Damlacık dijital tuzak (ddTRAP): telomere tekrar amplifikasyon protokolünün droplet dijital polimeraz zincir reaksiyonuna adaptasyon

DdTRAP analizi, hücrelerdeki telomeraz enzimatik aktivitesinin hassas, sağlam ve yüksek nicel ölçümlerini elde etme olanağı sağlar. Orta iş yapma lı bir modada her çalışan için 96 örneğe kadar çalışma yeteneği bize büyük bir avantaj sunuyor. Toplanan veriler üzerinde uygun istatistiksel analiz için kontrolleri ve kopyaları çalıştırabiliriz.

Hücre lising hemen önce, NP-40 lysis tampon dondurulmuş bir aliquot çözültün. Çözüldükten sonra, buz üzerinde lysis tampon yerleştirin. 0.2 milimolar nihai konsantrasyonulaşmak için NP-40 lysis tampon PMSF proteaz inhibitörü ekleyin.

Daha sonra, mikrolitre başına 25.000 hücre denkliği ulaşmak için bir hücre pelet içeren tüp için lysis tampon 40 mikrolitre ekleyin. Hücreleri açmak için yavaşça yukarı ve aşağı lysate pipet. Kabarcıklar yapmaktan kaçınmaya çalışın.

Hücrelerin 30 dakika boyunca buzüzerinde lyse izin verin. Hücre enkaz kümelerinin oluşmasını önlemek için her 10 dakikada bir lysate'yi yavaşça girdaplayın. Hücre lisis sırasında, telomeraz uzatma reaksiyonu için bir mikrosantrifüj tüp bir ana karışımı hazırlamak ve buz üzerinde saklayın.

Hücre lisisinden sonra, her PCR tüpüne 48 mikrolitre uzatma ana sıcalığı karıştırılır. Her PCR tüpüne iki mikrolitre seyreltilmiş lysate ekleyerek mikrolitre başına 50 hücreden oluşan son hücre eşdeğerliğine ulaşın ve el yazmasına göre telomeraz uzatma reaksiyonuna devam edin. DdTRAP için mikrosantrifüj tüp bir ana karışımı hazırlayın ve oda sıcaklığında tutun.

Pipet 19.8 mikrolitre ddPCR ana karışımı her PCR tüpüne. Her tüpe önceki uzatma reaksiyonçözeltisinin 2,2 mikrolitresini ekleyerek toplam 22 mikrolitre hacim bırakarak. Damlacık üretim kartuşunu kurmak için, hazırlanan çözeltinin 20 mikrolitresini kartuştaki orta numuneye yükleyin.

Herhangi bir kabarcıkları çözeltinin üstüne taşımak için kartuşun yan tarafına hafifçe dokunun. Kartuşun tüm kuyuları yağ yüklemeden önce numune ile yüklenmelidir. Daha sonra, sol yağ kuyusu içine damlacık üretimi yağ 70 mikrolitre yükleyin.

Contayı kartuşun ucuna bağlayarak yerinde sabitle ve dolu ve monte edilmiş kartuşun damlatıcı jeneratörüne yerleştirin. Jeneratör kartuş düzgün yerleştirilir bilgilendirmek için katı bir yeşil ışık gösterir. 60 ila 90 saniye sonra, jeneratör ışığı yanıp sönmeyi durdurduğunda, döngü tamamlanır.

Şimdi kartuşunu çıkarın. Contayı kartuştan yavaşça çıkarın. 96 kuyulu bir PCR plaka içine sağ kuyudan yeni üretilen damlacıkların yaklaşık 40 mikrolitre pipet için çok kanallı pipet kullanın.

Buharlaşmayı önlemek için tüm numuneler 96 kuyulu plakaya yüklendikten sonra plakayı alüminyum folyo PCR plaka mühürleriyle ısıtın. Daha sonra, PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için 96-iyi plakayı bir termocycler'a yükleyin. Başlamak için, 96-kuyu plaka damlacık okuyucu içine yükleyin.

Plakayı, A1 örneğinin tutucununkiyle eşleşin şekilde düzgün bir şekilde yönlendirin. Damlacık okuyucuyla ilişkili yazılımı açın. Örnek iyi editör ekranını açmak için ilk kuyu olan A01'e çift tıklayın.

Deneme'yi tıklatın ve açılır menüden kullanılacak deneme türünü seçin. Doğru algılama yöntemi olarak QX200 ddPCR EvaGreen Supermix'i seçin. Kullanıcı tanımlı ayarları vurgulanan tüm kuyulara kaydetmek için kuyu düzenleyicisi ekranının sağ alt tarafında Uygula'yı tıklatın.

Ardından, kuyu düzenleyicisi ekranında Hedef'e tıklayın ve örnek türünü tanımlamak için bilinmeyen, başvuru veya şablonsuz denetimi seçmek için Hedef açılır menüsünü tıklatın. Örnek Ad bölümünde, tüm örnekleri etiketleyin ve Uygula'yı tıklatın. Plakayı okumak için Çalıştır'ı tıklatın.

Plakanın okunması gereken yönlendirme hakkında bilgi almak istendiğinde Çalışma Seçenekleri ekranındaki Sütunlar veya Satırlar'ı seçin. Bir bilgi tablosu sağlamak için tek tek kuyulara veya sütuna ve satır üstbilgilerine çift tıklayarak her örnek için kabul edilen damlacıkların sayısını belirleyin. ddTRAP için, 10, 000 veya daha fazla kabul görmüş damlacıklı numuneler daha fazla analiz için geçerlidir.

Örnek kopyalarını ve NTC örneklerini temsil eden kuyuları vurgulayın. Ekranın sol alt kısmındaki eşikleri ayarlamak için simgeye tıklayarak örneklerin eşiğini el ile ayarlayın. Bu protokolde telomeraz aktivitesi dokuz hücre hattından oluşan bir hücre panelinde akciğer kanseri ve telomeraz-negatif fibroblastlardan oluşan bir hücre panelinde ölçüldü.

SHP77, H2887 ve NTC için her üç biyolojik kopya için de yaklaşık 2.000 floresan genliği olarak bir eşik belirlenmiştir. Pozitif damlacıkların floresan yoğunluğu 6.000 civarında, üstte net bir popülasyon oluşturmuş ve 1,100 floresan genliği civarındaki negatif damlacıklardan ayrıdır. Tüm numuneler arasındaki hücre eşdeğeri başına toplam telomeraz uzatma ürünleri, akciğer kanseri hatlarındaki telomeraz aktivitesini temsil eden nükleik asitlerin ölçülen konsantrasyonundan tahmin edilebilmektedir.

Lysis veya uzatma reaksiyonu sırasında herhangi bir RNase kontaminasyonu ribonükleoprotein kompleksi olduğu için telomeraz enzimatik aktivitesini yok edecektir. ddTRAP hücredeki hTERT mRNA ekspresyon düzeylerinde ddPCR ile takip edilebilir. İki veri seti, hTERT'nin ekspresyonunu telomeraz aktivitesi ile ilişkilendirmemize ve alternatif birleştirme gibi potansiyel telomeraz düzenleyici mekanizmaları daha derinlemesine araştırmamıza olanak tanır.

Belirli birleştirme faktörlerinin manipülasyonlarını ve bunların telomeraz aktivitesi üzerindeki etkilerini inceleyebiliriz. Şu anda telomeraz aktivitesini hedefleyen potansiyel ilaçlar olarak oligonükleotid birleştirme modülatörleri tasarlıyoruz.