Yeşil Alga Chlamydomonas reinhardtii eşitlenmiş kültürlerin derinlemesine analizi için Multi-Omics ekstraksiyon yöntemi

Sistem çapında yapılan çalışmalar, biyolojik fonksiyonların derinlemesine anlaşılması için çok önemlidir. Ancak, farklı omics platformları için birden fazla bağımsız örnek gereklidir ve verilerde yüksek miktarda değişkenlik sağlar. Bu yöntem klorofil, lipidler, metabolitler, proteinler ve nişasta modeli yeşil yosun, Chlamydomonas reinhardtii tek bir örnek eşzamanlı çıkarma için sağlam ve yüksek iş lenme stratejisi sunuyor.

Klorofil için, lipid, ve metabolit ekstraksiyon, sıvı azot hasat Chlamydomonas hücre pelet tüpleri düzenlemek. 20 derece çıkarma tampon bir mililitre ile her tüp pelet resuspend. Düşük viskozite çıkarma tamponunun buharlaşmasını önlemek için, hücreler ekstraksiyon karışımı içinde iyi homojenize olana kadar tüpleri hızlı bir şekilde girdaplayın ve çözeltiyi iki mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine dönüştürün.

10 dakika boyunca buz gibi suda bir sonication banyoda kültürlersonicate 1,000 dört santigrat derece de dakikada 60 dakika dönmeleri yörüngeshake üzerinde kuluçka önce. Kuluçka sonunda, ekstraksiyon tampon iki 650 mikrolitre ekleyin ve kısaca santrifüj önce örnekleri girdap. Kesirleri aliquot için, etiketli 1.5 mililitrelik tüp içine üst MTBE lipid faz500 mikrolitre aktarın.

Lipid fazını kaldırmak ve alt kutup ve yarı kutupmetabolit evresinin 650 mikrolitresini yeni etiketli tüplere aktarmak için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Kalan alt fazkaldırmak için fazla hacim aspire ve 80 derece depolama için sıvı azot katı pelet dondurmak. Polar metabolit tayini için, karbonil gruplarının metoksimizasyonu için metoksin hidroklorür piridine çözeltisindeki kutup fazının kurutulmuş peletini yeniden askıya alın ve numuneleri 30 derecede 90 dakika ısıtın.

Kuluçka sonunda, n-metil-n-trifluoracetamide ile 30 dakika boyunca 37 santigrat derece standart protokollere göre örnekleri türemiş. Birincil metabolitleri analiz etmek için uçuş zamanı kütle spektrometresi ile birleşen gaz kromatografisini kullanın. Nonpolar metabolit tayini için, 7-3 hacimli bir karışım halinde kutupsal olmayan fazın kurutulmuş peletini isopropanol hacimli bir karışımla yeniden askıya alın ve peletleri santrifüj le çökün.

Daha sonra ultraperformans sıvı kromatografi sistemi üzerinde ters faz C8 sütun üzerinde örnekleri ayırın. Klorofil içeriğitinin tayini için, MTBE fazının 100 mikrolitresini, deneysel numunelerin yanı sıra metod için %90 metanol 900 mikrolitre ile karıştırın. Daha sonra klorofil a ve klorofil b'yi ayırt etmek için 655 ve 652 nanometre dalga boylarındaki bir spektrofotometredeki emiciliği ölçün ve klorofil a ve b içeriğini ve toplam klorofil içeriğini hesaplayın.

Protein ekstraksiyonu için, alt faz peletini 200 mikrolitre protein tamponu içinde çözünve numuneyi oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, numuneyi santrifüj edin ve protein içeren süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Bradford tsayını kullanarak protein konsantrasyonu ölçün.

Proteini sindirmek için, numunenin 15 mikrogramını beş milimolar dithiothreitol'de 30 dakika azaltın, ardından 10 milimolar iodoacetamid ile oda sıcaklığında 30 dakika alkilleme, ışıktan korunarak. Alkilinin sonunda Trypsin/Lys-C çözeltisini 25-1 proteinle karıştırın ve numuneyi 37 santigrat derecede üç saat kuluçkaya yatırın. 37 santigrat derecede bir gecede kuluçka için 50 milimolar tris Hcl örnek altı kat seyreltin.

Ertesi sabah, trifloroasetik asit ile sindirimi %0,5 ila %1'lik son konsantrasyona sonlandırın, numuneleri kuruluğun yakınına yoğunlaştırın ve ısıtmadan iki ila beş mikrolitre çözelti bırakın. Yükleme arabelleğindeki numuneyi yeniden askıya alın. Nano ultra basınçlı sıvı kromatografi sistemine bağlı yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi kullanarak sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi ile peptit karışımlarını analiz edin.

Peptitleri ayırmak için, 75 mikrometre lik iç çapı ve 1,7 mikrometre lik parçacık boyutuna sahip 20 santimetrelik ters faz yüklü yüzey hibrid sütununa dört mikrolitre numune yükleyin. Döngü sütunla çevrimiçi konuma kaydırılmadan önce 14 dakika tutulan, b'nin %3'ü kadar bir izokratik degrade kümesiyle kısmi döngü çevrimdışı ayarlarını kullanın ve bundan sonra degrade %20 arabellek B'ye ulaşılına kadar 50 dakika boyunca doğrusal olarak artırılır. Hücre hacminde bir kayma, hücreler ışık fazı boyunca boyut olarak büyüdükçe gözlemlenebilir, ardından ışık fazının sonundan itibaren 10 saat içinde kız hücrelerin salınımı başlar.

Tüm kız hücreleri serbest bırakıldıktan sonra, hücre hacminde bir kayma gözlemlenebilir, yeni yayımlanan kız hücreleri bir sonraki döngüye başlamak için bertaraf olarak. Polar fraksiyonun gaz kromatografisi kütle spektrometresi analizine dayanarak, bu temsili deneyde 65 metabolit açıklamalı olarak eklenmiştir. Lipit içeren nötr fazın sıvı kromatografi kütle spektrometresi analizi, çeşitli lipid sınıflarını kapsayan 204 farklı lipid türünün tanımlanmasına yol açmıştır.

Temel bileşen analizi, hücre döngüsü boyunca metabolit ve lipidler deki küresel değişimleri, açık ve karanlık evrelerin ayrılması ve hem metabolomik hem de lipidomik veriler için gözlenen yarı döngüsel evreleri görselleştirmek için kullanılabilir. Burada 2, 463 tanımlanan zenginleştirilmiş proteinlerin fonksiyonel zenginleşmesine genel bir bakış gösterilmiştir. Protein ekstraksiyonundan sonra kalan pelet, çeşitli kopyalar arasındaki düşük standart sapmaile gösterildiği gibi nişastanın tekrarlanabilir niceliği için kullanılabilir.

Bu, çözücüdeki klorofil düzeylerini etkileyerek numunelerin normalizasyon faktörlerini etkileyebildiği için üst klorofil organik fazının kurumasını önlemek önemlidir. Çıkarılan moleküler türlerin biyokimyasal karakterizasyonu için çeşitli analitik prosedürler uygulanabilir.