İskelet Kas Biyopsisi Prosedüründen İnsan Kas Atası Hücrelerinin İzolasyon, Kültür, Karakterizasyonu ve Farklılaşması
23 Ağustos 2019
İskelet kas biyopsi sözünde nizolating, culturing, karakterizasyonu ve insan primer kas atası hücreleri (hMPCs) ayırt etme teknikleri salıyoruz. bu yöntemlerle elde edilen ve karakterize edilen hMPC'ler daha sonra insan miyogenezi ve iskelet kası rejenerasyonu ile ilgili araştırma sorularını ele almak için kullanılabilir.
İskelet kas rejenerasyonunu düzenleyen insan kas atası hücrelerinin izole sokulması, donör değişkenliğini korurken rejeneratif sürecin temelini oluşturan süreçleri araştırmamıza olanak tanır. Bu teknik, az sayıda hücre kullanılarak az miktarda doku ve bunların henotipik analizinden insan kas dölat hücrelerinin büyük verimlerinin alınmasını sağlar. Bu yöntem özellikle insan kas atası hücrelerini izole etmek ve çoğalma ve farklılaşma yeteneklerini izlemek ve iskelet kas rejeneratif süreci ile bu verileri ilişkilendirmek için tasarlanmıştır.
Bu oldukça basit tekniğin en zor yönü, hücrelerin verimini ve saflığını optimize etmek için her adımın tekrar tekrar yapılmasını sağlamaktır. Hücrelerin başarılı bir şekilde yalıtımı için tamamlanması gereken birden çok adım vardır. Bazı adımların görsel olarak gözlemlenirse anlaşılması daha kolaydır.
Biyopsi dokusundan insan kas progenitor hücreleri izole etmek için, steril koşullar altında steril bir Petri çanak içine kas dokusu yerleştirin, ve bir milimetre küp parçalar halinde doku kıyma steril bir neşter kullanın. Tüm doku lar doğrlandığında, parçaları 10 mililitre PBS içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve dokuları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice azarlamadan önce yer çekimine göre yerleşmelerine izin verin. Parçaları ikinci kez yıkadıktan sonra, PBS'yi 10 mililitre düşük glikozlu Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamıile değiştirin.
Dokular yerleştikten sonra supernatant çıkarın ve sindirim aracı üç mililitre parçaları yeniden askıya. 30 dakika boyunca 37 derece santigrat derecede dokular yerleştirin, bir mililitre serolojik pipet ile kas parçaları her 10 dakikada bir trituration ile. Kuluçka sonunda, numunelere 83 mikrolitre ek sindirim ortamı ve 24 mikrolitre Dispase çözeltisi ekleyin ve tek tip bir bulamaç elde edilene kadar dokuları her 5 ila 10 dakikada bir geniş delikli pipet ucuyla triturate.
Tek tip bir bulamaç insan kas atahücrelerinin maksimal kurtarma için önemlidir. Bulamaç standart 1,000 mikrolitrelik pipet ucundan geçmezse sindirime devam edin. Pax7-pozitif hücreleri izole etmek için, leke ve protokole göre hücreleri kapısı.
Sıralayın CD56, CD29 çift pozitif insan kas atası hücreleri bir akış sitometre bir akış sitometre ile 100 mikrometre nozül bir basınç ta inç kare başına 20 kilo floresan-hücre sıralama tampon 300 mikrolitrelik yastık içeren toplama tüpleri içine. Sonra kollajen kaplı 24-iyi plakalar içine sıralanmış insan kas atası hücreleri tohum 3.5 kat 10 santimetre kare konsantrasyonu için önceden ısıtılmış büyüme ortamı içeren. Birleştirme taramaları gerçekleştirmek için plakayı bir görüntüleme sitometresine yükleyin ve Yeni Tarama ve Plaka Kategorisi Oluştur, Plaka Profili ve Plaka Kimliği'ni seçin.Uygulama Altında, Confluence ve Confluence 1'i seçin ve görüntülemek için bir kuyu seçin.
Hücrelerin arka plana göre beyaz göründüğü bir odak düzlemi bulun ve Kayıt Kılavuzu'nu seçin. Taranması gereken tüm kuyuları vurgulamak için fareyi kullanın ve Tarama başlat'ı seçin. Tüm kuyu alanı otomatik olarak taranır.
Plaka ve hücre türü için en uygun çözümleme ayarlarını seçin ve Çözümle'yi Başlat'ı seçin. Başlangıçta birleşimi ölçmek için görüntüleme sitometresini kullanın. Daha sonra görüntüleme sitometresi üzerindeki hücreleri saymak için, her kuyudaki ortamı 200 mikrolitre boyama çözeltisi ile değiştirin.
37 santigrat derecede 15 dakika sonra, 100 mikrolitre taze Ham F12 ile boyama çözeltisini değiştirin. Plakayı görüntüleme sitometresine geri döndürün ve Uygulama altında Hücre Canlılığı ve Live Dead Total'i seçin. Canlı kanal parlak alan görüntü olacak, Dead kanal propidium iyodür boyama gösterecektir, ve Toplam kanal Hoechst 33342 boyama olacak.
Odak Kurulumu altında Otomatik'i kaydedin'i tıklatın. Toplam kanalının altında, kanalı maviye ayarlayın. Çekirdekleri odaklamak için Odak Bul'u kullanın ve odak noktasını seçmek için Ofset'i ayarla'yı tıklatın.
Ölü kanalının altında, kanalı kırmızıya ayarlayın ve ölü hücreleri odak lamak için Odak Bul'u kullanın. Odak noktasını seçmek için Ofset'i ayarla'yı tıklatın ve tarayıp başlatmak için Tsk'i Başlat'ı seçin. Ardından, plaka ve hücre türüne uygun çözümleme parametrelerini seçin ve çözümlemesi başlatmak için Çözümle'yi Başlat'ı seçin.
Çözümleme tamamlandığında, görsel olarak analizin hücreleri uygun şekilde saydığını doğrulayın. Tarama ve analiz tatmin ediciyse, plakayı kuvöze geri döndürün, aksi takdirde analiz parametrelerini tarayıp değiştirin. İnsan kas atası hücreleri ölü hücreleri veya enkaz ortadan kaldırmak için yan ve ileri dağılım alanı dayalı ilk gating olayları ile tespit edilebilir, 7-AAD için negatif ve bu nedenle canlı sadece hücreleri seçerek takip.
Cd56 ve CD29 hücre yüzeyi belirteçleri için pozitif hücreler daha sonra insan kas atası hücre popülasyonu temsil eder. İnsan kas atası hücreleri de Pax7 ifade ile tespit edilebilir. Nitekim, Pax7 FACS sonra toplam nüfus zenginleştirilmiş ve birden fazla pasajlar aracılığıyla korunur.
Burada, temsili bir kesişme tetkiki gösterilir. Yeşil anahatlar görüntüleme sitometresi tarafından oluşturuldu ve görüntüleme sitometresinin seçili analiz ayarlarına göre birleşimi nasıl belirlediğini gösterdi. Bir heterojenlik ve çekirdek sayıları donörler arasında yaygındır.
Bu heterojenliği keşfetmek ve doğru bir şekilde karakterize etmek görüntüleme sitometresinin önemli bir uygulamasıdır. Ancak, benzersiz donörlerin kesişme ölçümleri ve çekirdek sayıları son derece ilişkilidir. Miyotubelar oluşturmak için farklılaşmış insan kas atahücreleri embriyonik miyozin ağır zincir ekspresyonu ile ayırt edilebilir.
Her donörden aynı hücre popülasyonunu izole etmek için akış sitometresindeki gating parametrelerini seçerken tutarlı olmak önemlidir. Bir kez izole, insan kas atahücreleri birden fazla amaç için kullanılabilir, çoğalması ve insan kas atası hücrelerinin farklılaşması benzersiz metabolik gereksinimleri belirlenmesi de dahil olmak üzere. Insan kas atası hücrelerinin izolasyon insan ve fare kas atahücreleri üzerinde hücre yüzeyi marker ekspresyonu farklılıkları ayrımcılık izin verdi.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, iskelet kası biyopsi dokusundan insan primer kas progenitör hücrelerinin (hMPCs) izolasyonu ve karakterizasyonu için kullanılan teknikleri sunmaktadır. Bu yöntemler, araştırmacıların insan miyogenezini ve iskelet kası rejenerasyonunu incelemelerine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Rejeneratif Tıp
Arka Plan
- İnsan kas öncül hücreleri, iskelet kası rejenerasyonunda kritik bir rol oynar.
- Bu hücrelerin izole edilmesi, donör değişkenliği dikkate alınarak rejeneratif süreçlerin çalışılmasına olanak tanır.
- Hücre izolasyon teknikleri, optimal verim ve saflığı sağlamak için tekrarlanabilir olmalıdır.
- İzolasyon basamaklarının görsel olarak gözlemlenmesi, konunun anlaşılmasını geliştirebilir.
Çalışmanın Amacı
- Kas rejenerasyonu üzerine araştırmalar yapmak amacıyla insan kas progenitör hücrelerini izole etmek.
- Bu hücrelerin proliferasyon ve diferansiyasyon kapasitelerini analiz etmek.
- Bulguları, genel iskelet kası rejenerasyon süreciyle ilişkilendirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Skeletal kas biyopsi dokusundan hMPC'lerin izolasyonu.
- İzole edilen hücrelerin karakterizasyonu.
- Küçük hücre miktarları kullanılarak fenotipik analiz.
- Proliferasyon ve diferansiyasyon yeteneklerinin takibi.
Ana Sonuçlar
- Minimal doku örneklerinden hMPC'lerin başarılı bir şekilde izole edilmesi.
- Hücrelerin karakterizasyonu, araştırma uygulamaları için potansiyellerini ortaya koymaktadır.
- Yöntemin tekrarlanabilirliği, güvenilir sonuçlar sağlar.
- İskelet kasının rejenerasyon süreci hakkında bilgiler edinilmiştir.
Sonuçlar
- Sunulan teknikler, hMPC'lerin izole edilmesi ve incelenmesi için etkilidir.
- Bu yöntemler, kas rejenerasyonunun anlaşılmasını geliştirebilir.
- Gelecekteki araştırmalar, terapötik uygulamaları keşfetmek için bu bulgular üzerine inşa edilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önemi
İskelet kası biyopsilerinden insan kas öncül hücrelerinin (hMPC'ler) izolasyonu ve karakterizasyonu, kas rejenerasyonu hedef doğrulamasında mekanistik risk azaltmayı sağlar. Bu yaklaşım, klinik değişkenliği yansıtan donör heterojenliği ile hastalığa özgü bir sistem sunarak fenotipik taramayı ve assay geliştirmeyi destekler. Bu yöntem, hücresel genişleme kapasitesini iskelet kası rejenerasyon sonuçlarıyla ilişkilendirerek preklinik modellerdeki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: İskelet kası rejenerasyon yollarıyla ilgili terapötik hipotezlerin sorgulanmasını sağlar.
- Operasyonel Değer: hMPC proliferasyonunun ve diferansiyasyonunun fonksiyonel validasyonu aracılığıyla biyolojik risk azaltmayı destekler.
- Bilimsel Değer: Hücresel fenotipleri rejeneratif süreçlerle ilişkilendirerek hedef güvenini kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Alt akış taramaları için valide edilmiş biyolojik numunelerin hazırlanmasında standartlaştırılmış, tekrarlanabilir bir sistem sağlar.
- Operasyonel Değer: Deney standartlaştırması için görüntüleme sitometrisi kullanarak kantitatif konflüans ve çekirdek sayımı ölçümlerine olanak tanır.
- Bilimsel Değer: Tutarlı izolasyon ve ekim protokolleri aracılığıyla deney ölçeklenebilirliğini ve platformun yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Donörler arasındaki ekspansiyon kapasitesi değişkenliğini incelemek için hastalığa özgü bir sistem sunarak translasyonel biyobelirteç uyumuna veri sağlar.
- Operasyonel Değer: Pax7 ekspresyonunu ve miyotüp diferansiyasyon potansiyelini koruyarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürecin sürekliliğini sağlar.
- Bilimsel Değer: Rejeneratif potansiyeldeki heterojenliğin temelini oluşturan mekanizmaları belirleyerek, riske göre ayarlanmış ilerleme kararlarını destekler.
Hat ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem; nicelendirilebilir, donör bazlı sınıflandırılmış hücresel fenotipler sağlayarak, hedef doğrulamasından öncü bileşik belirlemesine ve preklinik değerlendirmeye kadar olan keşif sürecine entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: İzole edilmiş hMPC'lerin proliferasyon ve diferansiyasyon takibine olanak tanıyarak hipotez testlerini ve yolak aydınlatmalarını destekler.
- Tarama: Standartlaştırılmış doku sindirimi, FACS sıralaması ve kolajen kaplı ekim yoluyla analiz hazırlığı ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Analitik: Donörler arası karşılaştırmaya ve koşul değerlendirmesine imkan veren kantitatif konfluens taramaları ve çekirdek sayımları oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Oluşturulan miyotüplerde korunan miyojenik diferansiyasyon kapasitesi ve embriyonik miyozin ağır zincir ekspresyonu aracılığıyla preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla donör örneği ve deneysel koşul boyunca uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir izolasyon ve karakterizasyon iş akışı oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hücresel genişlemenin rejenerasyon kapasitesiyle ilişkilendirilmesi yoluyla hedef doğrulamada öngörü güvenilirliği.
- Operasyonel Değer: Optimize edilmiş sindirim ve ayıklama adımları aracılığıyla hücre verimi ve saflığında standardizasyon ve tekrarlanabilirlik.
- Stratejik Değer: Kas progenitör hücre fonksiyonelliğinin donör bazlı stratifiye değerlendirmesine olanak tanıyarak iyileştirilmiş karar verme süreçleri.
- Portföy Etkisi: Heterojenite odaklı genişleme kapasitesi metrikleri kullanılarak rejenerasyon hedeflerinin risk tabanlı önceliklendirilmesi.
Uygulama Hususları
- Canlı hücre izolasyonu ve analizi için primer doku işleme, akış sitometrisi ve görüntüleme sitometrisi konularında uzmanlık gerektirir.
- Steril doku kültürü altyapısına, floresan aktive hücre ayıklama ekipmanlarına ve otomatik görüntüleme platformlarına bağımlıdır.
- Donörler arasında tutarlı hMPC tanımlaması sağlamak için CD56/CD29 ve Pax7 gating protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- İzolasyon verimliliğini korumak için farklı donör doku kalitesi ve biyopsi boyutuna yönelik adaptasyon değerlendirmeleri gerektirir.
- Pratik sınırlamalar arasında, hücre verimi ve genişleme kinetiğindeki donöre bağlı değişkenlik yer alır; bu durum istatistiksel güç için daha büyük örneklem boyutlarını gerektirir.
