Name: Drosophila Melanogasterde Sitrat Synthase Aktivitesinin Kolorimetrik Tsöplini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: Öğrenin, Drosophila melanogaster dokularında kolorimetrik yöntemle sitrat sentaz aktivitesini ölçerek mitokondrial kütleyi hızlıca değerlendirin. Bu protokol izolasyon gerektirmeden metabolik araştırmalar için güvenilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31401013 ve 31471010), Şangay Belediyesi Bilim ve Teknoloji Komisyonu, Şangay Pujiang Programı (14PJ1405900) ve Doğa Bilimleri Vakfı hibe tarafından desteklenmiştir Şangay (19ZR1446400).

1. D. melanogasteriçin Kolorimetrik Sitrat Synthase Aktivite Teşbesi16
<ol><li>Her örnek için on yetişkin sinek toplayın. Her genotip için en az üçe trilikat örnekleri toplayın.</li>
	<li>Her numune için 1,5 mL test tüpünde 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA ve %0,1 triton X-100 içeren 500 μL buz gibi ekstraksiyon tamponu hazırlayın.</li>
	<li>Anestezi pedüzerinde CO2 ile yetişkin sinekler anestezi ve istenilen dokuları izole. Yetişkin sinek toraksları izole etmek için, örneğin, forseps bir çift tarafından sinek toraks düzeltmek ve sonra bir makas kullanarak toraks ve karın sınırı boyunca keserek sinek karın izole. Kas sitrat synthase aktivite analizi için sinek toraks toplamak. NOT: Sitrat synthase aktivitesini normalleştirmek için kullanıyorsanız, bu adımda dokunun taze ağırlığını belirleyin.</li>
	<li>10 yetişkin sinek tothoraxes 100 μL buz gibi ekstraksiyon tampon hemen ve buz üzerinde bir havaneli ile homojenize aktarın. Örnekleri buz gibi tutmak için, örnekleri buz üzerinde 5-10 s homojenize edin, sonra numuneleri 5 s buzüzerinde bekletin ve tüpteki tüm dokular tamamen homojenleşene kadar tekrarlayın. NOT: Tüpü bantlayın, homojenlerde pıhtı olmadığından ve tüpteki dokuların tamamen homojenleştirilip homojenleştirilip kontrol edin. Tüm numune tedavileri buz üzerinde yapılmalıdır.</li>
	<li>Protein içeriği ölçümü için yeni bir tüpte her homojen örnek10 μL alın. Protein ölçümü için numuneleri buzüzerinde saklayın. NOT: Protein örnekleri daha sonra analiz için -80 °C'de dondurulabilir ve saklanabilir. Protein konsantrasyonları sitrat sintaz aktivitelerinin normalleştirilmesi için bir iç parametre görevi gösterir.</li>
	<li>Toplam hacmi 500 μL yapmak için kalan her numuneye 400 μL buz gibi çıkarma tamponu ekleyin. Her reaksiyon için, taze hazırlanmış reaksiyon çözeltisinin 150 μL'sine (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM DTNB, 0.3 mM asetil CoA, 1 mM oksoasetik asit) seyreltilmiş hücre listatını ekleyin. Kabarcık oluşumunu önleyerek, hafifçe boru lama ile iyice ve hemen karıştırın. Emiciliği 25 °C'de 4 dk için her 10-30 s'de 412 nm'de, minimum 10 s aralıklarla 412 nm'de ölçüm yapabilen bir plaka okuyucu suvedi. NOT: Farklı bir reaktifi pipetlemeden önce ucu değiştirin ve kuyularda kabarcıklar oluşmasını önleyebilirsiniz. Reaktiflerin eksik karıştırılması ölçümlerde farklılıklara neden olabilir. Sitrat synthase aktivitesi testi, numuneler toplandıktan hemen sonra oda sıcaklığında yapılmalıdır, çünkü bu test bozulmamış mitokondriyal kütleyi ölçmek için kullanılır. Reaksiyon arabelleği kullanımdan hemen önce hazırlanmalı ve depolanmamalıdır.</li>
	<li>Verileri optik yoğunluk (OD) emicilik (abs) (Y ekseni) ile zaman (dakika içinde) (X ekseni) olarak çizin. Daha sonra eğrinin doğrusal kısmının eğimini hesaplayın, reaksiyon oranı <img src="/files/ftp_upload/59454/59454eq1.jpg"> Sitrat synthase aktivitesini normalleştirmek için değeri örnek protein konsantrasyonuna bölün. Sitrat synthase etkinliği, <img src="/files/ftp_upload/59454/59454eq2.jpg"> NOT: Örnek protein konsantrasyonu bir protein konsantrasyonu test kiti ile ölçülebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Yee, C., Yang, W., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intrinsic+apoptosis+pathway+mediates+the+pro-longevity+response+to+mitochondrial+ROS+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The intrinsic apoptosis pathway mediates the pro-longevity response to mitochondrial ROS in C. elegans.</a> Cell. 157 (4), 897-909 (2014).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (4), 1453-1466 (2015).</li>
<li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li>
<li>Hekimi, S., Wang, Y., Noe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ROS+and+the+Effectors+of+the+Intrinsic+Apoptotic+Pathway+in+Aging+Cells%3A+The+Discerning+Killers%21%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ROS and the Effectors of the Intrinsic Apoptotic Pathway in Aging Cells: The Discerning Killers!</a> Frontiers in Genetics. 7, 161(2016).</li>
<li>Kim, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Biosynthesis+Coordinates+a+Mitochondrial-to-Cytosolic+Stress+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid Biosynthesis Coordinates a Mitochondrial-to-Cytosolic Stress Response.</a> Cell. 166 (6), 1539-1552 (2016).</li>
<li>Wang, Y., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+longevity+in+animals%3A+Untangling+the+knot%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and longevity in animals: Untangling the knot.</a> Science. 350 (6265), 1204-1207 (2015).</li>
<li>Ray, A., Martinez, B. A., Berkowitz, L. A., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction%2C+oxidative+stress%2C+and+neurodegeneration+elicited+by+a+bacterial+metabolite+in+a+C.+elegans+Parkinson%27s+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction, oxidative stress, and neurodegeneration elicited by a bacterial metabolite in a C. elegans Parkinson's model.</a> Cell Death & Disease. 5, e984(2014).</li>
<li>Tronstad, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+quantification+of+cellular+mitochondrial+morphology+and+content%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Regulation and quantification of cellular mitochondrial morphology and content.</a> Current Pharmaceutical Design. 20 (35), 5634-5652 (2014).</li>
<li>Wiegand, G., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Citrate+synthase%3A+structure%2C+control%2C+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Citrate synthase: structure, control, and mechanism.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 15, 97-117 (1986).</li>
<li>Lopez-Lluch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorie+restriction+induces+mitochondrial+biogenesis+and+bioenergetic+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calorie restriction induces mitochondrial biogenesis and bioenergetic efficiency.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (6), 1768-1773 (2006).</li>
<li>MacInnis, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superior+mitochondrial+adaptations+in+human+skeletal+muscle+after+interval+compared+to+continuous+single-leg+cycling+matched+for+total+work%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work.</a> Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).</li>
<li>Gillen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twelve+Weeks+of+Sprint+Interval+Training+Improves+Indices+of+Cardiometabolic+Health+Similar+to+Traditional+Endurance+Training+despite+a+Five-Fold+Lower+Exercise+Volume+and+Time+Commitment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Twelve Weeks of Sprint Interval Training Improves Indices of Cardiometabolic Health Similar to Traditional Endurance Training despite a Five-Fold Lower Exercise Volume and Time Commitment.</a> PLoS One. 11 (4), e0154075(2016).</li>
<li>Mukherjee, S., Basar, M. A., Davis, C., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+functional+similarities+and+divergences+between+Drosophila+Spargel%2FdPGC-1+and+mammalian+PGC-1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Emerging functional similarities and divergences between Drosophila Spargel/dPGC-1 and mammalian PGC-1 protein.</a> Frontiers in Genetics. 5, 216(2014).</li>
<li>Mukherjee, S., Duttaroy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spargel%2FdPGC-1+is+a+new+downstream+effector+in+the+insulin-TOR+signaling+pathway+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Spargel/dPGC-1 is a new downstream effector in the insulin-TOR signaling pathway in Drosophila.</a> Genetics. 195 (2), 433-441 (2013).</li>
<li>Diop, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGC-1%2FSpargel+Counteracts+High-Fat-Diet-Induced+Obesity+and+Cardiac+Lipotoxicity+Downstream+of+TOR+and+Brummer+ATGL+Lipase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase.</a> Cell Reports. 10 (9), 1572-1584 (2015).</li>
<li>Rera, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+longevity+and+tissue+homeostasis+by+the+Drosophila+PGC-1+homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Modulation of longevity and tissue homeostasis by the Drosophila PGC-1 homolog.</a> Cell Metabolism. 14 (5), 623-634 (2011).</li>
<li>Wei, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF34+modulates+the+mitochondrial+biogenesis+and+exercise+capacity+in+muscle+and+lipid+metabolism+through+ubiquitination+of+PGC-1+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">RNF34 modulates the mitochondrial biogenesis and exercise capacity in muscle and lipid metabolism through ubiquitination of PGC-1 in Drosophila.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50 (10), 1038-1046 (2018).</li>
<li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for studying metabolism in Drosophila.</a> Methods. 68 (1), 105-115 (2014).</li>
<li>Bosco, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+oxygen+concentration+and+pressure+on+Drosophila+melanogaster%3A+oxidative+stress%2C+mitochondrial+activity%2C+and+survivorship%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of oxygen concentration and pressure on Drosophila melanogaster: oxidative stress, mitochondrial activity, and survivorship.</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 88 (4), 222-234 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması beyan etmezler.

Bir model olarak Drosophila kullanarak Metabolik çalışmalar dikkate genetik arka plan, diyet almak gerekir, ve sineklerin stok bakım18. Farklı genetik arka planların sitrat sintaz aktivitesinin ölçümü üzerindeki etkilerini önlemek için, Drosophila'nın farklı suşları 10 nesil boyunca kontrol etütlerine geri geçilmelidir. Deneylerimizde kullanılan tüm Drosophila suşlarının genetik arka planı w1118'dir,bu yüzden w1118'i kontrol olara...

Mitokondri en iyi enerji para birimi, ATP, trikarboksilik asit döngüsü (yani, Krebs döngüsü) ve oksidatif fosforilasyon yoluyla üretmek çoğu ökaryotik organizmalar, güç üreten organeller olarak bilinir. Mitokondri de apoptoz1düzenlenmesi gibi diğer fizyolojik süreçlerin bir çok önemli rol oynadığı bulunmuştur, Ca2 + homeostazı2,3, reaktif oksidasyon türleri (ROS) nesil4, ve endoplazmik retikulum (ER)-stres yanıtı5. Mitokondriyal disfonksiyon herhangi bir yaşta vücutta herhangi bir organı etkileyebilir ve metabolik birincil nedenidir, yaşlanma ile ilgili6, ve nörodejeneratif hastalıklar7. Bozulmamış mitokondri mekanistik mitokondriyal fonksiyon ile ilgilidir. Bu nedenle, bozulmamış mitokondriyal kütlenin doğru nicelleştirilmesi mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi için çok önemlidir8. Sitrat synthase, trikarboksilik asit döngüsünün ilk adımda bir oran sınırlayıcı enzim9, ökaryotik hücreler içinde mitokondriyal matris lokalize, ve böylece bozulmamış mitokondriyal kitle nin varlığı için bir nicel belirteç olarak kullanılabilir9,10. Sitrat sintaz aktivitesi de bozulmamış mitokondriyal proteinler için bir normalleşme faktörü olarak kullanılabilir11,12.
Meyve sinek, Drosophila melanogaster, mitokondriyal fonksiyon eğitimi için mükemmel bir model sistemidir, mitokondri de önemli roller oynayan birçok molekül ve yollar evrimsel olarak Insanlara Drosophila korunur13,14,15. Burada, Drosophila dokusunda kolorimetrik bir test ile sitrat synthase aktivitesinin ölçülmesi için hızlı ve basit bir yöntem için bir protokol savuruyoruz16 iyi plaka biçiminde homojen. Sitrat synthase aktivite sintaz, Drosophila doku homojenate sitrat synthase asetil koenzim A ile oksaloasetat reaksiyonu katalizler (asetil CoA) sitrat CoA-SH ve H+oluşturmak için . CoA-SH daha sonra 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoik asit) (DTNB) ile reaksiyona girarak 412 nm'de spektrofotometrik olarak kolayca ölçülebilen renkli bir ürün olan 2-nitro-5-tiobenzoat (TNB) üretir. Sitrat synthase aktivitesi renk üretim hızı ile yansıtılabilir.

<table><tbody><tr><td>2- [4- (2-Hidroksietil) -1-piperazinil] etansülfonik asit (HEPES)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>V900477</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-2- (hidroksimetil) -1,3-propandiol (TRIZMA Bazı)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>V900483</td><td></td></tr><tr><td>Asetil-CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2181</td><td></td></tr><tr><td>Ditio-bis-nitrobenzoik asit (DTNB)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900106</td><td></td></tr><tr><td>Oksaloasetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4126</td><td></td></tr><tr><td>Pelet havaneli</td><td>Sangon</td><td>F619072</td><td></td></tr><tr><td>Pelet havaneli motoru</td><td>Tiangen</td><td>OSE-Y10</td><td></td></tr><tr><td>Plaka okuyucu</td><td>BioTek</td><td>Eon</td><td></td></tr><tr><td>Protein BCA Test kiti</td><td>Beyotime</td><td>P0010S</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>WPI</td><td>14124</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sangon</td><td>A110694-0100</td><td></td></tr></tbody></table>

drosophila melanogaster'de sitrat synthase aktivitesinin kolorimetrik tsöplini

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Mitokondri oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üreterek ve çeşitli fizyolojik süreçleri düzenleyerek hücresel metabolizmada en önemli rolleri oynar. Mitokondriyal disfonksiyon metabolik ve nörodejeneratif hastalıkların bir dizi birincil nedenidir. Bozulmamış mitokondri onların düzgün çalışması için kritik öneme sahiptir. Enzim sitrat sintaz mitokondriyal matriks lokalize ve böylece bozulmamış mitokondriyal kitlenin bir nicel enzim belirteci olarak kullanılabilir. Mitokondri önemli işlevleri olan birçok molekül ve yollar son derece insanlar ve Drosophilaarasında korunmuş olduğu göz önüne alındığında , ve güçlü genetik araçlar bir dizi Drosophilamevcuttur , Drosophila mitokondriyal fonksiyonu incelemek için iyi bir model sistemi olarak hizmet vermektedir. Burada, mitokondriyi izole etmeden yetişkin sineklerinden homojen dokudaki sitrat sintaz aktivitesinin hızlı ve basit ölçümü için bir protokol sıyoruz. Bu protokol aynı zamanda larvalar, kültürlü hücreler ve memeli dokularında sitrat synthase aktivitesini ölçmek için de uygundur.

Şekil 1, farklı genotiplerin Drosophila toraks dokusu homojenatlarını ölçmek için sitrat sintaz aktivitesi kolorimetrik töz kullanılarak elde edilen 412 nm'de OD absorbansı için kinetik eğrilerin bir örneğini sunar. PGC-1α'nın mitokondriyal biyogenezin ana düzenleyicisi olduğu bilinmektedir. PGC-1α, Drosophila ve insanlar arasında fonksiyonel olarak korunur. Drosophila RNF34 (dRNF34) Drosophila PGC-1α, dPGC-1 için bir E3 ub...

Drosophila doku homojenlerinde bozulmamış mitokondriyal kütlenin nicelleştirilmesi için sitrat sintaz aktivitesinin kolorimetrik testi için bir protokol sönmesin.

Drosophila Melanogaster'de Sitrat Synthase Aktivitesinin Kolorimetrik Tsöplini

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

Drosophila mitokondriyal fonksiyon eğitimi için iyi bir model sistemi olarak hizmet vermektedir. Burada yetişkin sineklerden homojen dokudaki sitrat sintaz aktivitesini ölçmek için bir protokol salıyoruz. Bu protokol mitokondri izolasyon gerektirmez.Hızlı ve basittir ve larvalarda, kültürlü hücrelerde ve memeli dokularında sitrat sintaz aktivitesini ölçmek için uygundur. Her örnek için yetişkin sinekler toplayarak başlayın, her genotip için en az üç aylili örnekler toplamak için emin olun. Her numune için 1,5 mililitrelik bir test tüpünde 20 milimolar HEPES, bir milimolar EDTA ve %0,1 triton X-100 içeren 500 mikrolitre buz gibi ekstraksiyon tamponu hazırlayın.Anestezi pedinde karbondioksit le yetişkin sineklerini anesthetize edin. Toraks izole etmek için, bir çift forceps ile düzeltmek ve bir makas ile toraks ve karın sınırı boyunca keserek sinek karın izole. Sitrat synthase aktivite analizi için sinek toraks toplamak.10 yetişkin sinek tothoraxes buz gibi ekstraksiyon tampon 100 mikrolitre hemen aktarın ve buz üzerinde bir havaneli ile homojenize. Buzüzerinde 5-10 saniye homojenize ederek numuneleri soğuk tutun, beş saniye boyunca buzun üzerinde bekletin, sonra tüm dokular tamamen homojenize olana kadar tekrarlayın. Aliquot 10 mikrolitre her homojenize örnek protein içeriği ölçümü için yeni bir tüp içine, buz da bu tüpler tutarak.Toplam hacmi 500 mikrolitre ve pipet yavaşça karıştırmak için kalan her numuneye 400 mikrolitre buz gibi çıkarma tamponu ekleyin. Her reaksiyon için, yeni hazırlanmış reaksiyon çözeltisinin 150 mikrolitresine bir mikrolitre seyreltilmiş hücre lisat ekleyin. Kabarcık oluşumunu önlemek için emin, yavaşça pipetleme tarafından iyice karıştırın, sonra 25 derece santigrat dört dakika boyunca her 10 ila 30 saniyede 412 nanometre emici ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.Verileri zaman içinde emici olarak çizin ve eğrinin doğrusal kısmının eğimini hesaplayın. Son olarak, sitrat synthase aktivitesini normalleştirmek için reaksiyon hızını veya eğimi örnek protein konsantrasyonu ile bölün. Drosophila kasdrNF34 knockdown dPGC-1 nakavt bu artışı tersine çevirecek iken mitokondriyal sitrat sitrat aktivitesini artıracağı varsayımında idi.Her bir töz için başlangıç lineer enzimatik oran oluşturulmuştur;eğilim çizgilerinin eğimleri, farklı genotiplerin maksimal sitrat sintaz aktivitelerine eşdeğer olan maksimal reaksiyon oranlarını temsil eder. Maksimal sitrat sintaz aktiviteleri kinetik eğrilerden hesaplandı ve protein konsantrasyonu ile normalleştirildi. Sonuçlar, sinek torakslarının sintaz aktivitesinin kaslara özgü dRNF34 nakavtı ile arttığını ve artışın kaslara özgü dPGC-1 nakavtı ile tersine çevrildiğini göstermiştir.Numuneyi homojenize ederken, pıhtı olmadığından ve tüpteki dokuların tamamen homojenleştirildiğinden emin olmak için tüpün ucunun ucu ve homojenin kontrol etmesi önemlidir. Numune nin toplanmasından sonra tüm numune tedavileri buz üzerinde yapılmalıdır. Sitrat synthase aktivitesi testi bozulmamış mitokondriyal kütleyi ölçmek için kullanılır.Bozulmamış mitokondriyal kütlenin doğru nicelleştirilmesi mitokondriyal fonksiyonun değerlendirilmesi için çok önemlidir.

a-colorimetric-assay-citrate-synthase-activity-drosophila

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Drosophila melanogaster bir yüzyıl 1 aşkın süredir birçok önemli biyolojik işlemlerin moleküler ve hücresel temelini anlamak için kullanılan bir genetik ve davranışsal uysal modeli sistemidir. Drosophila iyi sinek davranışının genetik temeli içgörü kazanmak için istismar edilmiştir.

Test için Yöntemler Drosophila Davranış

Bu videoda, Drosophila'nın doku homojenatında bulunan mitokondriyal sitrat sentaz aktivite testini ölçmek için bir kolorimetrik test açıklanmaktadır.

Sitrat Sentaz Aktivite Testi: Drosophila Doku Homojenatında Mitokondriyal Sitrat Sentaz Aktivitesini Ölçmek İçin Kolorimetrik Bir Test

Gelişmekte olan embriyoya Drosophila küçük moleküllerin giriş yeni bileşikler, ilaçlar, toksinler ve biyolojik aktivitesini karakterize edici hem de temel geliştirme yolunu tarama için büyük bir potansiyel sunmaktadır. Açıklanan yöntemler burada Drosophila embriyo modelin programını genişleterek, bu yaklaşımın doğal engelleri aşmak adımları özetlemektedir.

Geçirgenliği için bir yöntem<em&gt; Drosophila</emKüçük Molekül Faaliyet Tahliller için&gt; Embriyolar

Bu makale, Drosophila melanogaster'de yakıt oksidasyonunun ölçümü için eser miktarda spesifik radyoaktif işaretli metabolik substratların sineklere beslendiği bir yöntemi açıklamaktadır. Yakıt oksidasyonundan üretilen solunan radyoaktif işaretli CO2 toplanır ve ölçülür.

Radyoaktif Yüzeyler Karbon Dioksit Üretimi ölçümü<em&gt; Drosophila melanogaster</em

CApillary FEeder (CAFE) testi, gıda alımının altında yatan mekanizmaları araştırmak için basit, bütçe dostu, son derece güvenilir bir yöntemdir. Çok yönlü genetik model organizma Drosophila melanogaster ile birlikte kullanıldığında, gıda alımının düzenleyici mekanizmaları hakkında yeni bilgiler edinmenin güçlü bir yolunu sunar.

Kılcal Besleyici Testi Gıda Alımını içinde Tedbirler<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Hücresel iyon taşıma kez değerlendirilen hücre içi pH izleyerek (pHben). Genetik olarak kodlanmış pH-göstergeler (GEpHIs) olduğu gibi hücrelerde hücre içi pH optik miktar sağlar. Bu iletişim kuralı aracılığıyla hücresel ex vivo canlı görüntüleme, Drosophila melanogaster Malpighi tübüllerin pHerry ile hücre içi pH miktar detayları, sözde ratiometric genetik olarak kodlanmış pH göstergesi.

Drosophila melanogaster Malpighi tübül epiteli optik Quantification intrasellüler pH floresan genetik olarak kodlanmış pH göstergesi

Hipoksi normal atmosferik oksijen düzeyleri altında karşılaşan Drosophila melanogaster larva tanımlamak için basit bir tahlil protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı tembellik veya yavaş büyüme gibi örtüşen fenotipleri göstermek başka mutantlar dan ayırt edici olmak hipoksik larva sağlar.

Bir oyuk/tünel tahlil için algılama hipoksi Drosophila melanogaster larva içinde

Bu yazıda, oksijen tüketimi yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri Drosophila permeabilized thoraxes içinde kullanarak ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu teknik doku klasik mitokondrial yalıtım tekniği için karşılaştırıldığında çok az bir miktar gerektirir ve elde edilen sonuçlar daha fizyolojik ilgilidir.

Doku çok az miktarda kullanarak Drosophila Permeabilized liflerinin mitokondrial oksijen harcama ölçme noktalar

Biz oksijen tüketimi ve Drosophila melanogaster larva ve yetişkin Beynindeki hücre dışı asitleştirme ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bir metabolik analyzer adapte ve en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı ile kullanılmaktadır. Mikro-doku bağlar bu protokolü kritik bileşenidir ve tasarlanmış ve bunların kullanımı bu analizi için özel olarak yaratılmıştır.

Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

Bu iletişim kuralı bir hücre tanıma ve mikrobiyal enfeksiyonlar Gümrükleme ölçmek için yetişkin Drosophila melanogaster içinde vivo fagositoz tahlil açıklar.

Bir In Vivo fagositoz tahlil kullanarak Drosophila melanogaster, meyve sineği hücresel bağışıklık yanıtı değerlendirirken

Kulometrik respirometri, küçük organizmaların metabolik hızını ölçmek için idealdir. Bu çalışmada Drosophila melanogaster için uyarlandığında, ölçülenO2 tüketimi, önceki çalışmalarda vahşi tip D. melanogaster için bildirilen aralık içindeydi. Daha küçük ve daha az aktif olan CASK mutantları tarafından sinek başınaO2 tüketimi, vahşi tipten önemli ölçüde daha düşüktü.

Kulometrik Mikrorespirometri Kullanılarak Drosophila melanogaster'de O2 Tüketiminin Ölçülmesi

Öğrenin, Drosophila melanogaster dokularında kolorimetrik yöntemle sitrat sentaz aktivitesini ölçerek mitokondrial kütleyi hızlıca değerlendirin. Bu protokol izolasyon gerektirmeden metabolik araştırmalar için güvenilir sonuçlar sunar.

Drosophila Melanogaster'de Sitrat Synthase Aktivitesinin Kolorimetrik Tsöplini

Daha fazla video keşfet