Name: Gerçek zamanlı olarak buharı aşamasında propil reseptör etkinleştirme bir propil tarafından in Vitro izlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Keşfedin buhar fazlı uyarım ile koku reseptörü aktivasyonunun gerçek zamanlı in vitro izlenmesi yöntemini. Bu teknik, koku algısı kinetiğini anlamak ve reseptör tabanlı biyosensörler geliştirmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser NIH (DC014423 ve DC016224) ve savunma ileri araştırma ajansı RealNose projesi hibe tarafından desteklenmiştir. YF JSP'ler Program stratejik Uluslararası ağlar, yetenekli araştırmacıların dolaşımı (R2801) hızlandırmak ilerlemek için mali desteği ile Duke Üniversitesi'nde kaldı. Sahar Kaleem yazması düzenleme için teşekkür ediyoruz.

1. Hana3A kültür hücreleri
<ol><li>M10 hazırlayın (en az önemli orta (MEM) artı % 10 v/v fetal sığır serum (FBS)) ve M10PSF (M10 artı 100 µg/mL penisilin-streptomisin ve 1,25 µg/mL Amfoterisin B).</li>
	<li>M10PSF 100 mm hücre kültür bulaşık kuluçka 37 ° C ve % 5 karbon dioksit (CO2) ayarla içinde içinde 10 mL hücrelerde kültür.</li>
	<li>2 günde % 20 oranında Hücreleri Böl: % 100 izdiham hücre (yaklaşık 1.1 x 107 hücreleri) faz kontrast mikroskop altında gözlenen zaman medya aspire ve fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 mL yavaşça hücrelerle yıkayın.</li>
	<li>PBS Aspire edin ve 3 mL % 0.05 tripsin-etilen diamin tetraacetic asit (EDTA, 0,48 mM) ekleyin. Yaklaşık 1 dak kadar hücreleri plaka ayırmak için izin hareket.</li>
	<li>M10 tripsin devre dışı bırakın ve sonunda hala plaka için yukarı ve aşağı pipetting tarafından bağlı hücreler ayırmak için 5 mL ekleyin.</li>
	<li>15 mL tüp hacmi (8 mL) aktarmak ve 200 x g 5 dk. aspiratı süpernatant de santrifüj kapasitesi ve hücreleri 5 mL M10PSF de yukarı ve aşağı herhangi bir hücreyi kitle kırmaya pipetting tarafından resuspend. Kabarcıklar tüp oluşturmaktan kaçının.</li>
	<li>1 mL resuspended hücreleri çözeltisi yeni 100 mm hücre kültür tabağına aktarın ve taze M10PSF 9 mL ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya.</li>
</ol>2. Transfection için hücreleri hazırlanması
<ol><li>Kesiştiği yerde veya hücreleri, faz kontrast mikroskop altında gözlemleyerek değerlendirmek. En az % 10 izdiham (yaklaşık 1.1 x 106 hücreler) bir tabak için gereklidir.</li>
	<li>Medya Aspire edin ve PBS 10 mL yavaşça hücrelerle yıkayın. PBS Aspire edin ve 3 mL EDTA ekleyin. Yaklaşık 1 dakika oda sıcaklığında hücreleri plaka ayırmak kadar hareket izin.</li>
	<li>M10 tripsin devre dışı bırakın ve sonunda hala plaka için yukarı ve aşağı pipetting tarafından bağlı hücreler ayırmak için 5 mL ekleyin. Hacmi (8 mL) 15 mL tüp ve 5 min için 200 x g , santrifüj aktarın.</li>
	<li>Süpernatant Aspire edin ve yukarı ve aşağı herhangi bir hücreyi kitle kırmaya pipetting tarafından hücreleri 5 mL M10PSF de resuspend. Kabarcıklar tüp oluşturmaktan kaçının.</li>
	<li>Transfected için tabak sayısına bağlı olarak, bir rezervuar hücrelerde uygun bir miktar M10PSF uygun karşılık gelen hacmi ile aktarın. Bir 96-şey plaka 1/10 toplam hacmi 6 mL ulaşmak için M10PSF içinde seyreltilmiş bir % 100 Konfluent 100 mm tabak (yaklaşık 1.1 x 106 hücreler) ile kaplama. % 100 izdiham 100 mm çanak ile başlayan bir 96-şey plaka için 500 µL taze M10PSF, 5.5 mL 5 mL resuspended hücreleri de ekleyin. Hücreleri ve M10PSF hava kabarcıkları oluşmadan karıştırın.</li>
	<li>Askıya alınan hücrelerinin 50 µL bir çok kanallı pipet kullanarak 96-şey plaka her kuyuya pipet. Gecede 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya.</li>
</ol>3. plazmid Transfection
<ol><li>96-şey plaka % 30 ve % 50 arasında bir hücre izdiham sağlamak için faz kontrast mikroskop altında gözlemlemek.</li>
	<li>Tüm plakasına ortak plazmid içeren ilk transfection karışımı hazırlayın (RTP1S, ya da ve Glosensor protein, Tablo malzemelerigörmek) birimleri Tablo 1' deki aşağıdaki. Fark miktarını Rho öğesini OR ayrılmış ORs sayısına göre eğer birkaç ORs. Not: Biz şiddetle tavsiye bir boş vektör negatif kontrol (burada Rho-PCI) ve herhangi bir pozitif kontrol (OR bilinen test propil yanıt vermek için) deney plana eklemek için.</li>
	<li>MEM 500 µL ve Lipofectamine 2000 reaktif 20 µL içeren ikinci bir transfection karışım hazırlamak (bir 96-şey plaka için geçerli Tablo malzemelerigörmek). İlki için ikinci mix ekleyin ve karışımı yavaşça yukarı ve aşağı pipetting ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. M10 5 mL ekleyin ve karışımı yavaşça.</li>
	<li>Daha önce platted 96-şey plaka M10PSF son transfection Medya 50 µL tarafından değiştirin. CO2 37 ° C ve %5 için bir kuluçka makinesi kümesindeki kuluçkaya ve yordamı 6. adımda açıklanan luminometer gecede aşağıdakileri TMMOB vakum.</li>
</ol>4. substrat kuluçka
<ol><li>96-şey plaka % 60 ve % 100 arasında bir hücre izdiham sağlamak için faz kontrast mikroskop altında gözlemlemek. Stimülasyon çözüm, Hank'in dengeli tuz çözüm (10 mM hydroxyethyl piperazineethanesulfonic asit (HEPES) ve 5 mM D-glikoz içeren HBSS) hazırlayın.</li>
	<li>Kamp reaktif 75 µL seyreltik (bkz: malzemeler tablo) 2.75 mL stimülasyon çözeltisi için çözüm. Transfection orta 96-şey plaka kaldırmak ve her şey için taze stimülasyon çözüm 50 µL ekleyerek hücreleri yıkayın.</li>
	<li>Stimülasyon çözüm kaldırın ve kamp reaktif çözüm adım 4.2 her şey için hazırlanan 25 µL ekleyin. 96-şey plaka, oda sıcaklığında karanlık ve odor-özgür bir ortamda (örneğin, bir temiz boş çekmece kimyasallar veya propil kaynaklarından uzakta) 2 h için kuluçkaya.</li>
</ol>5. propil stimülasyon
<ol><li>İlk olarak, luminometer odası uçucu propil molekülleri ile equilibrate. Madeni yağ (Şekil 2A) istenen konsantrasyonu 10 ml için propil sulandırmak. Kamp reaktif kuluçka süresi bitmeden 25 µL propil çözüm yeni bir 96-şey plaka (değil bir hücre içeren) ekleyin. Bu propil plaka, oda sıcaklığında 5 (hiçbir luminometer kayıt burada gereklidir) min (Şekil 2B) için luminometer odasında kuluçkaya.</li>
	<li>Luminometer 0 ile ışıldama kaydetmek için ayarla s plaka ölçü 90 20 döngüleri sırasında gecikme 0,7 ile s s döngüleri arasındaki süre.</li>
	<li>Şu plaka okumadan önce propil plaka odasından kaldırın. Propil wells (katmayın propil hücreleri içeren wells) hücreleri içeren 96-şey plaka arasında 25 µL ekleyin ve hızlı bir şekilde tüm wells ışıldama ölçüm için 30 dk (Şekil 2C) içinde 20 döngü başlar.</li>
</ol>6. Luminometer içinde kalan propil kaldırılması
<ol><li>Luminometer kapıyı aç. Vakum pompası bağlı tüp takın.</li>
	<li>Vakum odorants okuma odası kapsamlı (en az 2 h, tercihen gece) başka bir koku tenler bir deneme Çapraz bulaşma kaçınmak için iki odorants arasında. Temiz hava ile 5 dk önce sonraki propil kuluçka sırasında basınçlı hava göndererek değiştirin.</li>
</ol>7. veri analizi
<ol><li>Verileri luminometer yazılımından verin.</li>
	<li>Ortalama aynı veya her kayıt süresi için çoğaltır. Normalleştirilmiş OR yanıt veya denetim ortalama değerine bölünerek herhangi bir nihai denetime (örneğin, boş vektör, şekil 3vebir temsilcisi sonuçları bölümü) değeri her kayıt süresi (şekil 3B ortalama hesaplama ve temsilcisi sonuçları bölümü).</li>
	<li>Bazal faaliyetlerini her OR cevaben at 0 ortalama OR yanıt bölerek normalize s her kayıt zaman yanıt (bkz: şekil 3C ve temsilcisi sonuçları bölümü).</li>
	<li>Tek bir OR yanıt değer elde etmek için her OR eğri altındaki alan hesaplamak. Bunu yapmak için her OR için her kayıt süresi tüm ışıma değerleri toplamı.</li>
</ol>

Y.F., H. K ve H.M. bir patent başvurusu 27 Ekim 2016 bu iş ile ilgili eğe.

Koku algı temelde ORs etkinleştirme üzerinde bağlıdır. Sonuç olarak, anlayış işlevleriyle beyin kullanın uçucu kimyasal çevresine algıladıkları için karmaşık mekanizmaları çatlamak için gereklidir. Ancak, bu işlem anlayış tarafından OR repertuar odorants tüp bebek. karşı işlevsellik için ekran için sağlam bir yöntem oluşturulmasında zorluklar engel Hücre ORs yüzey ve kapaklı ifade kısmen çözüldü etiketli reseptörleri13,19 oluşturulması ve keşif ve optimi...

Koku alma duygusu karasal hayvanlar uçucu kimyasal çevreleri sürücü davranışları ve duyguları ile etkileşimine izin verir. Temelde, koku alma sistemi, propil reseptörleri (ORs)1düzeyinde ilk etkileşim propil moleküllerin koku Algılama işlemi başlar. Memelilerde, ORs tek tek koku epitel2' de yer alan koku duyusal nöronlar (OSNs) ifade edilir. Ait oldukları G-protein birleştiğinde reseptör (GPCR) ailesi ve daha doğrusu rhodopsin benzeri alt aile (sınıf A olarak da bilinir). ORs çift kimin harekete geçirmek ardından döngüsel nükleotit geçişli kanal açılması ve aksiyon potansiyelleri nesil kamp üretim yol açan uyarıcı G protein Golf ile. Bir koku algılama etkinleştirilmiş ORs3,4 belirli bir desen kullanır ve bu nedenle koku tanıma nerede bir OR odorants bir dizi ile aktif ve bir propil etkinleştirmek bir birleşimsel kodlama düzeni izler kabul edilen bir ORs birleşimi. Ve böyle Kombinatorik kodlama aracılığıyla, bu organizmalar algılayabilir ve sayısız uçucu koku molekülleri arasında ayrımcılık öne ise. Bir kokuları nasıl algılandığını anlamak için anahtar olduğunu anlamak için nasıl ve hangi ORs tarafından verilen bir koku harekete geçirmek.
Bir girişim propil aydınlatmak için- veya etkileşimler, tüp bebek fonksiyonel deneyleri önemli bir rol oynamıştır. Yetim ORs (OR de-orphanization) için agonist kokulu ligandlar tanımlaması çok aktif bir alan son yirmi yıldır, ex vivo ve içinde vivo işlevsel testleri5,6,7 tüp bebek, çeşitli aracılığıyla olmuştur ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17.
İn vitro tahlil sistemleri en iyi ORs işlevsel etki alanları ve kritik artıkları ORs yanı sıra potansiyel mühendislik uygulamaları da dahil olmak üzere, ayrıntılı fonksiyonel karakterizasyonu için uygundur. Ancak, daha fazla değerli tüp bebek sistemlerinin geliştirilmesi için ORs kodlamayla OSNs ile zorluk ve kapaklı hücrelerdeki ORs işlev ifadesi nedeniyle kısmen bir mücadele vardı. İlk challenge propil haritalama işlevsel ORs hücre yüzey ifade için izin iletişim kuralları kurmak için olmuştu-OR etkileşimleri. Bir dizi bağımsız gruplar çeşitli yaklaşımlar5,6,7,8,9,10,11,12kullanılan, 14,18,19,20. En erken başarılarından Krautwurst vd tarafından yapıldı ın rhodopsin (Rho-etiket) kısaltılmış bir dizi ile N-terminus, ORs öğesini ve geliştirilmiş yüzey ifade insan embriyonik böbrek (HEK) hücreleri13' te görülmektedir. Varyasyonları OR dizisine bağlı etiketi için yapılan olduğunu hala bir yol OR ifade ve işlevselliği19,21artırmak için araştırdı. Saito ve ark. sonra teşhis reseptör taşıma proteini 1 (RTP1) ve OR ticareti kolaylaştırmak RTP2. 22 RTP1, RTP1S, olarak adlandırılan daha kısa bir sürümünü de özgün protein23daha da etkili olduğu gösterilmiştir. Geliştirme stabil Golfifade bir hücre satırı (Hana3A), siklik adenozin monofosfattır (kampı) gazetecilere kullanımı ile birleştiğinde REEP1, RTP1 ve RTP2 24, propil tanımlaması sağladı-OR etkileşimleri. Hangi RTP aile proteinlerin hücre yüzey ifade belirlenecek ORs kalıntılarının teşvik mekanizması.
Kurulan bu yöntemlerin bir uyarı onlar odorants bir stimülasyon orta önceden çözülür ve orta değiştirerek hücreleri uyarmak anlamında propil stimülasyon sıvı faz, güvenmek olduğunu. Bu fizyolojik şartlarda nerede propil molekülleri koku epitel buharı aşamasında ulaşmak ve ORs dağılması tarafından nazal mukoza etkinleştirmek çok farklıdır. Daha yakından benzer fizyolojik ilgili uyarıcı pozlama, Sanz vd.20 altında hücre kuyu üstüne yerleştirilen bir plastik film iç yüzü asmaya propil çözüm bir damla uygulayarak buharı stimülasyon üzerinde dayalı bir tahlil evlenme teklif etti. Onlar kalsiyum yanıt floresan yoğunluğu izleme tarafından kaydedildi. Bu yöntem ilk hava fazlı propil stimülasyon kullanın, ama OR harekete geçirmek büyük bir tarama izin vermedi.
Burada, gerçek zamanlı buharı faz propil stimülasyon ile tüp bebek OR etkinleştirme Glosensor assay (şekil 1) tarafından izlenmesi sağlar yeni bir yöntem geliştirdi. Bu tahlil daha önce sıvı propil stimülasyon18,19,25,26,27,28,29, bağlamında kullanılan 30 , 31. luminometer izleme odası ilk plaka (şekil 1A) okuma önce buharlaşmış propil ile equilibrated. Propil moleküllerdir sonra faiz, RTP1S ve Glosensor proteinler (şekil 1B) OR ifade Hana3A hücreleri banyo arabellek içine solvated. Propil bir agonist or ise, OR için aktif bir uyum geçin ve gozlemler cyclase (AC) aktive Golf, bağlama ve sonuçta kamp düzeyleri yükselmeye neden. Yükselen bu kampı bağlamak ve Glosensor protein biyoluminesans katalizlerler ışıma oluşturmak için harekete geçirmek. Bu ışıma sonra luminometer tarafından kaydedilir ve OR etkinleştirme izleme sağlar. Tüp Bebek sistemleri yakınlaştırmayı kokular doğal algı getiriyor gibi yüksek faiz OR deorphanization bağlamında bu yöntem kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>% 0.05 tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td>% <td>0.05 Tripsin - EDTA (1x), fenol kırmızısı - 4 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>100 mm hücre kültürü kabı&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td>100 mm x 20 mm hücre kültürü kabı&nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL tüp</td><td>BD Falcon</td><td>352099</td><td>17 mm x 120 mm konik borular</td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>3843</td><td>96 kuyulu, LE kapaklı beyaz şeffaf dipli Poli-D-lizin kaplı Poli-D-lizin kaplı Polistiren</td></tr><tr><td>Amfoterisin</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td>Amfoterisin B 250 ve mikro; g/mL - 4 &°C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>santrifüj makinesi</td><td>Jouan</td><td>C312</td> 15 mL Sınıf II Tip A/B3 davlumbaz <td>için sallanan kova rotorlu santrifüj makinesi</td></tr><tr><td></td><td>NUAIRE</td><td>NU-407-500</td><td>hücre kültürü için davlumbaz</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Fetal Sığır Serumu - -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>GloSensor cAMP Reaktifi</td><td>Promega</td><td>E1290</td><td>GloSensor cAMP Reaktifi ışıldayan protein substratı - -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Kuluçka Makinesi 37 & derece; C; % 5 CO2</td> <td>Fisher Scientific</td><td>11-676-604</td><td>Hücre kültürü için inkübatör</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 reaktifi</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Lipofectamine 2000 Reaktif 1mg / ml transfeksiyon reaktifi - 4 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Luminometre POLARstar OPTIMA</td><td>BMG LABTECH,</td><td>lüminesans için 96 kuyulu plaka okuyucuyu</td><td>durdurdu</td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Koku vericiler için çözücü - oda sıcaklığında saklayın</td></tr><tr><td>Minimum Temel Orta (MEM)</td><td>Corning cellgro</td><td>10-010-CV</td><td>Minimum Esansiyel Orta Eagle with Earle' S Tuzları & L-glutamin - 4 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td>10.000 U penisilin ve 10 mg streptomisin ile stabilize edilmiş Penisilin-Streptomisin çözeltisi - -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>pGlosensor</td><td>Promega</td><td>E2301</td><td>pGloSensor-22F cAMP ışıldayan protein plazmidi - 4 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Fazı kontrast mikroskobu</td><td>Leica</td><td>090-131.001</td><td>x4, x10, x20 objektifli faz kontrast mikroskobu</td></tr><tr><td>RTP1S</td><td>H. Matsunami</td><td></td> <td>lab-100 ng/&mikro; L plazmid - 4 derecede saklayın > Ç</td></tr></tbody></table>

gerçek zamanlı olarak buharı aşamasında propil reseptör etkinleştirme bir propil tarafından in vitro izlenmesi

Real-time In Vitro Monitoring of Odorant Receptor Activation by an Odorant in the Vapor Phase

Koku algı odorants etkileşim propil reseptörleri ile başlar (veya) koku duyusal sinir hücreleri tarafından (OSN) dile getirdi. Koku tanıma nerede bir OR odorants bir dizi ile etkinleştirilebilir ve bir propil ORs bir arada etkinleştirebilirsiniz bir birleşimsel kodlama düzeni izler. Böyle Kombinatorik kodlama aracılığıyla, organizmalar algılayabilir ve sayısız uçucu koku molekülleri arasında ayırımcılık. Böylece, belirli bir konsantrasyon, bir koku ORs, tarafından bir harekete geçirmek desen her koku için belirli olan tanımlanabilir. Bu anlamda, koku gerektirir anlayış propil algıladıkları için beyin kullandığı düzeneklerini çatlama-OR etkileşimleri. Bu yüzden koku alma toplum "Bu reseptörleri de-orphanize için" taahhüt eder. Propil tanımlamak için kullanılan geleneksel tüp bebek sistemleri- veya etkileşimler ORs ile etkileşim daha önce doğal algılama kokuları buharı odorants dağılması ile burun mukozası içine sorumluluk alanlarından olan hücre ortamla kuluçka propil, kullanılan. Burada, OR etkinleştirme buharı fazlı odorants üzerinden gerçek zamanlı izlenmesi için izin yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Bizim yöntem Glosensor tahlil kullanarak ışıldama tarafından kamp yayın ölçme üzerinde dayanır. İçinde vivo ve tüp bebek yaklaşımlar arasındaki geçerli boşlukları arasında köprü görevi gören ve bir biomimetic uçucu kimyasal duyumsal için bir temel sağlar.

Yanıt üç fare ORs, Olfr746, Olfr124 ve Olfr1093 ekranlı cinnamaldehyde buharı stimülasyon (şekil 3) kullanarak. Aynı anda, biz test ORs propil kaynaklı faaliyetlerinin belirli sağlamak için bir boş vektör kontrolü (Rho-PCI) kullanılan (şekil 3A). ORs buharı propil uyarıcı üzerine gerçek zamanlı etkinleştirme izlenen 20'den fazla ölçüm devir oldu. Her veri de ilk boş vektör kontrolü ortalama değerine her çevriminde (şekil 3</...

Fizyolojik açıdan, propil reseptörleri buharı aşamasında inhale propil moleküller tarafından etkinleştirilir. Ancak, en tüp bebek sistemleri sıvı faz propil stimülasyon yararlanmak. Burada, propil reseptör etkinleştirme propil stimülasyon buharı faz üzerine gerçek zamanlı tüp bebek izleme sağlayan bir yöntem mevcut.

Gerçek zamanlı olarak buharı aşamasında propil reseptör etkinleştirme bir propil tarafından in Vitro izlenmesi

Olfactory perception begins with the interaction of odorants with odorant receptors (OR) expressed by olfactory sensory neurons (OSN). Odor recognition ...

Protokolümüz, koku reseptörlerinden oluşan bir panel ile uçucu kokuların saptanmasını ve ayrımcılığını ölçmeyi sağlar. Bu yöntem koku reseptör tabanlı biyosensörler geliştirme imkanını açar. Bu teknik, buhar fazında koku molekülleri üzerine odorant reseptör aktivasyonunun gerçek zamanlı in vitro olarak izlenmesini sağlar.Bu in vitro ve in vivo yaklaşımlar arasındaki boşluğu doldurur. Bu yöntem, mukozal metabolik enzimlerin rolü de dahil olmak üzere koku algısına yol açan olayların kinetik lerini anlamak için kullanılabilir. Başlamak için, el yazmasına göre M10 ve M10 PSF'yi hazırlayın.Hücreler 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit M10 PSF 10 mililitre kültürlü. Bir faz kontrast mikroskobu altında kültür çanak gözlemleyin. %100 birleştiğinde, medyayı aspire ederek ve hücreleri 10 mililitre PBS ile hafifçe yıkayarak hücreleri daha düşük bir konsantrasyona bölün.Sonra PBS aspire ve tripsin-EDTA üç mililitre ekleyin. Hücreler çanak kopana kadar yaklaşık bir dakika tepki versin. Tripsini inaktive etmek için beş mililitre M10 ekleyin ve çanağa bağlı hücreleri ayırmak için yukarı ve aşağı pipet.Sekiz mililitre hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpü 200-kat-G'de be

real-time-vitro-monitoring-odorant-receptor-activation-an-odorant

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video makalede, istikrarlı ve denetlenebilir geometrileri odorant degradelerin inşaat sağlayan yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Biz kısaca bu gradyanlar koku alma kusurları (tam ve kısmi anosmi) ekrana nasıl kullanılabileceğini göstermek ve daha ince kemotaksis davranış özelliklerini incelemek için.

Yüksek çözünürlüklü Ölçüm Drosophila Larva Koku-Driven Davranış

Bu makale, fareler koku ampulün yüzeyi harita koku uyarılmış faaliyetleri içsel optik sinyalleri ve flavoproteins otofloresans sinyallerini görüntüleme protokolleri sunar.

Optik Yansıtma ve Otofloresans Sinyalleri kullanarak, Fare Koku Ampul Görüntüleme Koku-Uyarılmış Etkinlikler

Olfaktör reseptör nöronları (ORNs) bir reseptör içine ilk sırayla koku ampul içinde ikinci dereceden nöronlara iletilir aksiyon potansiyelleri tetikleyen güncel koku sinyalleri dönüştürmek. Burada aynı anda odorant bağlı reseptör fare ORNs mevcut ve aksiyon potansiyelleri kaydetmek için emme pipet tekniği tarif.

Emme Pipet Tekniği kullanılarak Olfaktör Reseptör Nöronlar Kaydedilmiş odorant bağlı Cevapları

Bu video, bir siklik adenozin monofosfat (cAMP) biyosensörü ve lüminesans tespiti kullanarak transfekte edilmiş hücrelerde koku reseptörü aktivasyonunu ölçmek için kullanılan protokolü gösterir. Yöntem, koku alma nöronlarındaki reseptör-ligand etkileşimlerini ve sinyal yollarını incelemek için uygulanır.

Gerçek Zamanlı Döngüsel Adenozin Monofosfat Testi Kullanılarak Koku Reseptörü Aktivasyonunun Ölçülmesi

Kaynak: de March, C. A. et. al., Buhar Fazındaki Bir Koku Maddesi Tarafından Koku Reseptörü Aktivasyonunun Gerçek Zamanlı İn Vitro İzlenmesi. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, lüminesans ölçümü kullanarak rekombinant memeli hücrelerinde koku reseptörlerinin gerçek zamanlı aktivasyonunu izleme yöntemini göstermektedir. Koku bağlanması, G-protein aktivasyonunu ve cAMP üretimini tetikler, substrat bağlanması üzerine ışıldama yayan glosensör proteinlerini aktive eder ve reseptör yanıtının kantitatif bir...

Rekombinant hücrelerde koku reseptörü aktivasyonunun gerçek zamanlı izlenmesi

Dikey bir T-labirent salgılanan eklembacaklıların davranışsal tepki içlin tarif edilmektedir. Salgılanan iki potansiyel koku alanlara maruz kaldığında deneyci denekler tarafından gerçekleştirilen seçimler ölçmek için sağlar. Her ikisi için çekim ve koku maddesi arasından itme bu cihaz ile ölçülebilir.

Koku için Arthropod Tepki için Dikey T-labirent Seçim Testi

Koku reseptör aktivasyonu desenler koku kimliğini kodlamak, ancak memeli koku reseptörleri için Odorant ligandlar belirlenmesi yayınlanan verilerin eksikliği koku kodlama kapsamlı bir modelinin gelişmesini engellemektedir. Bu protokol, koku reseptör ligandları ve reseptör aktivasyonunun miktar yüksek throughput belirlenmesini kolaylaştırmak için bir yöntem tarif etmektedir.

Lusiferaz aktivitesi ile reseptör aktivasyonunun bir ölçümü: Memeli Koku reseptörünün yüksek throughput Analizi

Koku alma duyusal nöronlarının fizyolojik özelliklerini analiz etmek hala teknik sınırlamalarla karşı karşıyadır. Burada, gen hedefli farelerde koku alma epitelinin sağlam bir preparasyonu içinde delikli yama klempi yoluyla kaydediyoruz. Bu teknik, membran özelliklerinin karakterizasyonuna ve tanımlanmış koku alma reseptörlerini eksprese eden nöronların spesifik ligandlarına verilen yanıtlara izin verir.

Bozulmamış neuroepithelium Fare Koku Duyu Nöronlar Delikli Patch-kelepçe Kayıt: Bir Belirlenen Odorant Reseptör ifade Nöronlar Fonksiyonel Analiz

Işlev propil reseptörlerinin karakterize vazgeçilmez bir parçası deorphanization süreç içinde hizmet vermektedir. Biz gerçek zamanlı bir kamp tahlil kullanarak propil reseptörleri aktivasyonu ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Canlı hücre ölçüm propil reseptörü harekete geçirmek kullanımı gerçek zamanlı bir kamp tahlil

Bu iletişim kuralı Drosophila larva yanıt onun koku nöronlar eşzamanlı optogenetic uyarılması için gezinme davranışını analiz eder. 630 nm dalga boyunda ışık kırmızı kaymıştır kanal rhodopsin ifade bireysel koku nöronlar etkinleştirmek için kullanılır. Larva hareketi aynı anda izlenir, dijital olarak kaydedilmiş ve özel olarak yazılmış yazılım kullanılarak analiz.

Yanıt koku nöronlar Optogenetic uyarılması olarak Drosophila larva davranışını izlemek

Keşfedin buhar fazlı uyarım ile koku reseptörü aktivasyonunun gerçek zamanlı in vitro izlenmesi yöntemini. Bu teknik, koku algısı kinetiğini anlamak ve reseptör tabanlı biyosensörler geliştirmek için kullanılır.

Gerçek zamanlı olarak buharı aşamasında propil reseptör etkinleştirme bir propil tarafından in Vitro izlenmesi

Daha fazla video keşfet