Çevirisel İmmüno-onkoloji (I-O) Araştırma için İnsani Periferik Kan Mononükleer Hücre (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Modeli

Protokolümüz, immüno-onkoloji araştırmaları için insan PBMC ve tümörlerle yeniden oluşturulmuş fare modellerinin oluşturulmasında genel bir kılavuz görevi görebilir. Bu prosedürler, insan tümör taşıyan farelerde insan bağışıklığını kısmen deri altı ve insan PBMC'sinin kanser ksenogreftleri ile karıştırma yoluyla kısmen yeniden oluşturmada uygun maliyetli ve son derece tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlar. Benimle prosedürleri gösteren Xinxin Cui, Yanjuan Zhang, Huichen Bai ve Xiaolong Yang, Farmakoloji Bölümü bize gönderdi.

Miyeloid hücre tükenmesi için intraperatal siklofosfamid kilogram başına 100mg teslim ve sözlü disulfiram kilogram başına 125mg teslim altı ila sekiz haftalık NOD / SCID dişi fareler iki gün boyunca günde bir kez. Siklofosfamid ve disülfiramın ikinci dozundan 24 saat sonra, altı taze izole edilmiş insan PBMC'sinin beş katı 10'u ve altı insan tümör hücre hattı hücresinin 2,5 katı ve hayvan başına 200 mikrolitre PBS artı %50 metrogel ve tüm hacmi subkutan olarak her deney hayvanının sağ kanadına enjekte edin. Dört ila altı hafta boyunca haftada iki kez primer tümör hacmini ölçün ve kaydedin.

Tümörler 200 ila 500 milimetre küp ortalama hacmine ulaştığında, her hayvandan tüm tümör hasat için optomik makas kullanın. PBMC donörleri tümör hücre hatları ve nispeten yüksek PD-1, PD-L1 ve CD8 ekspresyonu ile ılımlı tümör büyümesi ile sonuçlanan hasta türetilmiş ksenogreftler sonraki analizler için kullanılmalıdır. Hasat edilen tümör dokularının immünohistokimyasal analizi için, dehidratasyon dan 24 ila 72 saat önce örnekleri ve formalini düzeltin ve dokuların parafine gömülmesi.

Polilizin kaplı slaytlar üzerinde gömülü dokuların üç mikrometre bölümlerini edinin ve üç yedi dakikalık ksilen daldırma ile örnekleri deparafinize. Üçüncü tedaviden sonra, üç dakikalık dereceli alkol daldırma ile bölümleri nemlendirin. Daha sonra deiyonize suda slaytı üç kez durulayın ve fazla sıvıyı slaytlardan çıkarın.

Antijen alma gerçekleştirmek için, bir kap ta slaytlar yerleştirin ve 10 milimolar sodiyoitrat tampon ile slaytlar kapağı. Slaytları, kabı mikrodalgafırında 95 derecelik su banyosuna yerleştirmeden önce üç dakika ısıtın. Oda sıcaklığına kadar soğuttuktan sonra, deiyonize suda üç kez slaytları durulayın ve slaytlardan fazla sıvı aspire edin.

Endojen peroksidaz aktivitesini engellemek için 10 dakika boyunca %0.3 hidrojen peroksit ile inkübatve ardından %3 BSA ve PBS ile bir saat boyunca bloke edilir. Hidrojen peroksit kuluçka sonunda, bir gecede dört derece santigrat uygun birincil antikorlar ile slaytlar etiket. Ertesi sabah, kahverengi boyama uygun bir düzeyde ışık mikroskopisi tarafından gözlenene kadar slaytlar üzerine substrat dropwise uygulamadan önce oda sıcaklığında bir saat boyunca horseradish peroksidaz konjuge ikincil antikor ile slaytlar tedavi.

Sonra, hematoksilin ile örnekleri leke. Bir dakika sonra, distile su ile reaksiyonu durdurmak sonra% 0.5 hidroklorik asit alkol beş saniye daldırma ve% 0.5 amonya su beş saniye. Sonra üç artan üç dakika etanol ve üç, beş dakika ksilen daldırma ile örnekleri dehydrate.

İlgi çekici bir ilacın antitümör aktivitesini değerlendirmek için, planlanan deneysel protokole göre hücre aşısı gününde tedaviye başlamak ve dört ila altı hafta boyunca haftada iki kez primer tümör hacmini izlemek. PharmaCODE dinamik analiz için tümör bağışıklık hücreleri sızmış, küçük parçalar halinde tümör dokuları kıyma ve kollajenaz tip bir ve DNase I ve RPMI-1640 orta artı 5% FBS ile parçaları sindirmek 37 santigrat derece 30 dakika. Sindirim sonunda, tek bir hücre süspansiyon elde etmek ve santrifüj ile hücreleri toplamak için 40 mikrometre hücre süzgeci ile sindirilmiş doku filtre.

Buz gibi faks tampon konsantrasyonunun mililitre başına yedinci hücrelerin bir kez 10'u peleti yeniden askıya alın ve eşit miktardaki hücreyi 96 kuyulu yuvarlak alt plakadaki uygun sayıdaki kuyuya aktarın. Hücreleri santrifüj ile toplayın ve spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için 30 dakika boyunca insan IGG mililitre başına 20 mikrogram pelet leri yeniden askıya alın. Daha sonra hücreleri standart protokollere göre akış sitometrisi ile analizetmeden önce 4 santigrat derecede 30 dakika boyunca uygun primer antikorlarla lekeleyin.

Gösterildiği gibi, kilogram siklofosfamid başına 100 miligram ve kilogram disülfüram miyeloablasyon başına 125 miligram nötrofiller ve monositlerin tedavi sonrası dört gün önemli bir tükenmesi ile sonuçlanır. İnsan PBMC ve tümör naklinden sonra, immünohistokimya ile tümör mikroortamında insan immün hücre infiltratlarının varlığı doğrulanabilir. PBMC donörlerinden oluşan bir panelin in vivo taraması, tümör mikroortamına kabul edilebilir bir tümör büyüme hızında nispeten yüksek immün hücre infiltrasyonunun varlığını doğrulamak için yapılabilir.

Farklı kanser türlerinin hasta kaynaklı ksenogreftlerinde insan kanser hücresi hatları da tümör büyüme hızı ve immün hücre infiltrasyonu değerlendirmek için değerlendirilebilir. Bu temsili deneyde PBMC ve aşılı insanlaşmış insanlaştırılmış anti-PD1 antikorlu farelerin tedavisi önemli antitümör aktiviteleri ile sonuçlandı. Disulfiram siklofosfamidin ürotoksisitesini azaltır, kombinasyon farelerde daha uzun süreli nötropeni etkileri uygulayabilir.

Siklofosfamid ve disülfiramın tam doz rejiminin önceden belirlenmesi gerekebilir. Daha kolay insan bağışıklığı reconstitution ve azalmış ksenojenik GvHD etkisi için daha immünofiksli farelerin yeni suşları tespit edilmiştir ve belgelenmiş protokol ile daha fazla araştırma bekliyor. Modelimiz T-hücre çekici kanser immün tedavileri değerlendirmek için yararlıdır, özellikle kısa zaman çizelgeleri üzerinde çalışırken veya daha karmaşık bir multilineage bağışıklık modeli geçmeden önce ajanları seçmek için.