Otomatik sentez ve gerçek zamanlı kinetik değerlendirmesinin teknik yönü [¹¹C] SNAP-7941

Karbon-11 radyoetiketleme, molekülü değiştirmeden pozitron emisyon tomografisi veya PET için küçük bileşiklerin kullanılmasını sağlar. Bu reseptör ekspresyonu düzeylerini araştırmak için gereklidir. Karbon-11 radyolabeling avantajı doğrudan gerçek zamanlı olarak melanin konsantre hormon reseptörüne doğru SNAP'in bağlayıcılar kinetik değerlendirmek için PET kullanabilirsiniz.

Bir melanin konsantre hormon reseptör antagonisti olarak SNAP bu reseptör ve obezite ve diyabet gibi metabolik koşullar ile ilişkisi daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunacaktır. Efflux taşıyıcılar kan-beyin bariyerinde ifade önemli ölçüde merkezi reseptör ekspresyonu görüntüleme için radyofarmasötik kullanımını engelleyebilir. Bu nedenle in vitro izleri değerlendirmek önemlidir.

SNAP'in otomatik radyosentezi, kolayca değerlendirilebilen bir metil grubu olan radyoetiketli düşük molekül ağırlıklı bileşikler için geniş ölçüde uygulanabilir. Bir kez bu prosedür diğer bileşikler için adapte edilebilir kuruldu. Gösteriye yardımcı olacak kıdemli doktora öğrencileri Sarah Pfaff ve Theresa Balber olacak.

Karbon-11 SNAP sentezine başlamak için uygun reaktifler ve malzemelerle temiz bir karbon-11 otomatik sentez modülü ayarlayın. Sistem kontrolleri ve koşullandırma ile başlayacak modül bilgisayarda SNAP sentez işlemini başlatın. Modül C-11 teslimatı için hazır hale gelmeden yaklaşık 30 ila 40 dakika önce, siklotrondaki C-11 karbondioksit hedefini seçin ve ışını 65 mikroampere'den başlatın.

Modül teslime hazır olduğunda iç pencereyi ve dış kapıyı kapatın. CO2 tuzağının en az 40 santigrat dereceye kadar soğudugunu ve metan kapanı soğumaya başladı. Cyclotron yaklaşık 120 gigabecquerel si c-11 CO2 ürettikten sonra, co2 tuzağı aracılığıyla hedeften yolu açmak için modül yazılımında Tamam'ı tıklatın.

Siklotron bilgisayarında modüle C-11 CO2 ulaştırılmasına başlanması. Modül bilgisayarındaki etkinlik transferini izleyin ve üç dakika sonra CO2'nin metan gazına indirgenmesini sağlayın. Ortaya çıkan metan metan tuzağına atılır ve iyot fırın yoluyla sirkülasyon tarafından metil iyodür dönüştürülür gibi süreci izleyin.

Dönüşüm sırasının sonunda yan ürünler metil iyodür tuzağından egzoza atılır ve reaktörün Tamam'a tıklayarak etkinlik almaya hazır olduğunu onaylayın. Metil iyodür, metil triflate fırın yoluyla kızarılmış ve reaktör içinde sıkışıp, tuzak serbest bırakılır gibi sistemi izleyin. Reaktör platolarında aktivite bindirmenin tamamladığını doğruladığında. Reaksiyon karışımı 75 derecede üç dakika boyunca tepki verirken bekleyin.

Daha sonra reaksiyon karışımı 35 santigrat derecenin altına soğutulup 1,5 mililitre su ile söndürdün gibi sistemi izleyin. Reaksiyon karışımı HPLC enjeksiyon halkasına yüklenir ve yarı hazırlık HPLC sütununa enjekte edilir ken sistemi izleyin. Kromatografi ilerledikçe UV ve gama dedektörü izlerini izleyin.

Ürün tepe işlemi manuel olarak görünmeye başladığında, modülün yuvarlak alt toplama şişesinde ürünü toplamaya başlayın. Gama sinyali saniyede yaklaşık 400 sayar altına düştüğünde toplamayı el ile sonla. Ürün helyum basıncı altında katı faz çıkarma kartuşuna yüklendiğinde yuvarlak alt şişedeki sıvı seviyesini izleyin.

Şişe boşaldıktan ve sıvı SPE kartuşundan geçtikten sonra, kartuşa hapsolmuş ürünleri yıkamaya başlamak için Tamam'ı tıklatın. Daha sonra ürün önce kartuştan şişeye girerken ve daha sonra %0,9 tuzlu çözelti ile seyreltilirken, ürün toplama şişesindeki etkinliği izleyin. Hasat basıncı altında steril filtre ile ürün şişesine aktarılırken izleyin.

Transfer tamamlandığında ürün çıkış valfi kapatın. Radyotracer ürün şişesi geldiğinde mutlak radyoaktif verimi ölçer. Daha sonra 100 mikrolitrelik izleyiciyi kalite kontrol için küçük bir şişeye aktarmak için kurşun korumalı şırınga kullanın.

Kalite kontrol örneğini korumalı kalite kontrol çalışma alanına getirin. QC numunesinin 40 mikrolitresini gaz geçirmez bir şırıngaya yerleştirin, analitik bir kolonla donatılmış hazırlanmış bir HPLC aletine yükleyin ve ürünü enjekte edin. HPLC çalışması sırasında diğer kalite kontrol ölçümlerini gerçekleştirin.

HPLC çalışması tamamlandıktan sonra, SNAP radyo kimyasal saflığında %95'ten fazla olup olmadığını belirlemek için radyoaktivite dedektöründen kromatogramdaki tüm zirveleri entegre edin ve ürünün kimyasal saflığını belirlemek için UV kromatografisindeki zirveleri birleştirin. Belirli bir etkinliği hesaplamak için UV ürün zirvesinin altındaki alanı kullanın. Ürün kullanım gereksinimlerini karşılamak için onaylandıktan sonra gerçek zamanlı kinetik deney laboratuarına radyo izleyicisi bırakın.

Deneyden en az 30 dakika önce hazırlanan yabani tipi veya transfected hücreleri DPBS ile yıkayın ve iki mililitre serumsuz büyüme ortamı ekleyin. Transfektif hücreleri engellemek için dimetil sülfoksit racemic verapamil hidroklorür 20.4 milimolar çözelti0.98 mikrolitre ekleyin. Hücreleri eğik bir düzlemde 30 dakika kuluçkaya yatırın.

Ardından gerçek zamanlı test cihazını ve ilgili bilgisayarı açın. Kontrol yazılımını açın ve bir hedef seçin. Konum sayısını ikiye, algılama süresini üç saniyeye, algılama gecikme süresini iki saniyeye ve ilk aşamanın adını taban çizgisine ayarlayın.

Alt taraftaki hücre direği ile hücre kültürü çanasını cihazın eğimli desteğine takın. Hücre kutbu hücre kültürü orta kaplı olduğundan emin olun. 10 dakikalık bir arka plan ölçümü başlatın ve dosya adını ve yolu ayarlayın.

Zaman ölçeğini dakikaya, nüklid koleksiyonunu karbon-11'e ayarlayın. Grafiği arka plan, hedef ve arka plan çıkarılan hedef verileri gösterecek şekilde yapılandırın. Radyo izleyicisi teslim edildikten ve kullanım için onaylandıktan sonra, test için küçük bir örnek alın.

Radyo izleyici çözeltisinin gerekli hacmini hesaplayın ve bir pipet hazırlayın. Alet yazılımında çalıştırmayı duraklatın ve çanak döndürmenin durmasını bekleyin. Cihazın kapağını açın, desteği 90 derece sola çevirin, hazırlanan pipetle radyo izleyicisini ekleyin ve cihazı ilk konumuna getirin.

Aygıtın kapağını kapatın ve denemeye hemen devam edin. Denemeyi bitirmeden önce 20 dakika boyunca çalıştırın. Hücrelerdeki SNAP alımını değerlendirmek için verileri işleyip analiz edin.

Şimdi prosedür DMSO tedavi kontrol hücre kültürü çanak ve yabani tip hücre hattı için tekrarlanabilir. Gerçek zamanlı kinetik tahliller olmayan PGP yabani tip hücreleri ifade ile yapıldı, PGP ifade hücreleri pgp inhibitörü olarak verapamil ile önceden bloke, ve engellenmemiş PGP hücreleri. Tedavi edilmeyen hücreler ile araç la tedavi edilen hücreler arasında anlamlı bir fark gözlenmedi.

Karbon-11 SNAP, PGP ifade eden hücrelerde birikme gözlenmezken yabani tip hücrelerde hızla birikti. PGP efflux taşıyıcının verapamil ile önceden engellenmesi, PGP hücrelerinde yabani tip hücrelerle karşılaştırılabilir SNAP birikimine neden oldu. Gerçek zamanlı kinetik ölçümlerile birlikte bu kurulum düşük molekül ağırlıklı bileşiklerin farmakokinetiğinin geniş bir şekilde anlaşılmasını sağlar ve bu nedenle radyofarmasötiklerin klinik öncesi gelişimi için son derece önemlidir.

Zamanlama ve organizasyon karbon-11 yarı ömrü sadece 20 dakika olduğu gibi sonraki gerçek zamanlı kinetik deneyler ile başarılı bir karbon-11 radyosentez için ana maddelerdir. Karbon-11'in kısa yarı ömrü nedeniyle bu işlemin birçok bölümü aynı anda gerçekleştirilir. İlgili herkesin rolünün kapsamını ve zamanlamasını anlaması önemlidir.

Hem ürün güvenliği hem de radyasyondan korunma radyofarmasötiklerin hazırlanmasında anahtardır. Tüm deneyler, operatörün radyasyona maruz kalmasını sınırlamak için makul olarak ulaşılabilir olan en düşük veya ALARA Prensibi'ni izlemelidir.