Tau Aggregation Lentiviral kullanarak eğitim için bir In vitro modeli-ınsan nöronların aracılı dönüştürücü

Bu protokol, insan nöronal kültürlerin mutant insan Tau için lentiviral yapıları ile dönüştürücü olduğu bir prosedür ayrıntıları. Traned kültürler Tau toplamları ve ilişkili patolojileri görüntüler.

Bu protokolde insan tauopatisinin in vitro modelini ayrıntılarıyla anlatacağız. Bu yöntem ilaç taraması ve hastalık mekanizması çalışmaları için yararlı olabilecek bir malzeme ihtiyacını karşılar. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücre kültürü paradigmasının hayvan çalışmalarına göre tau toksisitesi ve potansiyel tau terapötiklerinin daha hızlı değerlendirilmesine olanak sağlamasıdır.

Bir mililitrelik aliquots olun ve eksi 20 veya eksi 70 santigrat derece onları saklayın. Daha sonra, mililitre başına 10 mikrogram konsantrasyonda steril PBS'deki temel fibroblast büyüme faktörünün yeniden oluşturulun. 10 mikrolitrelik aliquots olun ve dört santigrat derece onları saklayın.

Sonra glutamin ile DMEM-F12 yeni bir açılmamış 500 mililitrelik şişe yola. Nöral kök hücre ortamı hazırlamak için 10 mililitre B27, beş mililitre N2 ve beş mililitre penisilin-streptomisin ekleyin. Konik bir tüp içine NSC medya 50 mililitre yerleştirin ve hazırlanan bFGF 10 mikrolitre ekleyin.

Bu NSC artı bFGF ortamını dört santigrat derecede saklayın. İlk olarak, dondurucudan hücre kültürü plakaları için dondurulmuş bazal membran matris kaplama bir aliquot çıkarın ve dört derece santigrat de çözülmesine izin verir. Penisilin-streptomisin içeren dmem-F12 media beş mililitre çözülmüş bodrum membran matris kaplama 385 mikrolitre ekleyin.

Hücreler dondurulmuş NSC stoklarından çözülürse, dondurucudan bir şişe dondurulmuş hücre alın ve şişeyi suda ileri geri hareket ettirerek 37 dereceye ısıtılan bir su banyosunda ısıtın. Bundan sonra,% 70 etanol ile şişe sprey. Daha sonra bir hücre kültürü başlığı altında, penisilin-streptomisin içeren DMEM-F12 medya yaklaşık 10 mililitre hücreleri aktarın.

Oda sıcaklığında santrifüj 1,000 kez g beş dakika. Daha sonra ortamı aspire edin ve NSC medyadaki hücreleri yeniden askıya alın. Kullanılan hücre kültürü damarı için uygun tohumlama yoğunluğunu elde etmek için NSC ortamdaki hücreleri seyreltin.

NSC ortamlarında asma yeterli hücre ekleyin bodrum membran matris kaplı kültür yemekleri tohum. Hücreleri %5 karbondioksitle %75 ila %80 oranında büyütene kadar 37 derecede büyütün ve her gün medyayı değiştirmeyi unutmayın. Lentivirüs ile nöronlar transduce için, hücre başına 340, 000 geçirilebilir birimleri bir titer sayısı kullanın.

Hücre kültürü medyasındaki geçirilebilir birimleri gerekli konsantrasyona seyreltin ve hücrelere ekleyin. Lentivirüs ekledikten iki gün sonra, bFGF içermeyen taze medya ile bir kez hücreleri yıkayın. BFGF olmadan medyada %5 karbondioksit ile hücreleri 37 derecede 37 derecede ekmeye devam edin.

Transdüksiyondan sonra hücreleri yaklaşık sekiz hafta boyunca saklar, hücre kültürü ortamını her gün değiştirdiğinden emin olun. Hücreleri rutin olarak görselleştirmek ve canlılığı sağlamak için bir ışık mikroskobu kullanın. Transdüksiyondan sonra, kültürü steril tutmak için üzerlerindeki kapağı tutmak için kuvözden kültür yemeklerini çıkarın.

514 nanometre uyarma ve 527 nanometre emisyon filtresi ile 10X hedefi altında hücreleri görselleştirmek için canlı hücre görüntüleme yeteneğine sahip bir floresan mikroskop kullanın. Bu çalışmada tau-RDLM-YFP lentivirüs ile transen nöronlar floresan YFP ile etiketlenir. RDLM'den transeksiyonlu kültürlerde transdüksiyon sonrası agregalar görüldüğü görülmektedir.

Bu inkiçeriler tioflavin için pozitif leke. Nöronal farklılaşma kültürlerde nöron spesifik belirteç beta-tubulin III immünetiketleme ile doğrulanır. Floresan etiketli sekonder antikorların YFP ile örtüşmeyen bir uyarma emisyon spektrumuna sahip olması gerektiğini unutmamak gerekir.

Sarı floresan tau agregaları boyama yokluğunda görünür olmasına rağmen, tioflavin de floresan sinyal tau değil, hücresel enkaz olduğunu doğrulamak için görüntüleme için kullanılmalıdır. Tau aşırı ekspres hücreleri nesil sonra, nöronal sağlık ve tau agregasyonu değerlendirmeler bir dizi yapılabilir. Örneğin, bu hücrelerin aksonal dejenerasyon gösterdiğini bulduk.

Hücre kültürü çalışmalarına ek olarak, patojenite ekzozomal türetilmiş tau incelemek için bu yöntemi kullandık.