kaplamasını 4 °C ' de kültür plakaları için çözün (Bodrum membran matrisinin ısınmasına izin verme ya da katılaşma olacaktır). 1 ml plakaya yapın ve onları-20 °c veya-70 °c ' de saklayın.</li>
	<li>10 μg/mL 'de steril fosfat-tamponlu tuz (PBS) içinde temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) yeniden oluşturur ve 10 μL aliquots yapın. 4 °C ' de saklayın.</li>
	<li>Yeni, açılmamış, 500 mL 'Lik bir şişe glutamin ile DMEM/F12, B27 (10 mL), N2 (5 mL) ve penisilin-streptomisin (5 mL) ekleyin. Bu nöral kök hücre (NSC) ortamının 50 mL 'yi konik bir tüpte yerleştirin ve 10 μL 10 μg/μL (2 μg/mL Final) bFGF ekleyin. NSC (+) bFGF medyasını 4 °C ' de saklayın.</li>
	<li>(-) BFGF medya yapmak için, adım 1,3 açıklandığı gibi aynı tarifi kullanın ama bFGF eklemeyin. Bu medya, NSCs 'leri nöronlara ayırmak ve farklılaşma sonrası nöronal kültürlerin korunması için kullanılacaktır.</li>
</ol>2. lentiviral yapıları
Not: Lentiviral yapıları ile çalışmaya başlamadan önce, laboratuar Biyogüvenlik seviye-2 (BSL-2) aracıları kullanmak için onaylanmış olduğundan emin olun. Ayrıca lentiviral vektörler ile çalışırken BSL-2 kültür davlumbaz, kişisel koruyucu ekipman (PPE) ve bertaraf yöntemleri kullanılmalıdır.
<ol><li>Tau yapıları tercih edilen bir kaynaktan Lentivirus paketlenmiş elde (bkz Sanders ve al.10 yapı bilgileri için).</li>
</ol>3. Insan nöral kök hücreleri kültür
Not: NSCs genellikle 100000 – 150,000 hücrelerde/cm2 ' de dikilir ve piyasadaki en çok kullanılabilir nscs 'ler 1 x 106 hücre/şişe olarak satılır. Bu protokol 10 cm hücre kültürü yemekleri için optimize edilmiştir (yemek diğer boyutlarda kullanılabilir olsa da); Bu nedenle, ticari olarak kullanılabilen NSCs kullanılırsa, NSCs 'nin 10 cm 'lik yemeklerden yeterli hücrelere neden olması için ilk olarak altı kuyu yemekleriyle kültürleşmiş olması gerekebilir. Bu protokol alternatif olarak çeşitli hücre kültürü çanak boyutları için adapte edilebilir (ancak bu protokoller11,12başka bir yerde kullanılabilir olduğu için geçiş nscs için yönergeler içermez).
<ol><li>
Hücre kültürü plakalarının hazırlanması için, hücre kültürü plakaları için dondurulmuş Bodrum membran matris kaplama bir kısım kaldırmak ve 4 °c ' de çözülmesine izin (aliquots 4 °c gece hücrelerden önce bir gecede yerleştirilebilir). 385 μL Bodrum membran matris kaplama 5 mL DMEM/F12 medya + penisilin-streptomisin ekleyin. Not: 5 ml DMEM/F12 medya + penisilin-streptomisin tek bir 10 cm çanak (bu Bodrum membran matris kaplama çözeltisi 1 ml kat için yeterli bir altı iyi çanak bir kat için yeterlidir). Alternatif olarak, hücreler sabit ve immunost, ya da thioflavin için lekeli iseniz, 24-Well kültür yemekleri cam Cover, kültür hücreleri.<ol>
<li>Medyayı ve matris kaplamasını önce ve kültür yemeklerine eklerken soğuk tutun. Bodrum membran matris kaplama kültür yemekleri ekleyin ve 1 h için (37 °C ' de) bir kuluçk yemek yerleştirin. Optimum kaplama için, Bodrum membran matrisini 1 saatten fazla veya daha az süre boyunca inkük etmeyin. 1 saat sonra, hücre kültürlerinden yemeklerden Bodrum membran matris kaplama Aspire. Bunun, NSCs 'nin kaplammaya hazır olması ile çakıştığınızdan emin olun. Not: Hücreler dondurulmuş stokları çözülmüş değilseniz, adım 3,2 atlayın ve adım 3,3 ile devam edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eğer hücreler dondurulmuş NSC stokları çözülür, dondurulmuş hücreler bir şişe almak ve bir su banyosunun ısıtmak 37 °C ısınarak su geri ve ileri şişe hareket ettirerek. Bir kez çözülmüş,% 70 etanol ile şişe sprey ve bir hücre kültürü kaputu içine yerleştirin. Hücreleri ~ 10 ml dmem/F12 + penisilin-streptomisin medyaya aktarın ve 1.000 x g 'de oda sıcaklığında tüpü 5 dakika boyunca santrifüjün. medyayı aspirate ve NSC medyadaki hücreleri pelletini.</li>
	<li>Kullanılan hücre kültürü gemisi için uygun tohumlama yoğunluğu elde etmek için NSC medyadaki hücreleri seyreltin. Not: Örneğin, NSCs altı-kuyu plakası üzerine kaplama iseniz-bir iyi altı-iyi kültür çanak bir yüzey alanı vardır 9 cm2— 900.000 için 1.350.000 hücreler tohum için gereklidir. Yani, 1.000.000 hücreleri içeren bir şişe medya 2 mL resuspended olabilir ve altı-iyi yemek tek bir kuyu ekledi.</li>
	<li>Bodrum membran matris kaplı kültür yemekleri (100.000 hücreler/cm2) tohum ve her gün medya değiştirmek (dondurulmuş bir stok kullanıyorsanız, ortam kaplama sonra gün ve sonra her gün değiştirmek) NSC medyada askıya yeterli hücre ekleyin. Hücreleri% 75 –% 80 konfluent olana kadar büyütün. Not: Hücreleri büyük olasılıkla ulaşacaktır 75% – 80% konfluence kısa bir süre sonra kaplama, ancak bu dondurulmuş stokları kullanılırsa daha uzun sürebilir.</li>
	<li>NSCs% 75 –% 80 konfluent olduktan sonra, NSC (+) bFGF medyasını kaldırarak ve NSC (-) bFGF medyasını değiştirerek nöronal farklılaşma başlar. Bu medyada hücreleri Kültür (her gün ortam değiştirme) en az 4 hafta. Not: Hücreler bFGF çekilmesi aşağıdaki birkaç gün bölmek devam edecektir; Bu nedenle, hücreler% 90-100 konfluence ulaşabilir. 4 hafta boyunca kültür sonrası, hücreler nöronal bir kader elde edecek ve lentivirüs tedavisi için hazır olacak.</li>
</ol>4. nöronal kültürlerin iletim ve Bakımı
<ol><li>Lentivirus ile nöronlar transduce için, 3,4 x 105 transkif birimler/hücre (bir 100% confluent 10 cm çanak ~ 10.000.000 nöronlar içerir) bir titresi sayısı kullanın. Hücre kültürü medyasında gerekli konsantrasyona dönüştürücü birimleri seyreltin ve hücrelere ekleyin (hücre kültürü çanak için medya normal hacmi kullanın). Lentivirus ekledikten iki gün sonra, hücreler 1x ile taze (-) bFGF medya (Lentivirus olmadan) yıkayın ve (-) bFGF medya her zamanki gibi kültür devam.</li>
	<li>Post-lentiviral tedavi için, hücre kültürü medya ([-] bFGF medya) her gün değiştirerek transed nöronlar yem. Hücreleri korumak için ~ 8 hafta sonra iletim. Işlilik sağlamak için rutin bir ışık mikroskop altında hücreleri görselleştirin. Not: Sparseness veya dendritik kırılma hücreleri artık uygulanabilir olduğunu işaretler.</li>
</ol>5. hücrelerin görüntülenmesi
<ol><li>
Canlı hücre görüntüleme
	<ol>
<li>Dönüştürücü (Lentivirus eklendikten sonra 4 gün) sonra, canlı hücre görüntüleme yeteneğine sahip bir floresan mikroskop altında YFP sinyalleri gözlemlemek. İnkükalörün hücre kültürü yemekleri alın ve kültür kuyuları kültür yemekleri üstünde kapak tutarak steril kalmasını sağlayın. ~ 514 nm bir uyarma dalga boyu ve ~ 527 nm Emisyon filtresi ile 10X objektif kullanarak hücreleri görselleştirin. Not: Toplamları genellikle transkual hücre kültürlerinde görülebilir 6 – 8 Lentivirus uygulamadan sonra gün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sabit hücreli boyama (β-tubulin III etiketleme ve Tiyoflavin boyama)
	<ol>
<li>Paraformaldehit hücreleri düzeltmek için (PFA), cam Cover, üzerinde yetiştirilen traned nöronların kültür medyasını çıkarın. Hücreleri 1x PBS ile yıkayın, yıkamayı çıkarın ve% 4 PFA (PBS 'de seyreltilmiş) ile Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 300 – 500 μL (24-kuyu plakaları kullanıyorsanız) ekleyin. PFA çıkarın ve PBS ile Cover, 2x yıkayın.</li>
		<li>PBS,% 3 Sığır serum albümin (BSA) ve 0,3% Triton X-100 içeren bir engelleme çözümü hazırlayın. Kuyulara çözüm için 300 – 500 μL ekleyin ve 4 °C ' de 2 h için coverları inküt. 2 saat sonra, engelleme solüsyonundaki primer antikorları (1:500 antikor konsantrasyonunda) seyreltin ve her bir kuyu için 300 – 500 μL primer antikor çözeltisi ekleyin. Tabağı 4 °C ' de bir gecede sallanan veya dönen bir platforma (düşük hızda) yerleştirin.</li>
		<li>Ertesi gün, primer antikor çözeltisi çıkarın ve PBS ile 5 dakika her biri için 3x Cover, yıkayın. Bir engelleme tampon solüsyonundaki ikincil antikorları seyreltir (1:1000 konsantrasyonunda) ve her bir kuyu için ikincil antikor çözeltisi ekleyin. YFP sinyali ile örtüşmeyen bir floresan etiketi kullanarak uygun ikincil antikor seçin (örneğin, CY-3). Hücreleri, sallanan veya dönen bir platformda 2 saat boyunca oda sıcaklığında kulyur. 2 saat sonra, ikincil antikor çözeltisi çıkarın ve PBS ile her biri için 10 dk Cover, 3x yıkayın.</li>
		<li>10 dakika boyunca çift deiyonize suda (DDW) coverfları yıkayın. DDW 'yi çıkarın ve 300 μL/kuyu% 0,015% Tiyoflavin-S% 50 etanol içinde seyreltilmiş 10 dk. Tiyoflavin solüsyonu çıkarın ve 4 dk,% 50 Etanol, bir 4 dk takip ile her biri için 2x Cover % 30 etanol ile 5 dk her biri için% 30 etanol ve iki yıkaması ile yıkayın. Montajdan önce 1 adet DDW ile coverfiş yıkayın. Not: 5.2.4 adımda açıklanan Tiyoflavin boyama isteğe bağlıdır.</li>
		<li>Coverfaları cam slaytlara takmak için, cam kaydırağın "+" tarafına tek bir damla montaj ortamı yerleştirin. İyi cam lamel magazini içeren tüm sıvı çıkarın ve ince forseps kullanarak, dikkatle cam lamel magazini kaldırmak, hangi tarafın kültürlü hücrelere sahip takip tutmak.</li>
		<li>Herhangi bir aşırı nemi kaldırmak için lamel magazini kenarını bir kimwipe 'e hafifçe bastırın. Hala ince forseps ile lamel magazini sürükleyici, montaj ortamına lamel magazini (hücre tarafı montaj medya damlası doğru bakacak şekilde) kenarına dokunun, ve daha sonra, hafifçe montaj ortamına lamel magazini yerleştirin (montaj içine kültürlü hücreleri yerleştirerek Medya ve lamel magazini ve cam slayt arasında onları sandviç). Montaj ortamının görüntüleme işleminden önce 30 dakika boyunca sertleşmesine izin verin. Slaytlar, gelecekteki kullanım için-20 °C ' de depolanabilir.</li>
		<li>Görüntü hücreleri floresan mikroskop ve uygun uyarma/emisyon Spectra kullanarak (YFP = ~ 514/527 Nm, Cy-3 = ~ 555/568 Nm, ve Tiyoflavin S = ~ 390/426 Nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Opsiyonel Yöntemler
<ol><li>Her 2 günde bir kültürler tarafından yayımlanan Tau türlerinin gelecekteki analizleri için kültürlerden oluşan ortamlar toplayın ve-20 °C ' de saklayın.</li>
</ol>

<ol><li>Rojas, J. C., Boxer, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+disease+in+2015%3A+Targeting+tauopathies+for+therapeutic+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative disease in 2015: Targeting tauopathies for therapeutic translation.</a> Nature Reviews Neurology. 12 (2), 74-76 (2016).</li>
<li>Kadavath, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+stabilizes+microtubules+by+binding+at+the+interface+between+tubulin+heterodimers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).</li>
<li>Wang, Y., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+in+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Tau in physiology and pathology.</a> Nature Reviews Neurology. 17 (1), 5-21 (2016).</li>
<li>Gomez-Ramos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+consequences+of+muscarinic+receptor+activation+by+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Characteristics and consequences of muscarinic receptor activation by tau protein.</a> European Neuropsychopharmacology. 19 (10), 708-717 (2009).</li>
<li>Warmus, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau-mediated+NMDA+receptor+impairment+underlies+dysfunction+of+a+selectively+vulnerable+network+in+a+mouse+model+of+frontotemporal+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tau-mediated NMDA receptor impairment underlies dysfunction of a selectively vulnerable network in a mouse model of frontotemporal dementia.</a> Journal of Neuroscience. 34 (49), 16482-16495 (2014).</li>
<li>DeVos, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+reduction+in+the+presence+of+amyloid-beta+prevents+tau+pathology+and+neuronal+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Tau reduction in the presence of amyloid-beta prevents tau pathology and neuronal death in vivo.</a> Brain. 141 (7), 2194-2212 (2018).</li>
<li>Cheng, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+reduction+diminishes+spatial+learning+and+memory+deficits+after+mild+repetitive+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Tau reduction diminishes spatial learning and memory deficits after mild repetitive traumatic brain injury in mice.</a> PLOS ONE. 9 (12), e115765(2014).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+human+mutant+tau+aggregation+by+knocking+out+murine+tau+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Accelerated human mutant tau aggregation by knocking out murine tau in a transgenic mouse model.</a> The American Journal of Pathology. 178 (2), 803-816 (2011).</li>
<li>Reilly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+human+neuronal+tau+model+exhibiting+neurofibrillary+tangles+and+transcellular+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Novel human neuronal tau model exhibiting neurofibrillary tangles and transcellular propagation.</a> Neurobiology of Disease. 106, 222-234 (2017).</li>
<li>Kfoury, N., Holmes, B. B., Jiang, H., Holtzman, D. M., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-cellular+Propagation+of+Tau+Aggregation+by+Fibrillar+Species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Trans-cellular Propagation of Tau Aggregation by Fibrillar Species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (23), 19440-19451 (2012).</li>
<li>Yuan, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-surface+marker+signatures+for+the+isolation+of+neural+stem+cells%2C+glia+and+neurons+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells.</a> PLOS ONE. 6 (3), e17540(2011).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Passaging human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e263(2007).</li>
<li>Lathuiliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motifs+in+the+tau+protein+that+control+binding+to+microtubules+and+aggregation+determine+pathological+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Motifs in the tau protein that control binding to microtubules and aggregation determine pathological effects.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13556(2017).</li>
<li>Asai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+microglia+and+inhibition+of+exosome+synthesis+halt+tau+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Depletion of microglia and inhibition of exosome synthesis halt tau propagation.</a> Nature Neuroscience. 18 (11), 1584-1593 (2015).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Bu protokol, gümüş-leke-pozitif agregalar ve thioflavin-pozitif neurofibriller Tangles (NFTs) sergiler insan tauopati bir in vitro model nesil açıklar. Dahası, dönüştürücü hücreler, morfolojik kusurları, azaltılmış synaptogenez ve artmış lizozomal hacmi gibi Tau kaynaklı patolojileri görüntüler. Bu protokolün ana avantajı, ilaç tarama çalışmaları için kullanılabilecek, hem de Tau toksisitesi analizi için kullanılan nöronal tauopati erişilebilir ve uygun maliyetli bir model sağlar olmasıdır. İnsan tauopati hücre hatları h...

Microtubule ilişkili protein Tau patolojik toplama birçok nörodejeneratif hastalıkların tanımlama özelliğidir, ad dahil, Frontotemporal Demans (FTD), Pick hastalığı, ve Progressive supranucleer palsi (PSP)1. Hastalıklı olmayan bir durumda, Tau, nöronal akkıslar2' de microtubül filayonlarını bağlar ve stabilize eder. Ancak, Tau hastalığı ilişkili hiperfosforilasyon Tau toplama teşvik, microtubules ayrışma, ve nöronal toksisite3. Toplanan Tau toksik etkileri kolinerjik4 ve glutamaterjik reseptörlerin anormal aktivasyonu içerebilir5 hücre içi kalsiyum disregülasyon sonucu, ve sonunda, hücrenin ölümü. Hayvan modellerinde, beyin Tau azalma AD fareler6 ve tekrarlayan hafif travmatik beyin hasarı fare modellerinde patolojisini geliştirir7.
Montaj kanıtların yapısı ve bağlama benzeşimi fare türevi Tau insan türetilen Tau farklıdır ve bu fare Tau insan tauopathies8modelleme için uygun olmadığını gösterir. Ancak, insan hücresi tauopati modelleri yaygın olarak satışa sunulmaz. Bu çalışmanın genel hedefi, insan nöronlarının mutant insan Tau yapıları içeren lentiviral türevi vektörler ile dönüştürücü olduğu Tau toplama bir in vitro modeli açıklamak için9. Tau toplama neden lentiviral yapıları, P301L ve V337M mutasyonlar bir YFP Reporter (Tau-WT-YFP) için kullanılan Wild-Type (WT) Tau tekrarlama etki alanı için kod yapıları sırasında erimiş Tau Yinele etki alanı için ek olarak bir rıld (Tau-rdlm-YFP). Nöronal kültürler bu yöntemi kullanarak transribe yaklaşık dokuz kat daha fazla Tau nondönüştürüclü kültürler daha. Tau-RDLM-YFP-ve Tau-WT-YFP-traned hücreler arasında aşırı ifade edilen Tau ifadesinin miktarı kabaca eşit olsa da, yalnızca Tau-RDLM-YFP görüntü toplamları ile dönüştürücüye gelen nöronlar. Kültürler Tau-rdlm-YFP ile traned, Tiyoflavin için pozitif leke ve akal uzunlukta ve sinaptik yoğunlukta görüntü indirimleri. Bu nedenle, bu hücresel model in vitro Tau toplama okumak için yararlı bir araç olabilir.

<table><tbody><tr><td>10 cm kültür kapları</td><td>Thermofisher</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tüpler</td><td>Biopioneer</td><td>CNT-15</td><td></td></tr><tr><td>%16 paraformaldehit</td><td>Thermofisher</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu kültür plakaları</td><td>Thermofisher</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tüpler</td><td>Biopioneer</td><td>CNT-50</td><td></td></tr><tr><td>sprey şişesinde</td> <td>%70 etanolÇeşitli kaynaklar</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Temel membran matrisi (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Temel FGF</td><td>Biopioneer</td><td>HRP-0011</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü inkübatörü</td><td>Çeşitli kaynaklar</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Çeşitli kaynaklar</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 glutamin içeren kültür ortamı</td><td>Thermofisher</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (%50 konsantrasyon veya daha yüksek)</td><td>Çeşitli kaynaklar</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Floresan etiketli ikincil antikorlar</td><td>Çeşitli Kaynaklar, deneye bağlı</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>Çeşitli kaynaklar</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Cam lameller</td><td>Thermofisher</td><td>1254581</td><td></td></tr><tr><td>Cam slaytlar</td><td>Thermofisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>İnsan nöral kök hücreleri</td><td>Çeşitli kaynaklar</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Lentiviral vektörler</td><td>Çeşitli kaynaklar</td><td>özel sipariş</td><td></td></tr><tr><td>Montaj ortamı</td><td>Thermofisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>N2 takviyesi</td><td>Thermofisher</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Thermofisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Thermofisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Birincil antikorlar</td><td>Çeşitli Kaynaklar, deneye bağlı</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sallanan veya dönen platform</td><td>Çeşitli kaynaklar</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Steril hücre kültürü başlığı</td><td>Çeşitli kaynaklar</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin S</td><td>Sigma</td><td>T1892-25G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermofisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Su banyosu</td><td>Çeşitli kaynaklar</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

tau aggregation lentiviral kullanarak eğitim için bir in vitro modeli-ınsan nöronların aracılı dönüştürücü

An In Vitro Model for Studying Tau Aggregation Using Lentiviral-mediated Transduction of Human Neurons

Protein Tau aberrant toplama patilik nörodejeneratif hastalıkların bir dizi dahil, Alzheimer hastalığı (AD) dahil olmak üzere. Tauopati fare modelleri toplanan Tau nörotoksisik mekanizmaları araştırmak için değerli bir kaynak sağladı rağmen, bu giderek belirgin hale geliyor, nörofizyolojide türler arası farklılıklar nedeniyle, fare beyni için uygun değildir insan durumunu modelleme. Hücre kültürü yöntemlerindeki gelişmeler insan nöronal kültürlerini deneysel kullanım için erişilebilir hale almış ve nörokemoterapi gelişiminde destekli olmuştur. Ancak, insan nöronal hücre kültürlerinin adaptasyon rağmen, insan tauopati in vitro modellerde henüz yaygın olarak mevcut değildir. Bu protokol, insan nöronların lentiviral türeyen vektörler ile transkif olduğu, patik olarak mutasyona uğramış Tau için kod olan, Sarı floresan proteini (YFP) muhabiri olan Tau toplama hücresel modelini açıklar. Dönüştürücü kültürler, Tiyoflavin ve neurotoksisite görüntüleme belirteçleri için pozitif leke Tau agrega üretmek, gibi azalan Akral uzunluğu ve artmış lizozomal hacim gibi. Bu prosedür, insan tauopathies okumak için yararlı ve ekonomik bir model olabilir.

Tau-RDLM-YFP-traned nöronlar floresan YFP ile etiketlendi ve RDLM-dönüştürücü kültürler transksiyon sonra toplamları gösteriliyor. Bu inlüzyonlar Tiyoflavin için pozitif lekelenmiş (Şekil 1). Şekil 1 ' in gösterdiği gibi, bu protokol thioflavin pozitif Tau toplamları görüntüleyen nöronal kültürler üretir. İlk deneyler için, nörolojik farklılaşma nöron özgü Marker β-tubulin III kültürlerde immünolabeling tarafından teyit edilmesi önerilir. Önemlisi, floresan etik...

Bu protokol, insan nöronal kültürlerin mutant insan Tau için lentiviral yapıları ile dönüştürücü olduğu bir prosedür ayrıntıları. Traned kültürler Tau toplamları ve ilişkili patolojileri görüntüler.

Tau Aggregation Lentiviral kullanarak eğitim için bir In vitro modeli-ınsan nöronların aracılı dönüştürücü

Aberrant aggregation of the protein tau is pathogenically involved in a number of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD). ...

Bu protokolde insan tauopatisinin in vitro modelini ayrıntılarıyla anlatacağız. Bu yöntem ilaç taraması ve hastalık mekanizması çalışmaları için yararlı olabilecek bir malzeme ihtiyacını karşılar. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücre kültürü paradigmasının hayvan çalışmalarına göre tau toksisitesi ve potansiyel tau terapötiklerinin daha hızlı değerlendirilmesine olanak sağlamasıdır.Bir mililitrelik aliquots olun ve eksi 20 veya eksi 70 santigrat derece onları saklayın. Daha sonra, mililitre başına 10 mikrogram konsantrasyonda steril PBS'deki temel fibroblast büyüme faktörünün yeniden oluşturulun. 10 mikrolitrelik aliquots olun ve dört santigrat derece onları saklayın.Sonra glutamin ile DMEM-F12 yeni bir açılmamış 500 mililitrelik şişe yola. Nöral kök hücre ortamı hazırlamak için 10 mililitre B27, beş mililitre N2 ve beş mililitre penisilin-streptomisin ekleyin. Konik bir tüp içine NSC medya 50 mililitre yerleştirin ve hazırlanan bFGF 10 mikrolitre ekleyin.Bu NSC artı bFGF ortamını dört santigrat derecede saklayın. İlk olarak, dondurucudan hücre kültürü plakaları için dondurulmuş bazal membran matris kaplama bir aliquot çıkarın ve dört derece santigrat de çözülmesine izin verir. Penisilin-streptomisin içeren dmem-F12 media beş mililitre çözülmüş bodrum membran matris kaplama 385 mikrolitre ekleyin.Hücreler dondurulmuş NSC stoklarından çözülürse, dondurucudan bir şişe dondurulmuş hücre alın ve şişeyi suda ileri geri hareket ettirerek 37 dereceye ısıtılan bir su banyosunda ısıtın. Bundan sonra,% 70 etanol ile şişe sprey. Daha sonra bir hücre kültürü başlığı altında, penisilin-streptomisin içeren DMEM-F12 medya yaklaşık 10 mililitre hücreleri aktarın.Oda sıcaklığında santrifüj 1,000 kez g beş dakika. Daha sonra ortamı aspire edin ve NSC medyadaki hücreleri yeniden askıya alın. Kullanılan hücre kültürü damarı için uygun tohumlama yoğunluğunu elde etmek için NSC ortamdaki hücreleri seyreltin.NSC ortamlarında asma yeterli hücre ekleyin bodrum membran matris kaplı kültür yemekleri tohum. Hücreleri %5 karbondioksitle %75 ila %80 oranında büyütene kadar 37 derecede büyütün ve her gün medyayı değiştirmeyi unutmayın. Lentivirüs ile nöronlar transduce için, hücre başına 340, 000 geçirilebilir birimleri bir titer sayısı kullanın.Hücre kültürü medyasındaki geçirilebilir birimleri gerekli konsantrasyona seyreltin ve hücrelere ekleyin. Lentivirüs ekledikten iki gün sonra, bFGF içermeyen taze medya ile bir kez hücreleri yıkayın. BFGF olmadan medyada %5 karbondioksit ile hücreleri 37 derecede 37 derecede ekmeye devam edin.Transdüksiyondan sonra hücreleri yaklaşık sekiz hafta boyunca saklar, hücre kültürü ortamını her gün değiştirdiğinden emin olun. Hücreleri rutin olarak görselleştirmek ve canlılığı sağlamak için bir ışık mikroskobu kullanın. Transdüksiyondan sonra, kültürü steril tutmak için üzerlerindeki kapağı tutmak için kuvözden kültür yemeklerini çıkarın.514 nanometre uyarma ve 527 nanometre emisyon filtresi ile 10X hedefi altında hücreleri görselleştirmek için canlı hücre görüntüleme yeteneğine sahip bir floresan mikroskop kullanın. Bu çalışmada tau-RDLM-YFP lentivirüs ile transen nöronlar floresan YFP ile etiketlenir. RDLM'den transeksiyonlu kültürlerde transdüksiyon sonrası agregalar görüldüğü görülmektedir.Bu inkiçeriler tioflavin için pozitif leke. Nöronal farklılaşma kültürlerde nöron spesifik belirteç beta-tubulin III immünetiketleme ile doğrulanır. Floresan etiketli sekonder antikorların YFP ile örtüşmeyen bir uyarma emisyon spektrumuna sahip olması gerektiğini unutmamak gerekir.Sarı floresan tau agregaları boyama yokluğunda görünür olmasına rağmen, tioflavin de floresan sinyal tau değil, hücresel enkaz olduğunu doğrulamak için görüntüleme için kullanılmalıdır. Tau aşırı ekspres hücreleri nesil sonra, nöronal sağlık ve tau agregasyonu değerlendirmeler bir dizi yapılabilir. Örneğin, bu hücrelerin aksonal dejenerasyon gösterdiğini bulduk.Hücre kültürü çalışmalarına ek olarak, patojenite ekzozomal türetilmiş tau incelemek için bu yöntemi kullandık.

an-vitro-model-for-studying-tau-aggregation-using-lentiviral-mediated

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, kantitatif bir değerlendirme için floresanla aktive edilen hücre sıralaması yoluyla analiz edilen, pH'a duyarlı floresan etiketli Tau agregatları kullanılarak murin mikroglia tarafından Tau alımını ölçen hücre bazlı bir test gösterilmektedir.

Mikroglia tarafından Tau proteini alımını değerlendirmek için hücre bazlı bir test

Bu video, protein agregasyonunu incelemek için sarı floresan proteini (YFP) ile etiketlenmiş mutant bir insan tau proteinini kodlayan bir lentivirüs ile insan nöronal hücrelerinin dönüştürülmesi sürecini göstermektedir. Nöronlarda görünür sitoplazmik tau agregatlarının oluşumuyla sonuçlanan viral girişten mutant tau ekspresyonuna kadar olan adımları ana hatlarıyla belirtir.

Tau Protein Agregasyon Analizi için İnsan Nöronlarının Lentiviral Aracılı Transdüksiyonu

Değiştirilmemiş ve hiperfosforile tau proteinleri hiperfosforizasyonu bağımlı hızlı agregasyon kinetiğini ortaya çıkarmak için, iki in vitro toplanma deneylerde kullanıldı. Bu deneyler Alzheimer hastalığının ilerlemesini altında yatan fibriller oluşturmak için hiperfosforilize tau eğilimini modüle edebilir bileşikler için gelecek ekranlar için önünü.

In Vitro toplama Deneyler hiperfosforile tau proteini kullanılarak

Protein agregatlarının veya proteopatik tohumların hücreden hücreye transferi, nörodejeneratif hastalıklarda patolojinin ilerlemesinin altında yatıyor olabilir. Burada, rekombinant veya biyolojik numunelerden tohumlama aktivitesinin spesifik ve hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlayan yeni bir FRET akış sitometrisi testi açıklanmaktadır.

FRET Akım Sitometrisi ile Proteopathic Tohumculuk Faaliyet duyarlı Algılama

Bu iletişim kuralı, Alfa-synuclein oluşumu çoğaltır hücre tabanlı bir sistem içinde vivoagrega sağlamak için hedeftir. Hücre içi Alfa-synuclein kapanımlar birincil nöronlarda tarafından içselleştirilmesi numaralı seribaşı ve eksojen yayılması hastalıklı Alfa-synuclein transgenik fareler izole yerli microsomes ilişkili Alfa-synuclein toplamları yönetilen.

Microsomes ilişkili Alpha-synuclein toplamları için birincil nöronlar eksojen yönetim olarak güçlü hücre modeli liflerinde oluşumu

Bu el yazması açıklanan tau toplama tahlil vivo içinde tau misfolding ve toplama beklenen özelliklerini taklit eder.

Vitro Tahlil türleri çalışmak için toplama Tau Protein ve uyuşturucu tarama

Burada nicelik eylem Anti-tau antikorların mekanizmaları daha iyi tanımlamak için bir araştırma aracı oluşturma amacıyla microglia tarafından tau alımını değerlendirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklayın.

Antikor aracılıklı Tau izni Microglia tarafından eğitim için tahlil hücre tabanlı

Tau, hem mikrotübülleri bağladığı sitoplazmada hem de Alzheimer hastalığına bağlı genlerin modülasyonu da dahil olmak üzere alışılmadık işlevler uyguladığı çekirdekte bulunan nöronal bir proteindir. Burada, sitoplazmik Tau gelen herhangi bir girişim hariç nükleer Tau işlevini araştırmak için bir yöntem açıklar.

Tau Subsellojen Lokalizasyonunun Hastalıkla İlgili Genlerin İfadesini Araştırmaaracı Olarak Modülasyonu

Parkinson hastalığının patogenezini incelemek ve anlamak için α-sinükleinin in vivo fizyolojik modeli gereklidir. İnsanlaştırılmış bir maya modeli kullanarak α-sinükleinin sitotoksisitesini ve agrega oluşumunu izlemek için bir yöntem tanımladık.

İnsanlaştırılmış Bir Maya Modeli Kullanarak α-Sinüklein Toksisitesini ve Agregasyonunu İncelemek İçin Bir Yöntem

Burada, aksonal taşıma üzerindeki patolojik protein kaynaklı etkileri analiz etmek ve bu etkilere aracılık eden mekanik yolları belirlemek için primer hipokampal kemirgen nöronlarının transfeksiyonunun canlı hücre konfokal görüntüleme ile nasıl birleştirileceğini gösteriyoruz.

Primer hipokampal nöronlarda patolojik proteinlerin aksonal taşıma üzerindeki etkilerini ölçmek için canlı hücre görüntülemenin kullanılması

Poliglutamin spinoserebellar ataksiler, CAG genişlemelerinin agregasyona yatkın proteinler üretmesiyle oluşur. Bu protokol, vektör üretimi, stereotaksik teslimat ve inklüzyonlar ile nöronal belirteç kaybının analizini tanımlar; böylece nörodejeneratif hastalıklar için mekanizmaları araştırmak ve hedefe yönelik tedavileri değerlendirmek için kontrollü bir platform sağlar.

Poliglutamin spinoserebellar ataksiyaların preklinik modeli olarak lentiviral indüksiyonlu striatal patoloji

Öğrenin, insan nöronlarında lentiviral aracılı mutant tau transdüksiyonu ile tauopati in vitro modeli oluşturmayı. Bu yöntem, tau toksisitesi ve potansiyel tedavilerin hızlı değerlendirilmesini sağlar.

Tau Aggregation Lentiviral kullanarak eğitim için bir In vitro modeli-ınsan nöronların aracılı dönüştürücü

Daha fazla video keşfet