Name: LC-MS/MS tanılama parçalanma filtreleme ile doğal ürün keşfi: Microcystin analizi için uygulama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Keşfedin tanılama parçalanma filtreleme yöntemiyle karmaşık karışımlardan doğal ürün keşfi. MZmine yazılımı ve LC-MS/MS kullanarak mikrosistin toksinlerini tespit edin, gıda güvenliği ve biyoürün geliştirme için yeni bileşikler bulun.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Heather Roshon (Kanadalı Phycological Kültür Merkezi, Waterloo Üniversitesi ve teknik yardım için Sawsan Abusharkh (Carleton Üniversitesi) çalıştı siyanobacteria kültürü sağlamak için teşekkür ederiz.

1. hedeflenen olmayan sıvı kromatografi (LC)-MS/MS veri kümeleri hazırlanması
Not: DFF, bir hedef sınıf analitiği için optimize edilmiş herhangi bir yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ve analitik yöntem kullanılarak gerçekleştirilebilir. Orbitrap kütle spektrometresi üzerinde MC optimize LC-MS/MS koşulları malzeme tablosundalistelenmiştir.
<ol><li>
MZmine 2 indirme (http://mzmine.github.io/) Not: örnek veri CPCC300. RAW https://drive.google.com/open?id=1HHbLdvxCMycSasyNXPRqIe5pkaSqQoS0 adresinde bulabilirsiniz.<ol>
<li>Ham veri yöntemleri açılır menüsünden ham veri alma seçeneğini seçin.</li>
		<li>Analiz edilecek veri dosyalarını seçin. Tek veya birden çok dosya içe aktarılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isteğe bağlı Satıcı veri formatı MZmine tarafından desteklenmiyorsa, Centro,. mzml veri dosyalarını oluşturmak için Proteowizard16 kullanın.<ol>
<li>Satıcı tarafından sağlanan centroiding algoritmasını uygulamak için en yüksek malzeme çekme filtresini seçin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. alınan DDA dosyalarının tanılama parçalanma filtreleme
<ol><li>İmleci kullanarak, ana MZmine ekranının RAW veri dosyaları sütunundaki veri dosyalarını seçin ve vurgulayın.</li>
	<li>Görselleştirme açılır menüsünün altında Tanılama parçalanma filtreleme seçeneğini belirleyin.</li>
	<li>Görünen DFF iletişim kutusunda (Şekil 3), aşağıdaki seçenekleri girin:<ol>
<li>Bekletme süresi – Otomatik aralığı kullanın veya hedeflenen analitik sınıf elute zaman dakika olarak bekletme süreleri aralığını tanımlayın.</li>
		<li>
Precursor m/z -kullanım Auto Range veya uygun olduğunda birden fazla şarj edilmiş bileşikler için olasılığı da dahil olmak üzere analitlerin hedeflenen sınıfının m/z aralığını tanımlayın.</li>
		<li>
m/z tolerans – Msınstrument 'un ulaşılabilen MS/MS kütle doğruluğunu girin; 0,01 m/z veya 3,0 ppm bir Orbitrap platformu için uygundur. Yalnızca tanılama ürün iyonlarının incelenecek, giriş 0,0 Tanılama nötr kaybı değeri (da) seçeneğine girin. Tersine, sadece teşhis nötr kayıplar incelenecek ise, giriş 0,0 Tanılama ürün iyonlarına (m/z) seçeneğine girin.</li>
		<li>
Tanılama ürün iyonlarının (m/z) – sınıfına özel ürün iyon (lar) m/z. Birden fazla ürün iyonu virgülle ayırın. Not: birden fazla ürün iyonlarının Içeri konulmaları, listelenen tüm ürün iyonlarının bulunduğu spektrumları görselleştirecektir.</li>
		<li>
Tanılama nötr kaybı değeri (da) – sınıfın spesifik nötr kaybını (es) girin. Birden fazla nötr kayıpları virgülle ayırın. Not: birden fazla nötr kayıpların Içeri konulmak tüm listelenen nötr kayıplar içeren spektrumları görselleştirecektir. Hem diagnostik ürün iyonlarının hem de nötraller kayıplarının içine girmeden tüm kriterleri karşılayan spektrumları görselleştirecektir.</li>
		<li>
Minimum tanı iyon yoğunluğu (% baz tepe) – MS/MS spektrumlarının baz zirvesinde% olarak, teşhis edilen ürün iyonları ve/veya nötr kayıplar için asgari yoğunluğun tanımlanması.</li>
		<li>
Peaklist çıktı dosyası – sonuçları çıktısını almak için bir yol ve dosya adı seçin.</li>
		<li>DFF analizini başlatmak için Tamam düğmesini tıklatın. Yukarıdaki adımları başarıyla tamamladıktan sonra bir DFF grafiği görünecektir Not: Iki. csv veri dosyaları oluşturulur. {Peaklist çıktı dosyası}. csv , taramaların öncüsü m/z, tarama numaraları ve saklama sürelerini içerir. Bu ham veri yöntemleri de dahil olmak üzere mevcut MZmine modüllerinde kullanılabilir > tepe algılama > hedeflenen tepe algılama tanımlanan dff kriterleri bir araya geldi öncülerin çıkarılan iyon kromatogramları oluşturmak için. {Peaklist çıkış dosyası} _data. csv , m/z, ürün iyon m/z ve mzmine dışında dff araziler nesil izin saklama süreleri içerir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. microcystin analizi için DFF örnek kullanımı
<ol><li>
Numune hazırlama
	<ol>
<li>Sterilizasyon 250 mL Erlenmeyer 30 mL steril MA medya17 veya diğer siyanobacteria büyüme medya (BG-11) içeren flsorların köpük stoper ile donatılmıştır.</li>
		<li>Aseptik koşullarda yaklaşık 5 × 105 hücre ml-1 için bir siyanobacteria kültürü ile sterilize büyüme medya inoculate. Bir hemokytometer ile monitör hücre yoğunluğu. Bu örnekte, 27 °C ' de M. aeruginosa strain CPCC300 photoautotrofiically büyütün, soğuk beyaz floresan ışık ile aydınlatılır (30 μe M-2 s-1) 12 h ışık kullanarak: 12 saat karanlık rejim. Hücreleri günde bir kez girdap.</li>
		<li>47 mm çapında GF/C cam mikrofiber filtre kağıtları kullanılarak vakum filtrasyon ile 26 gün sonra kültür ortamından hücreleri ayırın.</li>
		<li>14 mL test tüpünde hasat edilen hücrelere 3 mL 80% metanol (aq) ekleyin.</li>
		<li>Vortex ve daha sonra 30 s için siyanobacteria hücreleri içeren test tüpü (ler) sonikat. Test tüpünü (s)-20 °C ' de 1 h için saklayın. test tüpü oda sıcaklığına dönün ve numunenin (s) 15 dakika boyunca çözülmesine izin verin.</li>
		<li>Hücrelerin etkili bir şekilde Lyse için iki ek kez 3.1.5 adım yineleyin.</li>
		<li>Elde edilen siyanobacteria hücre ekstresini 0,22 μm PTFE şırınga filtresi (ler) ile filtreleyin.</li>
		<li>Hafif bir azot gazı akışı kullanarak 30 °C sıcaklıkta bir evaporatör ile Kuru özü (ler). Özü-20 °C ' de LC-MS/MS analizine kadar kuru saklayın.</li>
		<li>Analiz öncesinde kehribar HPLC şişede 30 sn 500 μL,% 90 metanol (aq) ve Vortex ile kurutulmuş kalıntıyı yeniden oluşturur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi üzerinde DDA edinme yöntemini kullanarak siyanobacteria ekstresi analiz edin. Not: burada kullanılan MC analizi için en iyileştirilmiş LC-MS koşulları malzeme tablosundalistelenir.</li>
	<li>Hazırlamak DDA DataFile (s) ve MZmine içine ithalat adımları 1,1 ve 1,2 aşağıdaki.</li>
	<li>Meta dosyaları seçin ve 2.1-2.2 adımlarını izleyerek DFF modüllerini başlatın.</li>
	<li>MC analizi için, DFF modülü içinde aşağıdaki ayarları kullanın (Şekil 3).<ol>
<li>
Bekletme süresi – 2,00 aralığında giriş 6,00 dk.</li>
		<li>
Precursor m/z – giriş m/z aralığı 430,00 için 1200,00.</li>
		<li>
m/z tolerans – 0,01 m/z veya 3,0 ppm m/z toleransı uygulayın.</li>
		<li>
Tanılama ürün iyonlarının (m/z) – giriş m/z 135,0803, 163,1114 tanı ürün iyonları olarak</li>
		<li>
Tanılama nötr kaybı değeri (da) – giriş 0,0 tanılama nötr kayıpların kullanıldığını tanımlamak için.</li>
		<li>
Minimum tanı iyon yoğunluğu (% baz tepe) – kullanım 15,00 asgari yoğunluk eşik olarak</li>
		<li>
Peaklist çıktı dosyası – çıktı dosyasını putative_MCs. csvolarak tanımlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DFF analizini başlatmak için Tamam düğmesini tıklatın. Yukarıdaki adımları başarıyla tamamladıktan sonra bir DFF grafiği (Şekil 4) görünecektir</li>
</ol>

<ol><li>Mayer, P. M., Poon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+collisional+activation+of+ions+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrometry+Reviews%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of collisional activation of ions in mass spectrometry.</a> Mass Spectrometry Reviews. 28 (4), 608-639 (2009).</li>
<li>Fisch, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+natural+products+by+microbial+iterative+hybrid+PKS%E2%80%93NRPS%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of natural products by microbial iterative hybrid PKS–NRPS.</a> RSC Advances. 3 (40), 18228-18247 (2013).</li>
<li>Kelman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+six+new+Alternaria+sulfoconjugated+metabolites+by+high-resolution+neutral+loss+filtering%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Identification of six new Alternaria sulfoconjugated metabolites by high-resolution neutral loss filtering.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (19), 1805-1810 (2015).</li>
<li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., Qi, T. F., Seifert, K. A., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product+ion+filtering+with+rapid+polarity+switching+for+the+detection+of+all+fumonisins+and+AAL-toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Product ion filtering with rapid polarity switching for the detection of all fumonisins and AAL-toxins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 29 (22), 2131-2139 (2015).</li>
<li>Renaud, J. B., Kelman, M. J., McMullin, D. R., Yeung, K. K. -C., Sumarah, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+C8+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+enniatins+and+bassianolides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Application of C8 liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the analysis of enniatins and bassianolides.</a> Journal of Chromatography A. 1508, 65-72 (2017).</li>
<li>Walsh, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+Fragmentation+Filtering+for+the+Discovery+of+New+Chaetoglobosins+and+Cytochalasins%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Diagnostic Fragmentation Filtering for the Discovery of New Chaetoglobosins and Cytochalasins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. , (2018).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature biotechnology. 34 (8), 828(2016).</li>
<li>Bartók, T., Szécsi, Á, Szekeres, A., Mesterházy, Á, Bartók, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+new+fumonisin+mycotoxins+and+fumonisin-like+compounds+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%3A+An+International+Journal+Devoted+to+the+Rapid+Dissemination+of+Up-to-the-Minute+Research+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Detection of new fumonisin mycotoxins and fumonisin-like compounds by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry: An International Journal Devoted to the Rapid Dissemination of Up-to-the-Minute Research in Mass Spectrometry. 20 (16), 2447-2462 (2006).</li>
<li>Bartók, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+characterization+of+twenty-eight+isomers+of+fumonisin+B1+%28FB1%29+mycotoxin+in+a+solid+rice+culture+infected+with+Fusarium+verticillioides+by+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+time-of-flight+and+ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Detection and characterization of twenty-eight isomers of fumonisin B1 (FB1) mycotoxin in a solid rice culture infected with Fusarium verticillioides by reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization time-of-flight and ion trap mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (1), 35-42 (2010).</li>
<li>Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Orešič, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MZmine+2%3A+modular+framework+for+processing%2C+visualizing%2C+and+analyzing+mass+spectrometry-based+molecular+profile+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MZmine 2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data.</a> BMC bioinformatics. 11 (1), 395(2010).</li>
<li>Spoof, L., Catherine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appendix+3%3A+tables+of+microcystins+and+nodularins%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+cyanobacterial+monitoring+and+cyanotoxin+analysis%22%5BJournal%5D)">Appendix 3: tables of microcystins and nodularins.</a> Handbook of cyanobacterial monitoring and cyanotoxin analysis. , 526-537 (2016).</li>
<li>Pick, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blooming+algae%3A+a+Canadian+perspective+on+the+rise+of+toxic+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Fisheries+and+Aquatic+Sciences%22%5BJournal%5D)">Blooming algae: a Canadian perspective on the rise of toxic cyanobacteria.</a> Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (7), 1149-1158 (2016).</li>
<li>Carmichael, W. W., Boyer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Health+impacts+from+cyanobacteria+harmful+algae+blooms%3A+Implications+for+the+North+American+Great+Lakes%5BTitle%5D)+AND+%22Harmful+algae%22%5BJournal%5D)">Health impacts from cyanobacteria harmful algae blooms: Implications for the North American Great Lakes.</a> Harmful algae. 54, 194-212 (2016).</li>
<li>Mayumi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+microcystins+by+LC%2FMS%2FMS+under+ion+trap+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+antibiotics%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of microcystins by LC/MS/MS under ion trap conditions.</a> The Journal of antibiotics. 59 (11), 710(2006).</li>
<li>Frias, H. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+electrospray+tandem+mass+spectrometry+for+identification+of+microcystins+during+a+cyanobacterial+bloom+event%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Use of electrospray tandem mass spectrometry for identification of microcystins during a cyanobacterial bloom event.</a> Biochemical and biophysical research communications. 344 (3), 741-746 (2006).</li>
<li>Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProteoWizard%3A+open+source+software+for+rapid+proteomics+tools+development%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development.</a> Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).</li>
<li>Watanabe, M. F., Oishi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+environmental+factors+on+toxicity+of+a+cyanobacterium+%28Microcystis+aeruginosa%29+under+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Effects of environmental factors on toxicity of a cyanobacterium (Microcystis aeruginosa) under culture conditions.</a> Applied and Environmental microbiology. 49 (5), 1342-1344 (1985).</li>
<li>Hollingdale, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+study+on+production+of+a+matrix+reference+material+for+cyanobacterial+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Feasibility study on production of a matrix reference material for cyanobacterial toxins.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 407 (18), 5353-5363 (2015).</li>
<li>Yuan, M., Namikoshi, M., Otsuki, A., Sivonen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+amino+acid+side-chain+on+fragmentation+of+cyclic+peptide+ions%3A+differences+of+electrospray+ionization%2Fcollision-induced+decomposition+mass+spectra+of+toxic+heptapeptide+microcystins+containing+ADMAdda+instead+of+Adda%5BTitle%5D)+AND+%22European+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Effect of amino acid side-chain on fragmentation of cyclic peptide ions: differences of electrospray ionization/collision-induced decomposition mass spectra of toxic heptapeptide microcystins containing ADMAdda instead of Adda.</a> European Mass Spectrometry. 4 (4), 287-298 (1998).</li>
<li>Schymanski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+small+molecules+via+high+resolution+mass+spectrometry%3A+communicating+confidence%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+science+%26+technology%22%5BJournal%5D)">Identifying small molecules via high resolution mass spectrometry: communicating confidence.</a> Environmental science & technology. 48 (4), 2097(2014).</li>
</ol>

Yazarlar açıklamak için hiçbir şey var

DFF, özellikle doğal ürün bileşik keşfi için ilgili bileşiklerin tüm sınıfları algılamak için bir düz ileri ve hızlı bir stratejidir. DFF en önemli yönü bileşiklerin hedeflenen sınıf için özel MS/MS parçalanma kriterleri tanımlayarak. Bu temsili örnekte, M. aeruginosa hücresel ekstresinin Içinde bulunan MCS Içeren tüm adda kalıntılarını algılamak için dff kullanılmıştır. MCs büyük çoğunluğu bir adda kalıntı içerse de, bu pozisyonda diğer kalıntılar bilinmektedir, özellikle demetil-ve acetyldemethyl-adda türevler...

Tandem kütle spektrometresi (MS/MS), çatışmaya bağlı ayrışma (CID)1gibi aktivasyon enerjisinin uygulanması yoluyla bir öncülü iyon yalıtmasını ve parçalanma yapılmasını içeren yaygın olarak kullanılan bir kitle spektrometresi yöntemidir. Bir iyon parçalarının moleküler yapısına yakından bağlı olduğu şekilde. Doğal ürünler genellikle tek bir benzersiz kimyasal olarak yerine yapısal benzer bileşiklerin karışımları olarak biyosentezlenmiş2. Aynı biyosentetik sınıfın parçası olan yapısal olarak ilgili bileşikler genellikle paylaşılan ürün iyonları ve/veya nötr kayıplar dahil olmak üzere anahtar MS/MS parçalanma özelliklerini paylaşır. Sınıf özel ürün iyonlarına ve/veya nötr kayıplara sahip bileşikler için karmaşık örnekleri ekran yeteneği, potansiyel olarak yeni doğal ürünlerin keşfi için önde gelen bileşiklerin tüm sınıflarını algılamak için güçlü bir stratejidir3, 4 , 5 , 6. on yıllardır, tarafsız kayıp taraması ve düşük çözünürlüklü enstrümanlara yapılan habercisi iyon taraması gibi kütle spektrometresi yöntemleri, aynı nötr kayıp veya ürün iyonlarına sahip iyonların algılanmasına izin verdi. Ancak, deneyleri gerçekleştirmeden önce tanımlanması gereken belirli iyonlar veya geçişler. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometre araştırma laboratuvarlarında daha popüler hale gelmiştir gibi, karmaşık örnekler artık genellikle hedeflenen olmayan, veriye bağımlı edinme (DDA) yöntemleri kullanılarak ekranlaştırılmış. Geleneksel nötr kayıp ve öncü iyon taramasının aksine, yapısal olarak ilgili bileşikler Post-Acquisition Analizi7ile tespit edilebilir. Bu çalışmanın içinde, karmaşık matrisler içindeki bileşiklerin tüm sınıflarını algılamak için teşhis parçalanma filtreleme (dff)5,6, bir düz ileri ve Kullanıcı dostu bir yaklaşım geliştirdiğimiz bir strateji gösteriyoruz. Bu DFF modülü açık kaynak, MZmine 2 platformu ve MZmine 2,38 veya daha yeni bültenleri indirerek kullanılabilir içine uygulandı. DFF kullanıcıların verimli ürün iyon (lar) ve/veya nötr kaybı (ler) içeren MS/MS Spectra için DDA veri kümeleri ekran sağlar bileşiklerin tüm sınıfları için teşhis. DFF bir sınırlama karakteristik ürün iyonları ve/veya bileşik bir sınıf için nötr kayıplar analist tarafından tanımlanmalıdır.
Örneğin, her biri daha fazla 60 farklı fumonisin Mikotoksinler tanımlanan 8/8bir tricarballylic yan zincir sahip, bir m/z üretir 157,0142 (C6H5O5-) ürün iyon üzerine [M-H]- Ion4' ün parçalanma. Bu nedenle, bir örnekte tüm sözde fumonisinlerden belirgin m/z 157,0142 ürün iyon içeren bir DDA veri kümesi içinde tüm MS/MS Spectra taramasında dff kullanılarak tespit edilebilir. Benzer şekilde, sülflu bileşikler 79,9574 da (SO3)3tanı nötr kaybı içeren MS/MS Spectra için DDA veri kümeleri tarama tarafından tespit edilebilir. Bu yaklaşım, yeni döngüsel peptidler tespit etmek için de başarıyla uygulanmıştır5 ve triptofan veya Fenilalanin kalıntıları içeren doğal ürünler6.
DFF ve MZmine platformu10içinde kullanım kolaylığı etkinliğini göstermek için, biz microcystins (MCS) analizine bu yaklaşımı uyguladıysanız; tatlı su siyanobacteria11,12,13tarafından üretilen üzerinde 240 yapısal olarak ilgili toksinler bir sınıf.
En sık bildirilen cyanotoksinler MCS, MC-LR ile (leucine [L]/argine [R]) türdeş sıkça okudu (Şekil 1). MCS, mikrocystis, anabaena, nostis ve planktothrix12,13gibi multipl siyanobacteria cins ile biyosentezlenmiş monokikrik olmayan ribozomal heptapeptidler. MCs beş ortak kalıntıları ve L-amino asitler tarafından işgal iki değişken pozisyonları oluşur. Neredeyse tüm MCs bir karakteristik β-amino asit 3-amino-9-metoksi-2, 6, 8-trimetil-10-fenildeca-4, 6-dienoik asit (adda) pozisyonunda kalıntı 511.  MCS MS/MS parçalanma yolları iyi açıklanan14,15; Adda kalıntı, önemli MS/MS ürün iyon, m/z 135,0803+ (c9H11O+) ve m/z 163,1114+ (c11h 15 gibi diğer ürün iyonlarından sorumludur. O+) (Şekil 2). Microcystis aeruginosa hücresel özler hedef olmayan DDA veri kümeleri, bu tanı iyonlarının kullanıldığı tüm mikrocystinler için ekranlı olabilir, Microcystins bir adda kalıntı var verilen.

<table><tbody><tr><td>Cyanobacteria</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcystis aeruginosaCPCC300</td><td>KANADA FİKOLOJİK KÜLTÜR MERKEZİ</td><td></td> CPCC300 <td>https://uwaterloo.ca/canadian-phycological-culture-centre/</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteowizard (yazılım)</td><td></td><td>yazılımı</td><td>http://proteowizard.sourceforge.net/</td></tr> <tr><td>Mzmine 2</td><td></td><td>yazılımı</td><td>http://mzmine.github.io/</td></tr><tr><td>LC-MS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q-Exactive Orbitrap</td><td></td><td></td> <td>Termo-HESI iyonizasyon kaynağı</td></tr><tr><td>1290 UHPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td>ile donatılmıştır İkili pompa, otomatik numune alma cihazı, kolon bölmesi</td></tr><tr><td>C18 kolonu</td> <td>ile donatılmıştırAgilent</td><td>959757-902</td><td>Eclipse Plus C18 RRHD sütunu (2.1 & kez; 100 mm, 1.8 & mu; m)</td></tr> <tr><td>< güçlü > Çözücüler< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Optima LC-MS sınıfı Metanol</td><td>Fisher</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>OptimaLC-MS sınıfı Asetonitril</td><td>Fisher</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>OptimaLC-MS sınıfı Su</td><td>Fisher</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS sınıfı Formik Asit</td><td>Fisher</td><td>A11710X1-AMP</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Bilimsel Endüstriler</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Sorvall Micro 21</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-772-436</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Diğer</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amber HPLC şişeleri 2 mL/kapaklar</td><td>Agilent</td><td>5182-0716 / 5182-0717</td><td></td></tr><tr><td>0.2-&mu; m PTFE şırınga filtreleri</td><td>Pall Corp.</td><td>4521</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 47mm GF / A cam mikrofiber filtreler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1820047</td><td></td></tr><tr><td>Media<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>em>MA ortamı (pH 8.6) (miktar / L)</td><td></td><td></td><td>Watanabe, MF & Oishi, S. Çevresel faktörlerin kültür koşulları altında bir siyanobakterinin (Microcystis aeruginosa) toksisitesi üzerindeki etkileri. Uygulamalı ve Çevresel mikrobiyoloji. 49 (5), 1342-1344 (1985).</td></tr><tr><td>Ca (HAYIR < alt > 3 < / alt >) ve orta nokta; 4H < alt > 2 O, 50 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2786</td><td></td></tr><tr><td>KNO<3 / sub>, 100 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8291</td><td></td></tr><tr><td>NaNO3, 50 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5022</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4, 40 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5640</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 2 ve orta nokta; </alt>6H20, 50 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum gliserofosfat, 100 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>H3BO3, 20 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Bicine, 500 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES1151B-B7</td><td></td></tr><tr><td></td><td><güçlü>P(IV) metal çözeltisi, 5 mL</td><td></td><td></td></tr><tr><td> ddH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaEDTA&middot ile aşağıdakileri 1 L'ye getirin; 2HO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6635</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3 ve orta nokta; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&middot; 4H2O</td><td>Baker</td><td>2540</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0152</td><td></td></tr><tr><td>CoCl2&middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot; 2H2O</td><td>Baker</td><td>3764</td><td></td></tr><tr><td>Siyanobakteriler BG-11 50X Tatlı Su Çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3061-500mL</td><td></td></tr></tbody></table>

lc-ms/ms tanılama parçalanma filtreleme ile doğal ürün keşfi: microcystin analizi için uygulama

Natural Product Discovery with LC-MS/MS Diagnostic Fragmentation Filtering: Application for Microcystin Analysis

Doğal ürünler genellikle tek bir bileşik yerine, yapısal olarak benzer bileşiklerin karışımları olarak biyosentezlenmiş. Ortak yapısal özellikleri nedeniyle, aynı sınıf içinde birçok bileşikler benzer MS/MS parçalanma geçmesi ve birkaç özdeş ürün iyonları ve/veya nötr kayıplar var. Tanılama parçalanma filtreleme (DFF) amacı, belirli bir sınıfın tüm bileşiklerini, sınıf özel ürün iyonlarını ve/veya nötr kayıpları içeren MS/MS spektrumları için hedeflenen olmayan LC-MS/MS veri kümelerini taramadan karmaşık bir ekstrakte verimli bir şekilde algılayabilmelerdir. Bu yöntem, açık kaynak MZmine platformu içinde uygulanan bir DFF modülüne dayanmaktadır, örnek ekstreler, dört ayaklı Orbitrap veya dört ayaklı zaman-uçuş kütlesi gibi yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi üzerinde veriye bağımlı edinimi tarafından analiz edilmelidir Analizörleri. Bu yaklaşımın ana sınırlaması, analist ilk olarak hangi ürün iyonlarını ve/veya nötr kayıpların hedeflenen doğal ürünlerin sınıfı için spesifik olduğunu tanımlamalıdır. DFF yeni bileşikler de dahil olmak üzere karmaşık bir örnek içinde tüm ilgili doğal ürünlerin sonraki keşfi için izin verir. Bu çalışma, biz Microcystis aeruginosa, mikrocystins üretimi için siyanobacteria neden belirgin bir zararlı alg çiçek ekstraktlarının taramaları ile dff etkinliğini göstermektedir.

M. aeruginosa CPCC300 analizinin ardından oluşturulan dff Arsa Şekil 4' te gösterilir. Bu grafinin xekseni, yekseni MCS MS/MS spektrumunda bulunan tüm ürün iyonlarının m/z 'yi gösterirken, tanımlanan dff ölçütlerini karşılayan öncü iyonlarının m/z 'dir. Bu analiz için, MC algılama kriterleri, 440-1200 m/z aralığı içinde habercisi iyonlarının dahil, 2.00 – 6.00 dk arasında saklama süreleri. En önemlisi, bu ...

Tanı parçalanma, MZmine uygulanan filtreleme, bilinen ve bilinmeyen doğal ürünlerin tüm sınıflar için LC-MS/MS veri kümeleri ekrana zarif, post-edinme yaklaşımdır. Bu araç, analistin bileşiklerin tüm sınıfı için teşhis olarak tanımladığı ürün iyonlarına ve/veya nötr kayıplara yönelik MS/MS spektrumlarını arar.

LC-MS/MS tanılama parçalanma filtreleme ile doğal ürün keşfi: Microcystin analizi için uygulama

Natural products are often biosynthesized as mixtures of structurally similar compounds, rather than a single compound. Due to their common structural ...

Doğal ürünler genellikle bileşiklerin bir sınıf olarak biyosentez, tek bir ürün olarak değil. Tanısal parçalanma filtreleme karmaşık bir karışım içinde tüm yapısal ilişkili bileşikleri tespit etmek için basit bir yaklaşımdır. MZmine yazılımı içinde uygulanan tanısal parçalanma filtreleme, analistaksi takdirde cevapsız olacak yeni doğal ürünler için kütle spektrometresi veri setleri keşfetmek için izin verir.Bu yeni biyoürünler ve aynı zamanda yeni toksinler içerir. Gıda ve suyu kirleten toksin sınıflarına uygulanan tanısal parçalanma filtreleme, maruziyet değerlendirmelerini bilgilendirebilir. Mikrobiyal ve bitki özleri uygulandığında, yeni bileşiklerin keşfi neden olabilir.Tanısal parçalanma filtreleme nin kullanılması, kimyasal sınıfı tanımlayan anahtar tandem kütle spektrometresi özelliklerinin anlaşılmasını gerektirir. Bu yapısal olarak benzer bileşikler karakteristik iyonlar üretecek anlamına gelir. Benim adım Shawn Hoogstra.Merkezimizde araştırma teknisyeni ve yazılım geliştiricisiyim ve prosedürü sergileyecekim. Mikrosistin analizi için bir örnek hazırlamak için, 30 mililitre steril siyanobakteri büyüme ortamını mililitre başına yaklaşık beş kat-10-5 hücrelere, aseptik koşullarda, 250 mililitrelik Erlenmeyer şişelerinde, hücre yoğunluğunu hemositometre ile izleyerek. 26 günlük fotoototrofik kültürden sonra, 27 santigrat derecede 12 saatlik açık-koyu bir rejim kullanarak soğuk beyaz floresan ışıkla aydınlatıldıktan sonra, günde bir kez dönen 47 mililitre lik GF/C cam mikrofiber filtre kağıtları kullanarak hücreleri vakum filtrasyon ile kültür ortamından ayırın.14 mililitrelik test tüplerinde hasat edilen hücrelere üç mililitre %80 metanol ekleyin ve girdap ve daha sonra her tüpü 30 saniye sonicate. Sonication sonra, üç ardışık bir saat, eksi-20 derece-Santigrat dondurma ve 15 dakikalık oda sıcaklığında çözülme döngüleri ile örnekleri lyse ve tek tek 0,22 mikrometre politetrafloroetilen şırınga filtreleri ile ortaya çıkan siyanobakteri hücre ekstresi filtre. Azot gazı nazik bir akım kullanarak, 30 santigrat derece bir buharlaştırıcı ile ayıklar kuru ve eksi-20 santigrat derece kuru özleri saklayın.Sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi analizi için, kurutulmuş kalıntıyı %90 metanol500 mikrolitre ile analiz edilecek şekilde yeniden oluşturur ve numuneleri 30 saniye boyunca girdap. Amber yüksek basınçlı sıvı kromatografi şişesine aktarın. Daha sonra standart protokollere göre yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi üzerinde veriye bağlı bir kazanım yöntemi kullanarak siyanobakteri ekstresini analiz edin.Mikrostinlerin çoğu tandem kütle spektrometresi, M ile Z 135.0803 ve 163.1114 olmak üzere iki tanısal ürün iyonu üreten bir ATA kalıntısı içerir. Hedeflenmemiş sıvı kromatografi spektrografi veri seti hazırlama için MZmine 2'yi açın ve Raw veri alma yöntemleri altında "drop-down menüsü" seçeneğini belirleyin. Ardından mikrosistin çözümlemesi veri dosyalarını seçin ve satıcı tarafından sağlanan santrifüj algoritması uygulamak için tepe çekme filtresini seçin.Alınan veribağımlı edinme dosyalarının tanısal parçalanma filtreleme veya DFF için, veri dosyalarını vurgulamak için imleci kullanın ve DFF seçeneğini seçmek için Visualization"drop-down menüsünü açın. Görünen DFF diyalog kutusunda, hedeflenen analit sınıfının aşılacağı bekletme süreleri ve dakika aralığını girin ve gerektiğinde birden fazla yüklü bileşik olasılığı da dahil olmak üzere hedeflenen analit sınıfının kütle-şarj oranı aralığını bulun. Kütle spektrometresi aletinin ulaşılabilir tandem kütle spektrometresi kütle doğruluğunu ve kütle-şarj oranının sınıfa özgü ürün iyonlarını girdirin.Sınıfa özgü nötr kayıpları girin ve tandem kütle spektrometresi spektrometresinin baz zirvesinin yüzdesi olarak kabul edilecek tanısal ürün iyonları ve/veya nötr kayıpları için minimum yoğunluğu tanımlayın. Ardından sonuçları çıktıalmak için bir yol ve dosya adı seçin ve DFF'yi başlatmak için Tamam"ı tıklatın. Kurulumun başarıyla tamamlanmasından sonra bir DFF çizimi görüntülenir.Analist, bileşik sınıf içindeki bilinen bileşiklerin tandem kütle spektrumlarını, tüm bileşik sınıfı için tanısal olan ürün iyonlarını ve/veya nötr kayıplarını tanımlamak için yorumlamalıdır. Bu DFF arsa M.aeruginosa CPCC 300 analizi sonrasında oluşturuldu. X ekseni, tanımlanan DFF kriterlerini karşılayan öncül iyonların kütle-yük oranını temsil ederken, y ekseni mikrosistinler içindeki tüm ürün iyonlarının kütle-şarj oranını gösterir.Bu analiziçin mikrosistin saptama kriterleri 400-1, 200 kütle-şarj oranı içinde öncül iyonlar ve iki ila altı dakika arasında tutma süreleri dahil. En önemlisi, bu tandem kütle spektrometresi spektrometresi tanımlanan %15 baz pik yoğunluk eşiğinin üzerinde kütle-yük oranları içeriyordu. Analiz sırasında elde edilen 4 tandem kütle spektrometresi spektrometresi'nden 26'sı DFF kriterlerini karşılamış ve M.aeruginosa CPCC 300 ekstresinde tespit edilmistir.Tespit edilen majör mikrosistinler mikrosisin lösin arginin ve demethylated aspartik asit mikrosist inkişaten arginin olarak güvenle atanabilir. Tanısal parçalanma filtreleme kullanılarak yeni bileşikler keşfedildikçe, organizmalar nmr tarafından izolasyon ve karakterizasyonu için büyük ölçekte yetiştirilebilir. Mikrosistinlere uygulandığında, tanısal parçalanma filtreleme, geleneksel hedefli tarama yöntemlerinin numunede bulunan ana toksinleri tespit edip etmediğini belirlememizi sağlar.

natural-product-discovery-with-lc-msms-diagnostic-fragmentation

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Gelecekteki klinik uygulama için tükürük örnekleme göz önüne alındığında, bir lolipop gibi ultrafiltrasyon (LLUF) prob insan oral kavite sığacak şekilde imal edilmiştir. NanoLC-LTQ kütle spektrometresi tarafından sindirilmemiş tükürük Direkt analizi büyük proteinler ve yüksek bolluk proteinler kaldırmak ve düşük bol peptidler daha tespit yapmak LLUF probların yeteneğini göstermiştir.

Bir Lollipop-Like Ultrafiltrasyon Probe Kullanımı İnsan Yerli Tükürük Peptidome Örnekleme: Klinik Kütle Spektrometresi için Peptid Algılama basitleştirin ve geliştirin

Kütle spektrometresi (UPLC-MS) ile birleştirilmiş ultra performanslı sıvı kromatografisi ile hedeflenmemiş metabolit profili, metabolizmayı araştırmak için güçlü bir tekniktir.  Bu makale, numune organizasyonu ve hazırlama, veri toplama, veri analizi, kalite kontrol ve metabolit tanımlaması dahil olmak üzere serumun hedeflenmemiş metabolit profili için kullanılan tipik bir iş akışını özetlemektedir.

Ultra Performans Sıvı Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (UPLC-MS) ile Serum Büyük Ölçekli Sigara hedefli metabolomik Profilleme

Bu protokol, deniz suyundan toplanan mikrobiyal biyokütleden protein ve DNA'nın ekstraksiyonu ve konsantrasyonu ve ardından tandem kütle spektrometresi tabanlı proteomik analiz için uygun triptik peptitlerin üretilmesi içindir.

Bir Aquatic Mikrobiyal Metaproteomics İş Akışı: Tandem Kütle Spektrometre tabanlı analiz için uygun Triptik Peptitler için Hücreleri itibaren

Bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) kütle spektrometresine bağlı, şirket içi yerleşik akışlı triptik mikro reaktör ile proteolitik sindirim için hızlı bir protokol sunulmaktadır. Mikroreaktörün üretimi, deney düzeneği ve veri toplama süreci anlatılmaktadır.

Bir akış oranı mikroreaktör MS Algılama Proteinlerin hızlı enzimatik işlenmesi

Burada, kütle spektrometresi tarafından bir protokol sıralı hedeflenen miktar ve sigara hedefli çözümleme fluor bileşikleri su mevcut. Bu metodoloji bilinen fluorochemical bileşikler nicel düzeyleri sağlar ve onların bereket yarı kantitatif tahminler ile ilgili örnekleri bilinmeyen kimyasallar tanımlar.

Ücret belirlenmesi- ve Polyfluorinated kimyasal türler ile kombine hedef ve hedef tarama olmayan yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi iş akışı

Bu protokol, gelişmiş özellik ekstraksiyonu ve biyoinformatik analiz yazılımı ile birlikte sıvı kromatografi kütle spektrometresi kullanılarak peptidoglikan bileşiminin ayrıntılı bir analizini kapsar.

Peptidoglikanın Sıvı Kromatografisi, Kütle Spektrometrisi ve Biyoinformatik ile Yarı Kantitatif Analizi

Siyanobakteri çiçeklenmelerinin ve ilişkili siyanotoksinlerin erken tespiti için hızlı multidisiplinerstrateji burada açıklanmıştır. Su örneklerinde ve bivalve numuneler gibi organik matrislerde siyanobakterilerin ve ilgili siyanotoksinlerin 24 saat içinde tespit edilmesine izin verir.

Hızlı Algılama Stratejisi Kullanılarak Siyanobakteri Çiçeklenmelerinin ve İlişkili Siyanotoksinlerin Erken Tespiti

Protokoller, karmaşık lisat bazlı hücre içermeyen sistemlerde metabolik reaksiyonları incelemek için kırma indeksi veya kütle spektrometrik tespiti ile birleştiğinde yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemlerini açıklar.

Sıvı Kromatografisi, Lysate Tabanlı Hücre içermeyen Sistemlerde Metabolit Profilleme için Kırılma İndeksi veya Kütle Spektrometrik Algılaması ile Birleştirilmiştir

Hızlı kütle spektrometresi (MS)/kütle spektrometresi (MS) tabanlı tropan alkaloidlerinin açıklanması ve sınıflandırılması için hem tropan içeren numunelerin ön replikasyonu hem de izolasyon için yeni alkaloidlerin keşfi için yararlı bir yöntem sunuyoruz.

Doğal Ürün Araştırmalarında Sıvı Kromatografi Tandem Kütle Spektrometresinin Uygulamaları: Bir Vaka Çalışması Olarak Tropan Alkaloidleri

Tekrarlayan HPLC ayrımlarını otomatikleştirmek için entegre bir otomatik örnekleyici ve fraksiyon toplayıcı (LC-mate) geliştirildi. Analog sinyal üreten HPLC dedektörleriyle uyumlu olan LC-mate, manuel olarak çalışan sistemlerin performansını artırır ve yüksek performanslı sıvı kromatografiye bağlı araştırma iş akışlarını hızlandırır.

LC-mate kullanarak otomatik HPLC Ayrımı: Mikro Ölçekli Arıtma İçin Entegre Tekrarlayan Otomatik Numune Alan ve Fraksiyon Toplayıcı

Burada, çok aşamalı kütle spektrometrisi ağaçlarını Huoxiang Zhengqi ağız sıvısına dayalı bir parçalanma süreciyle birleştiren standart bir protokolü gösteriyoruz.

Huoxiang Zhengqi Ağız Sıvısında Bilinmeyen Bir Bileşiğin Yapısal Analizi için Doğrusal İyon Kapanı Kütle Spektrometrisine Dayalı Teknik Yaklaşım

Keşfedin tanılama parçalanma filtreleme yöntemiyle karmaşık karışımlardan doğal ürün keşfi. MZmine yazılımı ve LC-MS/MS kullanarak mikrosistin toksinlerini tespit edin, gıda güvenliği ve biyoürün geliştirme için yeni bileşikler bulun.

LC-MS/MS tanılama parçalanma filtreleme ile doğal ürün keşfi: Microcystin analizi için uygulama

Daha fazla video keşfet