Üç boyutlu Küroid Istilası tahlil tam ınsan tümör tabanlı matris
7 Mayıs 2019
Tümör mikroçevre kanser büyüme ve işgali önemli bir parçasıdır. Karsinom ilerlemesini taklit etmek için biyolojik olarak alakalı bir insan matrisine ihtiyaç vardır. Bu protokol, insan leiomyoma tabanlı matris uygulayarak in vitro üç boyutlu küroid invazyonu tahlil için bir gelişme tanıtır. Protokol aynı zamanda bilgisayar tabanlı bir hücre istilası analizi sunar.
Bildiğimiz gibi, tümör mikroçevre kanser büyüme ve invazyon önemli bir parçasıdır. Karsinom ilerlemesini taklit etmek için biyolojik olarak ilgili bir insan tümör matrisine ihtiyacımız var. Bu in vitro invazyon testindeki tek insan tümör matrisi.
Klasik küresel tsay ile karşılaştırıldığında, bu yöntem ısıya duyarlı değildir ve küresel transfer gerektirmez. Bu teknik, baş ve boyun karsinomu gibi hasta kaynaklı katı kanser örnekleri için uygundur ve kemoradyasyon tedavileri de dahil olmak üzere kişiselleştirilmiş tıp doğru uzatılabilir. Bu insan tümör tabanlı matris zaten yüksek iş itimi ilaç testi, canlı hücre analizi, yara iyileşmesi ve transfer testleri de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılmıştır.
Teknik olarak en hassas adım, yöntemin fibrinojen işekilde işlenmesine eklenmedir, böylece önce bu adımı boş kuyularla uygulamak isteyebilirsiniz. Matrisin doğru şekilde işlenmesini göstermek önemlidir ve yöntemi görsel olarak göstererek analiz etmek kolaydır. Çok hücreli tümör küresel nesil için, 96-iyi ultra-düşük eki yuvarlak alt plaka her kuyuiçine tam orta 50 mikrolitre ilgi hücre hattından üçüncü hücrelere bir kez 10 dağıtmak.
Daha sonra, ters mikroskopla tümör küresel oluşumunu görsel olarak doğrulamadan önce plakayı dört gün boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Üç boyutlu bir küresel istila tonu kurmak için, buz üzerinde insan miyom kaynaklı matris eritin ve 37 santigrat derece su banyosunda fibrinojen stok çözeltisi çözültün. Reaktifler ısındığında, tam orta, insan miyom kaynaklı matris, trombin, aprotinin ve fibrinojen in uygun hacimlerde birlikte karıştırın, sadece hücrelere matris karışımı dağıtmadan önce fibrinojen ekleyerek.
Hemen küresel kültür plakaher kuyuiçine ortaya çıkan jel 50 mikrolitre ekleyin, her kuyunun iç duvarına doğru ucu yönlendiren ve kuyunun merkezinden spheroid hareket etmeden yavaşlama borulama. Fibrinojen birkaç dakika sonra jel başlar bu yana, sağlam ama hassas ters pipetleme ve bir seferde sadece birkaç kuyunun tedavisi gerektirir. İnsan miyom kaynaklı matriks fibrin jelinin her jelin üstüne 100 mikrolitre tam orta eklemeden önce katılaşmasını sağlamak için plakayı 30 dakika boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri verin.
Sonra her gün küresel istilayı görüntüle. ilastik ile görüntü bölümleme için açık kaynak görüntü sınıflandırmave segmentasyon yazılımını açın ve Piksel Sınıflandırmaiş akışını seçin. ilastik projeyi bilgisayara kaydedin.
Pikseller, kullanıcı tarafından yapılan ek açıklamalara göre sınıflandırılır. Analiz için görüntüleri seçmek için Giriş Verileri ve Yeni Ekle'yi tıklatın. Özellik seçimi için Özellik Seçimi ve Özellikleri Seç'i tıklatın.
İlgi çekici özellikleri seçmek için uygun kutuları tıklatın. Seçili kutular yeşile döner. Eğitim için Eğitim'i tıklatın.
Eğitim bölümünde, Etiket 1 ve Etiket 2 olmak üzere iki etiket olmalıdır. Arka planı etiketlerden biriyle işaretleyin ve hücreleri diğer etiketle işaretleyin. İlk görüntüdeki tüm hücreler ve arka plan etiketlendiğinde, görüntülerin %10'u işaretlenene kadar hücreleri ve arka planı işaretlemeye devam etmek için geçerli görünümden sonraki görüntüyü seçin.
Ardından tüm görüntüleri analiz etmek için Canlı Güncelleştirme'yi seçin. Eğitim tamamlandığında ve ilastik tüm görüntüleri analiz ettiğinde, Tahmin Verme'yi tıklatın ve Kaynaktan Basit Segmentasyon'u seçin. Ardından Dışa Aktarma Görüntü Ayarlarını Seçin'den istenen çıktı dosya biçimini seçin ve etiketleme sonuçlarını dışa aktarmak için Tümünü Dışa Aktar'ı tıklatın.
Dosyalar orijinal görüntülerle aynı klasöre dışa aktarılır. Alan analizi için, ilk olarak orijinal görüntüyü Fiji ImageJ'de bir ölçek çubuğuyla açın ve görüntünün analiz edilen görüntülerle aynı boyut ve boyuta sahip olmasına dikkat edin. Bilinen uzunlukta bir çizgi çizmek için çizgi seçim aracını kullanın ve Çözümle ve Ölçek'i ayarla'yı tıklatın.
Daha sonra bilinen mesafe alanında bilinen mesafeyi ayarlayın. Uygun birimi ayarlayın ve Global'i tıklatın. ilastik eklentisini yüklemek için Yardım ve Güncelleştir'i tıklatın ve ImageJ güncelleyici penceresinde güncelleştirme sitelerini yönet'i tıklatın.
ilastik, Kapat ve Uygula değişikliklerinin yanına tıklayın. Birkaç dakika sonra, başarıyla güncelleştirilen bir bilgi penceresi görüntülenir. Tamam'ı tıklatın ve ImageJ'i yeniden başlatın.
Ardından, Eklentiler, Makrolar'ı tıklatın ve Yükleyin ve sayacı seçin. ijm dosyası. Ardından Aç'ı tıklatın.
Alan analizini tamamlamak için Eklentiler'i tıklatın ve ilastik'i seçmek için kaydırın. HDF5'i Aktar'ı seçin ve h5 formatındaki dosyayı seçin. Aç ve Yükle'yi tıklatın ve arama tablosunu uygulayın.
Ardından klavyedeki A düğmesini tıklatın ve alan toplam alan olarak özet penceresinde görünür. Bu temsili deneyde, metastatik laringeal skuamöz hücreli karsinom hücre liline fidesi den dört gün sonra, matriks, gösterildiği gibi oluşan küresel lere eklenmiş ve inverted mikroskopta her gün istila izlenmiştir. Bir kez gömülü, insan miyom kaynaklı fibrin matris hücreleri hızla bir gün sonra işgal etmeye başladı ve sonraki iki gün içinde matris içine uzatıldı.
Fare sarkomu türemiş matristeki hücreler çevredeki matrisin içine giremedi, bunun yerine asimetrik bir yapı oluşturdular. Kollajenhücreleri biraz işgal ama matris büzülme nedeniyle analiz zor oldu. Bazı kuyularda, küreseller üç gün sonra bile ortadan kayboldular.
Burada insan miyomu kaynaklı fibrin matrisinde primer ve metastatik laringeal skuamöz hücreli karsinom hücresinin invazyonunun nicelliği gösterilmiştir. İnsan miyomu kaynaklı fibrin matriks küresel invazyonunun canlı hücre analizi, zaman içinde diğer hücreler tarafından takip edilen matris boyunca iplikçiklerde hücre hareketini ortaya çıkarır. Matrisi kuyulara eklerken küresel liği merkez konumdan oynatmamaya dikkat edin.
Bu prosedür, ışınlama ve kanser ilaçları gibi belirli moleküllerin invazyonu nasıl etkilediğini incelemek için kullanılabilir. Hücreler sonraki çalışmalar için sabit ve lekeli olabilir. Klasik fare sarkomu modelinde hücreler esas olarak çoğalır ve istila yönü çok azdır.
Bu insan tümör tabanlı matris invazyona neden olur, inhibisyon çalışmalarını daha verimli hale getirir.
Genel Bakış
Bu çalışma, karsinom progresyonunun taklidini artıran, insan leiomyoma türevi matris kullanan yeni bir in vitro üç boyutlu sferoid invazyon analizi sunar. Yöntem, tümör hücre invazyonunun daha iyi analizini sağlar ve hasta türevi katı kanser örneklerine uygulanabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kanser Biyolojisi
- Tümör Mikroçevresi
- In Vitro Analizleri
Arka Plan
- Tümör mikroçevresi, kanser büyümesi ve invazyonunda kritik bir rol oynar.
- Karsinom progresyonunun doğru modellenmesi için biyolojik olarak alakalı bir insan tümör matrisi gereklidir.
- Bu yöntem, klasik sferoid analizleriyle karşılaştırıldığında daha az sıcaklığa duyarlıdır.
- Kimyoradyasyon tedavileri dahil olmak üzere kişiselleştirilmiş tıp uygulamaları için uygundur.
Çalışmanın Amacı
- Kanser hücre invazyonunu incelemek için insan tümör matrisi tabanlı bir analiz geliştirmek.
- Geleneksel yöntemlerle ilişkili teknik zorlukları en aza indiren bir protokol sağlamak.
- Yüksek verimli ilaç testi ve canlı hücre analizi sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Ultra düşük yapışma plakalarında çok hücreli tümör sferoidlerinin oluşturulması.
- İnvazyon analizi için insan myoma türevi matris ve fibrinojenin hazırlanması.
- Bir inverte edilmiş mikroskop kullanarak sferoid invazyonunun günlük görüntülenmesi.
- İlastik kullanılarak görüntü analizi, segmentasyon ve alan kantifikasyonu.
Ana Sonuçlar
- İnsan myoma türevi matrisindeki hücreler hızlı bir şekilde invazyon yaptı ve tümör davranışına etkili bir şekilde modellenmesini gösterdi.
- Diğer matrislerle karşılaştırma, farklı invazyon kalıplarını ortaya koydu ve insan türevi matrisin avantajlarını vurguladı.
- Canlı hücre analizi, zamanla dinamik hücre hareketini ve invazyonunu ortaya koydu.
- Yöntem, çeşitli tedavilerin tümör invazyonu üzerindeki etkilerini incelemek için uyarlanabilir.
Sonuçlar
- İnsan myoma türevi matris, kanser hücre invazyonunu incelemek için sağlam bir platform sağlar.
- Bu analiz, kanser için terapötik müdahaleler üzerinde araştırmayı kolaylaştırabilir.
- Analizi başarılı bir şekilde uygulamak için uygun işleme ve metodoloji kritik öneme sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This assay addresses a critical gap in preclinical cancer research by providing a human tumor-derived matrix that better recapitulates the in vivo microenvironment compared to animal-derived alternatives. It enables more predictive modeling of carcinoma invasion, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The platform is suitable for screening applications and translational continuity, particularly for head and neck carcinoma and patient-derived samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by enabling functional validation of targets in a human-relevant extracellular matrix context.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity through direct observation of invasion phenotypes in a biologically pertinent system.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that modulate invasion in a model predictive of human tumor behavior.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible 3D system for quantitative assessment of compound effects on cell invasion.
- Operational Value: Enables high-throughput drug testing with minimal technical variability due to reduced temperature sensitivity and no spheroid transfer requirement.
- Scalability: Compatible with 96-well ultra-low attachment plates, supporting assay miniaturization and multi-condition screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Uses human leiomyoma-derived matrix to bridge discovery findings with preclinical validation in a disease-relevant system.
- Biomarker Alignment: Facilitates live-cell analysis of invasion dynamics, enabling correlation with molecular signatures or treatment responses.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by quantifying invasion inhibition, a key phenotypic endpoint in metastasis prevention.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for metastasis-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of invasion drivers and pathway modifiers in a human tumor microenvironment context.
- Screening: Delivers quantitative, imaging-based readouts suitable for automated analysis and compound profiling.
- Analytics: Generates invasion area measurements via ilastik and ImageJ, enabling statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by modeling a key step in metastasis using a human-derived matrix.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform applicable across solid cancer types and therapeutic modalities, including chemoradiation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by reducing reliance on non-human matrices that poorly mimic human tumor stroma.
- Operational Value: Improves reproducibility and standardization through a defined matrix preparation protocol and imaging workflow.
- Strategic Value: Increases capital efficiency by improving early prediction of clinical translatability, reducing late-stage failure due to poor metastasis modeling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads based on invasion inhibition potency in a human-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture, matrix handling, and sterile technique for fibrin gel preparation.
- Dependent on access to inverted microscopes, ilastik, and Fiji ImageJ for imaging and analysis.
- Necessitates cross-team standardization of spheroid formation and matrix dispensing to avoid positional artifacts.
- Adaptation to other model systems requires validation of matrix compatibility and invasion kinetics.
- Practical limitation: Fibrinogen initiates rapid gelation, demanding precise, timed pipetting to maintain spheroid integrity.
