Boyutlar-dışlama kromatografi ile çok açılı ışık saçılmasına bağlı proteinlerin karakterizasyonu (SEC-,)
20 Haziran 2019
Bu protokol, proteinleri ve kompleksleri çözelti mutlak karakterize etmek için çok açılı ışık saçılma (SEC-,) ile boyut dışlama Kromatografi kombinasyonu açıklar. SEC-, saf proteinler, yerli oligomerler, heterokompleksleri ve glikoproteinler gibi değiştirilmiş proteinlerin molekül ağırlığını ve boyutunu belirler.
SEC-MALS çözeltideki makromoleküllerin molekül ağırlığını, boyutunu ve konformasyonunun belirlenmesinde kullanılan nicel bir yöntemdir. Oligomerları ve kompleksleri belirleyebilir ve glikoproteinler ve membran proteinleri gibi zor örnekleri karakterize edebilir. SEC-MALS mutlak bir yöntemdir.
Temel fiziğe dayanır ve moleküler standartlara, molekülün konformasyonuna veya ayırma ortamıyla nasıl etkileşime girdiğimizi karşılaştırır. SEC-MALS, sn ile ayrılan birçok sistemiçin uygulanabilir. Peptitler ve küçük polimerlerden proteinlere, nükleokapsidlere, polisakkaritlere, sentetik polimerlere, virüs benzeri parçacıklara ve küçük virüslere kadar.
Sisteminizin ve arabelleklerinizin düşük partikül içeriği için satıcının önerilerini kaçırdığını doğrulamak önemlidir. Emin olmak için satıcının teknik destek temsilcisine danışın. Metin protokolünde açıklandığı gibi SEC-MALS sisteminin hazırlanması ile bu yordamı başlatın.
Her PLC dereceli reaktifleri kullanarak, 50 ila 100 milimolar sodyum klorür ile fosfat tamponlu tuz bir litre hazırlamak. Tamponu, şişelenmiş bir hücre köpük filtresi veya benzeri bir şişe kullanarak 0,1 mikrona filtre uygulayın. Kuru filtrelerdeki partikülleri ortadan kaldırmak için ilk 50 ila 100 mililitre tamponu atık şişeye süzün.
Daha sonra, daha önce filtrelenmiş, deiyonize su ile yıkanmış ve toz girmesini önlemek için tutulan temiz, steril bir şişe için geri kalanı filtre. Arabellekteki sütunu dengelemek ve partikülleri gidermek için kolonu bir gecede dakikada 0,5 mililitre lik bir akış hızıyla temizleyin. FPLC'nin sürekli akış modunu kullanın ve tüm SEC-MALS çalıştırmaları tamamlanana kadar akışın durmadığından emin olun.
DrI akış hücresini bir gecede yıkama sırasında temizleme moduna yerleştirin. Floş başlarken, sütundaki ani basınç değişikliğinden kaynaklanan sütun dökülme etkisini önlemek için akış hızını kademeli olarak artırın. Örnek çalıştırmaya başlamadan önce temizlemeyi kapatın.
Birikmiş parçacıkları serbest bırakmak için sütunun boru akıntısına hafifçe dokunarak sistem temizliğini kontrol edin. MALS cihazının ön panel ekranındaki 90 derecelik dedektördeki sinyali gözlemleyin. Tepeden tırnama gürültüsünün en fazla 50-100 mikrovolt olduğunu doğrulayın.
Ayrıca, kırılma indisi veya RI sinyalinin eksi yedi kırılma indisi birimine 1 katından daha az bir şekilde sabit olduğunu doğrulayın. Enjektörün parçacıklardan temiz olduğunu doğrulamak için boş bir enjeksiyon yapın. Boş sadece çalışan tampon taze, steril bir şişe içinde hazırlanmıştır.
Parçacık tepe hacmi en fazla bir mililitre ve taban çizgisi üzerinde en fazla beş milivolt ise, o zaman sistem örnekleri için hazırdır. Aksi takdirde, temiz olana kadar ek boş enjeksiyonlar yapın veya enjektörü temizlemek için bakım yapın. Şimdi, SCC tamponunda mililitre başına bir ila iki miligram da en az 200 mikrolitre BSA hazırlayın.
Bir şırınga ucu filtresi kullanarak proteini 02 mikrona filtre uygulayın. Kuru filtrelerden parçacıkları ortadan kaldırmak için ilk birkaç damla filtrat atın. Alternatif olarak, çözünmeyen agregaların ve diğer büyük parçacıkların çökebilmesini sağlamak için numuneyi 10,000 kez G'de on beş dakika santrifüj edin.
Daha sonra, döngü içine BSA çözeltisi 100 mikrolitre enjekte. MALS yazılım menüsünde yöntemden yeni deneme açın. Ardından, ışık saçılma sistemi yöntemleri klasöründen çevrimiçi yöntemi seçin.
Bir DLS dedektörü varsa, QELS klasörü ile ışık saçılma çevrimiçi yöntemini seçin. Yapılandırma bölümünde numune ve mobil faz parametrelerini ayarlayın. Genel pompa görünümünde, akış hızını FPLC'de kullanılana ayarlayın.
Ardından, genel pompa görünümüne, çözücü dalına, ad alanına gidin ve PBS'yi seçin. Enjektör görünümünde, örnek dal, BSA olarak adı girin. Dn/dc'yi 0,185 olarak ayarlayın, A2'yi 0'a ayarlayın ve UV Yok Olma Katsayısını milimetre nin santimetreküpü 0,667 mililitreye ayarlayın.
Yordamlar bölümünde, temel toplama görünümünde, otomatik enjekte üzerindeki onay kutusu tetikleyicisini seçin. SEC sütununun toplam geçirim hacmine ulaşılAna kadar verilerin tüm tüm kisiyon için toplanması için çalışma süresini 70 dakikaolarak ayarlayın. Çalıştır düğmesini tıklatarak MALS yazılımındaki denemeyi başlatın.
MALS dedektörü aracılığıyla FPLC cihazından darbe sinyali aldıktan sonra verileri okumaya başlayacaktır. Cihazın ön panelindeki otomatik sıfır düğmesini tıklatarak DRI sinyalini sıfırla. FPLC yazılımında çalışarak, el ile gidin, manuel yönergeleri çalıştırın, işareti ayarlayın ve protein ve çalıştırmanın adını ekleyin.
Enjeksiyon valfini manuel yükten enjeksiyona, akış yolunun altına, enjeksiyon vanasına geçirin. IO kutusu nabız dijital altında 0,5 saniyelik darbe ekleyerek bir darbe sinyali ekleyin. Bu, MALS yazılımında veri toplamayı tetikler.
Şimdi, örneği döngüye enjekte edin. Deneme çalışmasını başlatmak için FPLC yazılımında çalıştır'ı tıklatın. MALS yazılımındaki yordamlar bölümü altında, analizleri adım adım gerçekleştirin.
Temel koleksiyon görünümünü kontrol ederek, zirvelerin UV, MALS ve RI'de yaklaşık olarak aynı kinayon hacminde göründüğünü doğrulayın. Taban çizgisi görünümünde, tüm sinyaller için taban çizgisini tanımlayın. Zirvegörünümünde, fareyi tıklatıp sürükleyerek analiz edilecek zirveleri tanımlayın.
Her tepenin merkezi %50'sini seçin. Önce monomer tepesini, sonra dimer tepesini seçin. Her tepenin altında, BSA için 280 nanometre de dn/dc ve yok olma katsayısının doğru değerlerini doğrulayın.
Yordamlarda hizalama görünümünde, fareyi tıklatıp sürükleyerek zirvelerin merkezi bölgesini seçin. Sinyalleri hizala'yı tıklatın ve sonra tamam. Yordamlarda, bant genişletme görünümü, monomer tepe merkezi% 50 seçin.
Kırılma indisi dedektörü referans aracı olarak belirtildiğinden emin olun. Ardından uygun performansı tıklatın ve UV ve ışık saçılma sinyallerini kırılma indisi sinyaliyle eşleştirmek için uygulayın. Merkezi %50-70 arasında çok yakın örtüştüğünü doğrulamak için zirveleri yakınlaştırın ve tamam'ı tıklatın.
Yordamlar, normalleştirme görünümünde, tepe bir seçin. RG değeri olarak 3,0 nanometre girin, normale döndür'e tıklayın ve sonra tamam'ı tıklatın. EASI grafik görünümünde sonuçların grafiğini görüntüleyin.
Ekranın üst kısmında aşağı açılan molar kütle seçin. En tepe bölgesine yakınlaştırmak için denetimi, tıklatmayı ve sürükleyin'i kullanın. Monomer ve dimer zirveleri için son tablolanmış ağırlık ortalama molar kitle sonuçlarını görüntülemek için, tepe sonuçlarına, molar kütle momentlerine, MW'ye gidin ve sonuçlara seçin, özet rapor.
Saflık pik sonuçlar altında rapor edilir, kütle fraksiyonu. Dosya menüsünden yöntem olarak kaydet'i seçin ve analiz edilen BSA verilerini tüm protein türlerinin gelecekteki ölçümleri için standart bir yöntem olarak kaydedin. Analizde BSA için belirlenen normalleştirme ve bant genişletme parametreleri gerçekleştirilecektir.
Burada gösterilen 200 Angstrom gözenek boyutu dışlama sütunu kullanarak, BSA SEC-MALS analizleri vardır. Kromatogram izleri monomer tepeye normalleştirilmiş ve netlik için ofset. Göz ardı edilebilecek ortak yapılar, ışık saçılma sinyalinin başlangıcına yakın bir parçacık zirvesinin yanı sıra kırılma indisi sinyalindeki toplam permeasyon hacmine yakın tuz ve çözünmüş hava zirveleri de dahil olmak üzere işaret edilir.
Kromatogram mükemmel monomer-dimer-trimer ayırma sergiler, ve ışık saçılma sinyali gürültüye yüksek sinyal sergiler. Monomer ve dimer ağırlık ortalama molar kütle değerleri yüksek homojenlik gösterir. Aşağıda düşük kaliteli SEC-MALS analizlerine örnekler verilmiştir.
Bu örnekte, 75 Angstrom gözenek boyutu dışlama sütununda yetersiz ayrım, proteinlerden iyi ayrılmayan sekiz ila dokuz dakika arasında bir parçacık zirvesiyle sonuçlanır. Burada, gürültü oranına karşı yetersiz bir sinyal vardır ve proteinlere bitişik geniş parçacıklar ışık saçılma sinyalinde belirgindir. İyi SEC-MALS sonuçlarının anahtarları uygun bir sütun seçerek sistemin düşük ışık saçılma gürültüsüyle kalibre edilmesini sağlamak ve parçacıkları kaldırmak için numuneleri önceden filtrelemek veya santrifüj etmektir.
SEC-MALS'den sonra protein örnekleri bağlayıcı afinite, biyoliza, yüzey plazmon rezonansı, izotermasyon kalorimetresi, biyolerid forometri, mikro ölçekli termoforez veya kompozisyon gradyan, çok açılı ışık saçılımı açısından daha fazla analiz edilebilir. Protein yapısı x-ışını kristalografisi, kriyo-elektron miskroskopisi veya NMR ile belirlenebilir.
Genel Bakış
Bu protokol, çözeltideki proteinlerin ve komplekslerin mutlak karakterizasyonu için boyut dışlama kromatografisinin çok açılı ışık saçılması (SEC-MALS) ile kombinasyonunu tanımlamaktadır. SEC-MALS; saf proteinlerin, doğal oligomerlerin, heterokomplekslerin ve glikoproteinler gibi modifiye proteinlerin moleküler ağırlığını ve boyutunu belirler.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Protein karakterizasyonu
- Analitik kimya
Arka Plan
- SEC-MALS, moleküler ağırlık ve boyutun belirlenmesi için kullanılan kantitatif bir yöntemdir.
- Glikoproteinler dahil olmak üzere oligomerleri ve kompleksleri tanımlayabilir.
- Bu yöntem moleküler standartlara dayanmaz.
- Geniş bir makromolekül yelpazesi için uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Çözelti halindeki proteinlerin karakterizasyonu için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- Karmaşık biyolojik örneklerin analizini kolaylaştırmak.
- Protein etkileşimleri ve yapılarına dair anlayışı geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- SEC-MALS sisteminin ve tamponların hazırlanması.
- Temizliği sağlamak için sistemin filtrasyonu ve yıkanması.
- Numune hazırlama ve SEC-MALS sistemine enjeksiyon.
- MALS yazılımı kullanılarak veri toplama ve analiz.
Temel Sonuçlar
- Proteinlerin ve komplekslerin başarılı bir şekilde karakterize edilmesi.
- Sistem temizliğinin ve numune bütünlüğünün doğrulanması.
- Moleküler ağırlıkların ve boyutların doğru bir şekilde belirlenmesi.
- Numunelerdeki oligomerlerin ve komplekslerin tanımlanması.
Sonuçlar
- SEC-MALS, protein karakterizasyonu için etkili bir yöntemdir.
- Standartlara bağımlı kalmaksızın mutlak ölçümler sağlar.
- Bu teknik, çeşitli biyolojik makromoleküllere uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörle İlgili Yönetici Özeti
SEC-MALS, çözeltideki proteinlerin ve komplekslerin mutlak moleküler ağırlık ve boyut karakterizasyonunu sağlayarak moleküler standartlara olan bağımlılığı ortadan kaldırır ve erken keşif aşamasındaki analitik belirsizliği azaltır. Bu yetenek; oligomerler, agregatlar ve glikoproteinler gibi modifiye türler dahil olmak üzere terapötik adayların biyofiziksel durumunu doğrulayarak hedef validasyonunu destekler. Kantitatif ve konformasyondan bağımsız veriler sunan SEC-MALS, protein davranışına yönelik öngörü güvenini artırır, devam/dur kararlarını bilgilendirir ve biyofarma Ar-Ge süreçlerindeki geç aşama biyolojik risklerini azaltır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Protein monomerlerinin, oligomerlerinin ve komplekslerinin homojenliğini ve moleküler ağırlığını doğrulayarak terapötik hedef bütünlüğünün doğru şekilde değerlendirilmesini sağlar.
- Operasyonel Değer: Statik ve dinamik protein dengelerini birbirinden ayırarak, gözlemlenen türlerin kararlı düzenekleri mi yoksa geçici etkileşimleri mi temsil ettiğini netleştirir.
- Öngörücü Değer: Agregatları ve heterojen popülasyonları erkenden tespit ederek, sonraki yatırım aşamaları öncesinde adayların risk odaklı önceliklendirilmesini destekler.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Bilimsel Değer: Glikoproteinler ve deterjanla çözünür hale getirilmiş membran proteinleri gibi modifiye proteinlerin analizine olanak tanıyarak tarama kampanyaları için uygun hedef aralığını genişletir.
- Operasyonel Değer: Her elüsyon hacminde kantitatif, mutlak moleküler ağırlık ölçümleri sağlayarak laboratuvarlar arasında assay standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliği kolaylaştırır.
- Platform Faydası: BSA ve diğer standartlar için, gelecekteki SEC-MALS çalışmaları için yöntem olarak kaydedilebilen referans veriler oluşturarak kurum genelinde yeniden kullanımı ve tutarlılığı teşvik eder.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Keşif ve preklinik doğrulama arasında köprü kurarak, hastalık mekanizmalarıyla ilgili protein komplekslerinin ve modifiye formların karakterizasyonunu destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: Gözlemlenen türlerin kovalent modifikasyondan, spesifik olmayan agregasyondan veya spesifik oligomerizasyondan mı kaynaklandığını belirleyerek, etki mekanizmasını ve formülasyon risklerini netleştirir.
- Preklinik Uyum: Cryo-EM veya NMR gibi yapısal teknikleri tamamlayan çözelti tabanlı boyut ve konformasyon verileri sağlayarak, entegre hedef profillemeye olanak tanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
SEC-MALS, protein ekspresyonu ve saflaştırmasından sonra, ancak fonksiyonel analizler veya yapısal belirlemeden önce konumlanarak, keşif sürecinin temel bir analitik adımı olarak işlev görür ve boru hattında yalnızca düzgün şekilde karakterize edilmiş moleküllerin ilerlemesini sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Saflaştırılmış proteinlerin oligomerik durumunu ve monodisperstesini doğrulayarak, hedef etkileşimi ve sinyalizasyon analizlerindeki yanlış pozitifleri azaltır.
- Tarama: Tarama analizlerinde kullanılan protein ligandlarının veya analitlerin iyi tanımlanmış ve homojen olmasını sağlayarak veri kalitesini ve hit onaylama oranlarını artırır.
- Analitik: Protein varyantlarının, mutantlarının veya formülasyon koşullarının doğrudan karşılaştırılmasını sağlayan ağırlık ortalamalı molar kütle, boyut ve kütle fraksiyonu çıktıları sunar.
- Translasyonel Araştırma: Glikoproteinleri ve membran protein komplekslerini doğal koşullara yakın şartlarda karakterize ederek, biyobelirteç ilgisini ve etki mekanizması çalışmalarını destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Laboratuvarların, doğrulanmış yöntemleri (örneğin BSA tabanlı) projeler genelinde geniş uygulama için kaydetmelerine olanak tanıyarak yöntem geliştirme süresini azaltır ve analitik kapasiteyi artırır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Konformasyondan bağımsız, kesin moleküler ağırlık tayini sağlayarak hedef kimliğine olan güveni artırır ve mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Boş enjeksiyonlar ve partikül izleme yoluyla sistem uygunluk kontrollerine olanak tanıyarak tekrarlanabilir çalışmalar sağlar ve kontaminasyon nedeniyle başarısız olan deneyleri minimize eder.
- Stratejik Değer: Agregasyon ve heterojenliğin erken tespitini destekleyerek formülasyon geliştirmeye bilgi sağlar ve instabilite nedeniyle geç aşamalarda meydana gelebilecek başarısızlık riskini azaltır.
- Portföy Etkisi: Biyofiziksel kaliteye dayalı, veri odaklı devam/dur kararları verilmesini sağlayarak sermaye verimliliğini artırır ve yalnızca iyi karakterize edilmiş adayların ilerlemesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Protein saflaştırma, tampon hazırlama ve MALS detektör hizalama ve normalizasyon prosedürleri dahil olmak üzere SEC-MALS sisteminin çalıştırılması konusunda uzmanlık gerektirir.
- Düşük gürültülü ışık saçılımı ve kırılma indisi detektörlerine sahip, kalibre edilmiş bir SEC-MALS sistemine ve uygun kolonlara (örneğin, BSA için 200 Å gözenek boyutu) erişime bağlıdır.
- Işığı saçabilecek ve veri kalitesini bozabilecek partikülleri ortadan kaldırmak için titiz numune ve tampon filtrasyonu (0.1–0.2 μm) ve sistem yıkama işlemi gereklidir.
- Geçerli moleküler ağırlık hesaplamaları için MALS yazılımına dn/dc ve UV ekstinksiyon katsayısı gibi proteine özgü parametrelerin doğru şekilde girilmesi gerekir.
- Monodisper ve çözünür numune gereksinimi ile sınırlıdır; kolon tıkanmasını ve sinyal artefaktlarını önlemek için çökelekler veya büyük agregatlar, enjeksiyondan önce santrifüj veya filtrasyon yoluyla uzaklaştırılmalıdır.
