Doku ve kütle spektrometresi Imaging kullanarak hücreleri arasında küçük molekül iletişim yakalama

Protokolümüz hücreler ve dokular arasındaki küçük moleküllü kimyasal iletişimi haritalayabilir ve bunu özellikle yumurtalık kanseri metatezindeki küçük molekülleri keşfetmek için uyguladık. Tekniğimizin en büyük avantajı, küçük molekülleri etiketsiz bir şekilde ölçebilme ve hücrelerin ve dokuların 2Boyutlu uzamsal bütünlüğünü koruyabilme yeteneğidir. Bu teknik bize hedefsiz bir şekilde yumurtalık kanseri metastazküçük moleküllerin katkısını sorgulamak için izin verdi.

Bu daha önce gözden kaçan yeni terapötik hedefler ve yollar ortaya olabilir. Bu metodoloji kolayca agarose ve bir mekansal bileşeni ortaya çıkan hücresel fenotip için önemli olabilir başka bir hastalık yetiştirilebilir diğer kanserler için uzatılabilir. Tüm hücrelerin ve bileşenlerin elde olmasını sağlamak ve kurutma işlemine sabır sağlamak bu protokol için gereklidir.

Acele bir kurutma adımı genellikle düşük kaliteli kütle spektrometresi verilerine yol açabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, agar üzerinde doku veya mikrop kullanan tipik görüntüleme kütle spektrometresi deneylerinden büyük ölçüde saptırDığı için, örnek hazırlama ve kurutma adımlarımızı anlamada yararlıdır. Başlamak için, bir sıcak plaka üzerinde 70 santigrat derece agarose sıvılaştırmak.

Sekiz iyi bölücüyü ITO ile tedavi edilen kaydıranın üzerine yerleştirin. Standart tripsin tedavisi ile, 15 mililitrelik konik tüp, santrifüj MOE hücreleri toplamak ve 150 mikrolitre başına 50, 000 hücre konsantrasyonu elde etmek için resuspend bir kez DMEM medya ekleyin, hangi iki kez nihai yoğunluğu istenen. Bölünmemiş cocultures için, dört kuyunun merkezine yumurtalık ekstrüzyonu eklemek için forseps kullanın.

Kaplamahemen önce, hücre süspansiyon 200 mikrolitre ve tek tek iki mililitre tüpler sıvılaştırılmış agarose 200 mikrolitre birleştirir. Pipetleme sırasında hava kabarcıkları kaçının. Hemen, her kuyuya hücre-agarose karışımının 300 mikrolitresini ekleyin ve kuyular arasında sızıntı veya karıştırma olmaması nı sağlamak için bölücüye sürekli hafif aşağı doğru basınç uygulayın.

Hiçbir hava kabarcıkları ve yumurtalık kuyunun merkezinde kalır olduğundan emin olun. Pipetli agarose yumurtalık rahatsız varsa, yavaşça agarose soğumadan önce ortalamak için pipet ucu kullanın. Daha sonra, 37 santigrat derece ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde% 5 karbondioksit slayt kuluçka.

Bölünmüş cocultures için, ince, pürüzsüz plastik ten bölücüler kesti. Steril, tek kullanımlık bir ortam havzasının kenarları kullanılır. Kuyunun hipotenüse sığacak kadar geniş kesin.

Sekiz iyi bölücüyü ITO ile işlenmiş kaydıranın üzerine yerleştirin ve plastik bölücüleri çapraz olarak kuyulara yerleştirin. Hücre kültürlerini daha önce olduğu gibi hazırlayın ve 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ve 100 mikrolitre sıvılaştırılmış agarose'u iki mililitrelik bir tüpte birleştirin. Hemen, bölücü üzerinde aşağı doğru basınç tutarken bölücü bir tarafında hücre-agarose karışımı plaka 150 mikrolitre.

Agarose'un yaklaşık bir dakika soğumasını ve katılamasını bekleyin ve bölücüyü çıkarın. Kuyunun boş yarısının ortasına yumurtalık ekstrüzyonu yerleştirmek için forceps kullanın. Yumurtalık üstüne hücre-agarose karışımı 150 mikrolitre ekleyin.

37 santigrat derece ve nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde% 5 karbondioksit slayt kuluçka. Dört gün sonra, agarose fişleri oda bölücü çıkarın. Düz bir spatula ile, odadan agarose tarafayırmak ve yavaşça yukarı oda çekin.

Herhangi bir agarose fişleri taşınırsa, yavaşça birbirlerine dokunmadan onları yeniden konumlandırın. Slama işlemini yaklaşık dört saat boyunca 37 derecelik bir fırına yerleştirin ve numune boyunca ısı dağılımını eşit olarak sağlamak için saatte 90 derece döndürün. Slayt tamamen kurutulmalıdır.

Aksi takdirde, MALDI-TOF kütle spektrometresinin yüksek vakum ortamında numunenin patlamasına yol açabilir. Kaydıraktan kurutma ve ilerlemenin izlenmesi, yüksek uzamsal çözünürlük ve kaliteli kütle spektrumları elde etmek için en kritik adımdır. Pullanma veya aşırı kırışıklık oluşursa, kütle spektrometresi verilerinin toplanması önermiyoruz.

Matris püskürtücüüzerine ayarlanan parametrelerle, slayta matris çözeltisi uygulayın. Fosfor Kırmızısı'nı kalıtım olarak kullanmak için, slayttaki net bir noktaya bir mikrolitre Fosfor Kırmızısı ekleyin. Peptit karışımını kalibrasyon olarak kullanmak için, iyonizasyona yardımcı olmak için parafilm üzerindeki matrisle bire bir oranında karıştırın ve slaytüzerine 0,5 ila bir mikrolitre nokta.

Kütle spektrometresi veri toplama görüntüleme den önce kalibrantın kurumasını bekleyin. Slaytın her köşesinde kalıcı bir işaretleyici kullanarak bir X çizin ve 1200 dpi'de bir kamera veya tarayıcı kullanarak optik görüntü çekin. Bu deneyde, fırında slayt dikkatli izlenmesi agarose yüzeyinde en az ve hiçbir kırışıklık ile düz kurutulmuş örnek ile sonuçlanır optimum kurutulmuş ITO slayt sağlamak için gereklidir.

Bu rakam kaçınılması gereken kırışıklıkları gösterir. Kırışıklıklar yüksekliği ve dolayısıyla görüntüleme kütle spektrometresi sinyallerinin kütle doğruluğunu biraz etkileyebilir. Hafif kırışıklıklar verilerin kalitesini etkilemez.

En iyi şekilde konumlanmış bir doku mümkün olduğunca merkeze yakın olmalıdır. ImS verilerinin elde edilmesikenar etkilerle kirlenmemesi için bölünmüş sayılmaması halinde kullanılan doku kuyunun merkezinde veya yarım üçgenin ortasında olmalıdır. Kötü konumlandırılmış doku, görüntülendiğinde, kenar etkileri yanlış kitle sinyalleri neden olabilir.

Kurutulmuş slayt görüntüsü, MALDI-TOF kütle spektrometresine hangi bölgelerin görüntülenemesini öğretmek için kullanılır. 50 mikrometrede IMS için yumurtalık dokusu çevresindeki küçük bölgeler seçilmiştir. Bölünmüş ortak kültürlerin yanı sıra bölünmüş oda kurulumu için m-over-z sinyalinin temsili bir görüntüsü gösterilir.

Unutulmaması gereken en önemli şey, elde edilen verilerin yalnızca örnek hazırlama kadar iyi olduğudur. Kurutma işlemine özellikle dikkat edin. En heyecan verici yönü, etkili konsantrasyon hakkında bilgilendirmek ve insan biyolojisine çevirmek için istila tahlilleri veya kolonizasyon tahlilleri gibi diğer deneyler kullanarak bu şekilde keşfedilen küçük molekülleri doğrulamaktır.

Bunun yumurtalık kanserinin primer metatezindeki süreçleri daha iyi anlayarak yumurtalık kanseri için potansiyel tedavi hedeflerinin yeni yollarını keşfetmenin önünü açacağını ugörüyoruz.