Akım moleküler Analizi ve metastatik potansiyel değerlendirme için sirkülasyon tümör hücrelerinin mikromanipülasyon
14 Mayıs 2019
Burada, sirkülasyon tümör hücrelerini (CTCs) karakterize eden fenotifik ve moleküler özellikleri tanımlamak için entegre bir iş akışı sunuyoruz. Tek ve kümelenmiş CTCs 'lerin canlı immünostasyon ve robotik mikromanipülasyonunu, alt analiz ve metasrin-tohumlama yeteneğinin değerlendirilmesi için tek hücre bazlı tekniklerle birleştiriyoruz.
Bu protokol, tek bir hücre çözümünde sonraki downstream çözümlemesi için karışık hücre havuzundan tek hücrelerin algılanmasına ve seçilmesine olanak sağladığından özellikle alakalıdır. Bu tekniğin ana avantajı, yüksek saflık gerektiren bir dizi analiz için kan hücrelerinden bireysel dolaşan tümör hücreleri veya CTCs ayırmak için potansiyeldir. Mikromanipülatör yazılımını başlatarak ve mikromanipülörü açarak başlayın.
Mikromanipülörü bilgisayara bağlayın ve mikroskop aşamasındaki robot kolunu devreye almak için Connect and Initialize Device'ı tıklatın. Cihazın bilgisayar aracılığıyla manevra yapabilmesi için koruyucu kabinin dış ve iç yüzeylerini etanol ile temizleyin ve makinenin her manipülasyonundan sonra koruyucu kabini kapatın. Tüpteki kabarcıkları gidermek için robot koluna 20 ila 30 mikrometrelik yeni bir cam kılcal damar tonu ve floş sistemi yağı sistem üzerinden yükleyin.
Sterilizasyon tankını %70 etanol, steril çekirdeksiz su ile sterilizasyon tankı iki ve steril Dulbecco'nun PBS ile tampon tankı doldurun. Kılcal damarı %70 etanol ile iki kez sterilize edin ve terlizasyon tankını iki kez sterilizasyon tankı ile değiştirin ve kılcal damarı en az üç kez suda yıkayın için sterilizasyon işlevini kullanın. Mikromanipülatör yazılımında, yeni bir deneme başlatın ve otomatik ve manuel seçim modlarından toplama denemesini seçin.
Sterilizasyon tankının, tampon tankının ve biriktirme tepsisinin konumlarını belirtecek şekilde güverte tepsisini yapılandırın ve seçilen depotepsisindeki sıvı tankların sıcaklığını dört dereceye ayarlayın. Serbest bırakılan CTC çözeltisini içeren ultra düşük bir ek plakayı mikromanipülatör dolabının içine mikroskop altına yerleştirin. Kapağı tabaktan çıkarın ve dolabı kapatın.
Ortamın her kuyunun alt kısmında ele geçirilmesini sağlamak için her kuyuda 20 mikrolitre CTC kültür ortamı içeren 384 kuyuluk bir plakayı önplanda tonulayın ve plakayı dört derece santigrat derece seçilmiş mevduat tepsisinin hedef konumuna yerleştirin. Gerekli tüm kanalların çekme ve maruz kalma süresini manuel olarak seçin. İşleme yapmak ve pikap plakasının türünü seçmek için Iyi Gezinmeyi Göster'i seçin.
Daha sonra, görüş alanının merkezinde hücreler olmadan CTC çözeltisi içeren kuyunun ortasında bir toplama pozisyonu kalibre edin. Sensörü kullanarak kapillerile plakanın altına hafifçe dokunun ve pikap pozisyonunu plakanın alt kısmından 0,05 milimetre yüksekte ayarlayın. Kılcal damarlara zarar vermemek için robot kolunu bir seferde 10 mikrometre dikkatlice indirin.
Hücre türünü ve çekme parametrelerini seçin. Tek hücreli çekme için manuel modu seçin. Kuyu içinde cam kılcal gezinmek ve kuyu sınırından en az bir milimetre ilgi tek bir hücreüstüne kılcal yerleştirin joystick kullanın.
Ardından el ile parçacıklar ekleyin ve toplamayı başlatmak için Aktif Parçacıkları Seç'i seçin. Tüm hücreler toplandığında, her kuyunun altındaki hücreleri tortulamak için plakayı santrifüj edin. Anti-epitel hücre adezyon molekülü antikor ile biyo-amino boyama CD45 olumlu olaylardan doğru bir ayrım ile süspansiyon kanser hücrelerinin görüntülenmesi sağlar.
Hassas CTC izolasyonçevreleyen kirletici hücreler olmadan sadece istenilen hedefin aspirasyonu ile karakterizedir. Şüphelenildikçe, CTC kümeleri tek CtC'lere göre sağkalımda artış gösterir ve in-vitro kültürün 56 gün içinde hücre kolonilerine yol açar. Özellikle, CTC kümeleri de daha yüksek bir proliferasyon oranı sergiler ve böylece daha yüksek nihai hücre numaralarıulaşmak, diğer tümör hücreleri ile doğrudan temas tümör hücre canlılığı ve çoğalma oranı hem de bir etkisi olduğunu gösteren.
Doğrudan meme kanseri hastalarından izole CTCs tek hücreli RNA dizilimi tek CTCs türetilen tek hücreli bir T-distributed stochastic komşu gömme ortaya koymaktadır, CTC kümeleri, veya CTC beyaz kan hücresi kümeleri. Mikromanipülatörün akışkan sistemi içindeki hava kabarcıklarını çıkarmak ve verimli bir tek hücreli toplama sağlamak için toplama pozisyonunu kalibre etmek için cam kılcal damarı kurmayı unutmayın. Tek hücreli hücreler, metastatik süreci araştırmak için tek hücreli çözünürlükte ex-vivo analizi ve CTC karakterizasyonu sağlamak için yeni nesil sıralama için tohumlanabilir veya daha fazla işlenebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, dolaşan tümör hücrelerinin (CTC'lerin) fenotipik ve moleküler özelliklerini belirlemek için entegre bir iş akışı sunmaktadır. Bu yaklaşım, ayrıntılı analiz için canlı immünboyama ve robotik mikromanipülasyonu, tek hücre tabanlı tekniklerle birleştirmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Onkoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Dolaşan tümör hücreleri (CTCs), metastazın anlaşılması için kritik öneme sahiptir.
- Doğru analiz için CTC'lerin yüksek saflıkta izolasyonu gereklidir.
- Robotik mikromanipülasyon, hücre seçiminin hassasiyetini artırır.
- Tek hücre analizi, bireysel CTC'lerin davranışlarına dair içgörüler sağlar.
Çalışmanın Amacı
- CTC'leri izole etmek ve analiz etmek için bir iş akışı geliştirmek.
- Tekil CTC'lerin metastaz başlatma kapasitesini değerlendirmek.
- CTC'lerin fenotipik ve moleküler özelliklerinin tespitini iyileştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- CTC'lerin canlı immünboyaması.
- Hücre seçimi için robotik mikromanipülasyon.
- Alt analizler için tek hücre tabanlı teknikler.
- Metastaz ekme yeteneğinin değerlendirilmesi.
Temel Sonuçlar
- Karışık hücre popülasyonlarından tekil CTC'lerin başarılı şekilde izole edilmesi.
- Sonraki analizler için yüksek saflık elde edilmesi.
- CTC'lerin temel fenotipik ve moleküler özelliklerinin tanımlanması.
- Tekil CTC'lerin metastatik potansiyeline dair öngörüler.
Sonuçlar
- Entegre iş akışı, CTC'lerin çalışılmasını geliştirmektedir.
- Robotik mikromanipülasyon, tek hücre izolasyonu için etkilidir.
- Bu yaklaşım, kanser metastazının daha iyi anlaşılmasını sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Dolaşan tümör hücrelerinin (CTC'ler) tek hücreli mikromanipülasyonu, metastatik mekanizmaların anlaşılması için kritik olan yüksek saflıkta izolasyon ve ardından gelen moleküler analize olanak tanır. Bu iş akışı, metastazla ilgili yolakların belirlenmesinde öngörü güvenilirliğini destekler ve küme içi heterojenliği inceleyerek erken aşama portföy eleme süreçlerine veri sağlar. Bu yaklaşım, CTC karakterizasyonunu translasyonel onkoloji ve riske göre ayarlanmış ilerleme kararları için stratejik bir varlık olarak konumlandırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Fonksiyonel hedef doğrulaması için metastatik potansiyelin tek hücre düzeyinde sorgulanmasına olanak tanır.
- CTC alt popülasyonlarının sağkalım ve proliferasyon yeteneklerini ayırt ederek biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- İzole edilen CTC'lerin moleküler profillemesi aracılığıyla müdahale edilebilir zayıflıkların belirlenmesini kolaylaştırır.
- CTC kümeleri içindeki hücre-hücre etkileşimlerine dair mekanistik içgörü sağlar.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Fenotipik ve moleküler analizler için valide edilmiş tek hücreli ve küme türevli sistemler hazırlar.
- Tekrarlanabilirliği ve kantitatif çıktıyı sağlamak için CTC izolasyonunu ve işlemesini standartlaştırır.
- CTC türevli kültürlerin sağkalım ve proliferasyon metrikleri açısından güçlü bir şekilde taranmasını sağlar.
- Çeşitli kanser türleri ve hasta türevli örnekler için platformun yeniden kullanımını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Ex vivo ve in vivo CTC analizlerini hastalıkla ilişkili metastatik modellerle hizalar.
- Hasta örneğinden metastatik sürücülerin preklinik doğrulamasına kadar translasyonel sürekliliği sağlar.
- CTC fenotipleri genelinde metastatik potansiyeli nicelendirerek riske göre ayarlanmış kararlar alınmasına olanak tanır.
- Metastaz öngörüsü ve terapötik hedefleme için biyobelirteç keşfini destekler.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu mikromanipülasyon ve analiz iş akışı, hassas CTC izolasyonu ve karakterizasyonuna olanak tanıyarak erken keşif, öncü bileşik tanımlama ve translasyonel araştırma arasındaki bağı kurmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Metastatik mekanizmalar ve küme içi heterojenlik üzerine hipotez testlerini destekler.
- Tarama: İzole edilmiş CTC'lerden tekrarlanabilir, kantitatif sağkalım ve proliferasyon verileri sağlar.
- Analitik: Karşılaştırmalı analizler için tek hücre ve küme düzeyinde moleküler okumalar sunar.
- Translasyonel Araştırma: Hasta kaynaklı CTC verilerini preklinik metastaz modelleriyle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Onkoloji programları genelinde CTC analizi için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Metastatik riskteki öngörü güvenini ve hedef doğrulamasını artırır.
- Operasyonel Değer: Ölçeklenebilirlik için tek hücre izolasyonunu ve sonraki iş akışlarını standartlaştırır.
- Stratejik Değer: Metastatik sürücüleri ve hassasiyetleri netleştirerek devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: CTC kaynaklı içgörülere dayanarak onkoloji varlıklarının riskle uyumlu önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Mikromanipülasyon, immün boyama ve tek hücre analitiği konularında uzmanlık gerektirir.
- Robotik hücre seçimi ve sonraki moleküler analizler için özel enstrümantasyon gereklidir.
- Tekrarlanabilirlik ve veri karşılaştırılabilirliği için ekipler arası titiz bir standardizasyon gerektirir.
- Protokol optimizasyonu ile çeşitli kanser türlerine ve hastadan türetilen CTC örneklerine uyarlanabilir.
- Güçlü bir sonraki analiz süreci için örnek kalitesine ve CTC bolluğuna bağımlıdır.
