Name: In vivo Ileri genetik ekran Drosophila melanogaster yeni Nörokoruyucu genler tanımlamak için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Keşfedin Drosophila melanogaster kullanarak ileri genetik tarama ile yeni nörokoruyucu genleri belirleme yöntemini. Tırmanma testi, histoloji analizi ve DNA dizilemesi ile nörodejenerasyonla ilişkili genleri tanımlayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Özellikle Dr. Barry Ganetzky 'ye, genetik ekranın hangi laboratuarında gerçekleştirildiği, velet 'in nörokoruyucu bir gen olarak tanımlanması ve karakterizasyonu için minnettarız. Biz nazik ENU-mutagenized Bu yazıda sunulan genetik ekranda kullanılan uçar koleksiyonu sağlayan Dr Steven Robinow teşekkür ederiz. Ganetzky laboratuarı üyelerine, DRS. Grace Boekhoff-Falk ve David wassarman 'ın bu projenin süresi boyunca yararlı tartışmalar için teşekkür ediyoruz, Ling Ling Ho ve Bob KREBER teknik yardım için, Dr. aki Ikeda onun Mikrotom tesis kullanımı için Wisconsin Üniversitesi ve Dr. kim Lackey ve Alabama Üniversitesi 'nde optik analiz tesisi.

<ol><li>Frade, J. M., Ovejero-Benito, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+cell+cycle%3A+the+neuron+itself+and+its+circumstances%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Neuronal cell cycle: the neuron itself and its circumstances.</a> Cell Cycle. 14 (5), 712-720 (2015).</li>
<li>Aranda-Anzaldo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+post-mitotic+state+in+neurons+correlates+with+a+stable+nuclear+higher-order+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Communicative+%26+Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">The post-mitotic state in neurons correlates with a stable nuclear higher-order structure.</a> Communicative & Integrative Biology. 5 (2), 134-139 (2012).</li>
<li>Haelterman, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+chemically+induced+mutations+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of chemically induced mutations in Drosophila melanogaster.</a> Genome Res. 24 (10), 1707-1718 (2014).</li>
<li>Moresco, E. M., Li, X., Beutler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+forward+with+genetics%3A+recent+technological+advances+and+forward+genetics+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Going forward with genetics: recent technological advances and forward genetics in mice.</a> The American Journal of Pathology. 182 (5), 1462-1473 (2013).</li>
<li>St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (3), 176-188 (2002).</li>
<li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreenspan%2C+RJ+%22Fly+pushing%3A+The+theory+and+practice+of+Drosophila+genetics%22">Fly pushing: The theory and practice of Drosophila genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Second edition (2004).</li>
<li>Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+analysis+of+human+disease-associated+gene+sequences+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster.</a> Genome Research. 11 (6), 1114-1125 (2001).</li>
<li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+the+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of the eukaryotes.</a> Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).</li>
<li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).</li>
<li>Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+locomotor%2C+learning%2C+and+memory+deficits+in+Drosophila+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).</li>
<li>Karres, J. S., Hilgers, V., Carrera, I., Treisman, J., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conserved+microRNA+miR-8+tunes+atrophin+levels+to+prevent+neurodegeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The conserved microRNA miR-8 tunes atrophin levels to prevent neurodegeneration in Drosophila.</a> Cell. 131 (1), 136-145 (2007).</li>
<li>Helfrich, C., Engelmann, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian-Rhythm+of+the+Locomotor-Activity+in+Drosophila-Melanogaster+and+Its+Mutants+Sine+Oculis+and+Small+Optic+Lobes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Entomology%22%5BJournal%5D)">Circadian-Rhythm of the Locomotor-Activity in Drosophila-Melanogaster and Its Mutants Sine Oculis and Small Optic Lobes.</a> Physiological Entomology. 8 (3), 257-272 (1983).</li>
<li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , Foundation for Statistical Computing. (2008).</li>
<li>Bokel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMS+screens+%3A+from+mutagenesis+to+screening+and+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Bioogyl%22%5BJournal%5D)">EMS screens : from mutagenesis to screening and mapping.</a> Methods in Molecular Bioogyl. 420, 119-138 (2008).</li>
<li>Lindsley, D. L., Zimm, G. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLindsley%2C+DL+%22The+Genome+of+Drosophila+Melanogaster%22">The Genome of Drosophila Melanogaster</a>. , (1992).</li>
<li>Cook, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+chromosomal+deletions+to+provide+extensive+coverage+and+subdivision+of+the+Drosophila+melanogaster+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">The generation of chromosomal deletions to provide extensive coverage and subdivision of the Drosophila melanogaster genome.</a> Genome Biology. 13 (3), R21(2012).</li>
<li>Loewen, C., Boekhoff-Falk, G., Ganetzky, B., Chtarbanova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Mutation+in+Brain+Tumor+Causes+Both+Neural+Over-Proliferation+and+Neurodegeneration+in+Adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Genomes+Genetics+G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Novel Mutation in Brain Tumor Causes Both Neural Over-Proliferation and Neurodegeneration in Adult Drosophila.</a> Genes Genomes Genetics G3 (Bethesda). 8 (10), 3331-3346 (2018).</li>
<li>Gloor, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+repressors+of+P+element+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Type I repressors of P element mobility.</a> Genetics. 135 (1), 81-95 (1993).</li>
<li>Komori, H., Xiao, Q., McCartney, B. M., Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+specifies+intermediate+progenitor+cell+identity+by+attenuating+beta-catenin%2FArmadillo+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Brain tumor specifies intermediate progenitor cell identity by attenuating beta-catenin/Armadillo activity.</a> Development. 141 (1), 51-62 (2014).</li>
<li>Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+swiss+cheese+mutant+causes+glial+hyperwrapping+and+brain+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 17 (19), 7425-7432 (1997).</li>
<li>Kang, K. H., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+neural+stem+cell+self-renewal+and+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila.</a> Cell and Tissue Research. 359 (1), 33-45 (2015).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene-Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Loewen, C. A., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mito-Nuclear+Interactions+Affecting+Lifespan+and+Neurodegeneration+in+a+Drosophila+Model+of+Leigh+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mito-Nuclear Interactions Affecting Lifespan and Neurodegeneration in a Drosophila Model of Leigh Syndrome.</a> Genetics. 208 (4), 1535-1552 (2018).</li>
<li>Cao, Y., Chtarbanova, S., Petersen, A. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnr1+mutations+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+by+activating+the+innate+immune+response+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dnr1 mutations cause neurodegeneration in Drosophila by activating the innate immune response in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (19), E1752-E1760 (2013).</li>
<li>Lessing, D., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+the+brain%3A+insight+into+human+neurodegeneration+from+Drosophila+melanogaster+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).</li>
<li>Peng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Polo+ameliorates+APP-induced+Alzheimer%27s+disease-like+symptoms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of Polo ameliorates APP-induced Alzheimer's disease-like symptoms in Drosophila.</a> Scientific Reports. 5, 16816(2015).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+mutagens%2C+transposons%2C+and+transgenes+to+interrogate+gene+function+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster.</a> Methods. 68 (1), 15-28 (2014).</li>
<li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Genome+Sequencing+and+a+New+Bioinformatics+Platform+Allow+for+Rapid+Gene+Identification+in+D.+melanogaster+EMS+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Whole Genome Sequencing and a New Bioinformatics Platform Allow for Rapid Gene Identification in D. melanogaster EMS Screens.</a> Biology (Basel). 1 (3), 766-777 (2012).</li>
<li>Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-sensitive+paralytic+mutants+are+enriched+for+those+causing+neurodegeneration+in+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in drosophila.</a> Genetics. 161 (3), 1197-1208 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor.

Drosophila ileri genetik ekranlar, Yaş bağımlı nörokoruma dahil olmak üzere farklı biyolojik süreçlerde yer genler belirlemek için etkili bir yaklaşım olmuştur5,23,24, 25. bu stratejiyi kullanarak, brat 'ı yeni bir nörokoruyucu gen17olarak tanımlamada başarılı olduk.
Bu protokoldeki önemli bir adım, Histoloji analizi için baş...

Nöronlar en çok post-mitotik ve bölünmüş1,2aciz içindir. Çoğu hayvanlarda, nörokoruyucu mekanizmalar bu hücrelerin organizmanın ömrü boyunca korunması için var, özellikle de nöronların hasarlara karşı en savunmasız olduğu yaşlarındadır. Bu mekanizmaların temelindeki genler, nörodejenerasyon gösteren mutantlar, nörokoruma kaybı için fenotipi bir gösterge, ileri genetik protokol kullanılarak tespit edilebilir. İleri genetik ekranlar etil methanesulfonate (EMS) veya n-etil-N-nitrosourea (ENU) gibi kimyasal mutajenler kullanarak, özellikle onlar neden rastgele nokta mutasyonlar nedeniyle yararlıdır, ışık döken bir doğal tarafsız yaklaşım sonuçlanan Ökaryotik model organizmalarda sayısız gen fonksiyonları3,4,5 (aksine, X-Ray Mutagenezi DNA molası yaratır ve can noktası mutasyonları yerine yeniden düzenlemeye neden olabilir6).
Ortak meyve sinek Drosophila melanogaster bu ekranlar için ideal bir konu yüksek kalite, iyi detaylandırılmış genom dizisi nedeniyle, son derece gelişmiş genetik araçları ile bir model organizma olarak uzun geçmişi, ve en önemlisi, onun paylaşılan insanlarla evrimsel Tarih7,8. Bu protokolün uygulanabilirliğini kısıtlayan bir faktör, mutasyona uğramış genlerin neden olduğu erken sakatlık olup,9yaşına kadar test edilmesini önleyecek. Ancak, ölümcül olmayan mutasyonlar için, negatif geoteksen yararlanır bir tırmanma tahlil, basit, ancak kapsamlı, ölçüm özürlü motor işlevi10fonksiyon. Yeterli lokomotor reaktivite sergilemek için, sinekler yönü belirlemek için nöral işlevlere bağlıdır, konumunu duygusu, ve hareketi koordine. Uyaranlara yanıt olarak yeterince tırmanmaya uçar yetersizlik bu nedenle nörolojik kusurları gösterebilir11. Belirli bir arızalı tırmanış fenotipi belirlendikten sonra, beyin dokusunun histolojik analizi gibi ikincil bir ekran kullanarak daha fazla test, tırmanma kusurlu sineklerin nörodejenerasyonu belirlemek için kullanılabilir. Sonraki Gen haritalaması daha sonra, kusurlu nörokoruyucu geni taşıyan kromozom üzerindeki genomik bölgeyi ortaya çıkarmak için kullanılabilir. Kromozomal bölgeyi daraltmak için, kromozom üzerinde bilinen konumlar ile baskın Marker genler taşıyan mutant sinek hatları kullanarak Mayoz bölünmenin haritalama yapılabilir. Marker genler, iki loci arasındaki yeniden kombinasyon sıklığı olarak mutasyon için bir referans noktası olarak hizmet bir geni yaklaşık konumunu eşlemek için kullanılabilecek bir ölçülebilir mesafe sağlar. Son olarak, mutasyon eşleştirilen kromozomal bölgede dengeli eksiklikleri taşıyan satırlarla mutant hatlarının kesişmesi, bilinen fenotipi5' i ifade ederse, faiz geni doğrulanabilir bir uluslara testi oluşturur. Tanımlanan gen, muhtemelen değiştirilmiş bir amino asit dizileri ile sonuçlanan polimorfik nüklotit dizileri, geni sıralayarak ve Drosophila genom dizisiyle karşılaştırarak değerlendirilebilir. İlgi geni sonraki karakterizasyonu ek mutant alleles test içerebilir, mutasyon kurtarma deneyleri ve ek fenotiplerin incelenmesi.

<table><tbody><tr><td><güçlü > büyük ekipman< / histoloji</td> için güçlü > <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>davlumbaz Işık Mikroskobu</td> Nikon Eclipe E100 Görüntüleme için tercih edilen objektif 20x Görüntüleme yazılımı Nikon Mikroskop Kamerası Nikon Termal döngüleyici Eppendorf <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>< güçlü > Sinek itme ve tırmanma tahlili< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR > Drosophila Şişesi, Dar</td><td>VWR</td><td>75813-160</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Genel Amaçlı Laboratuvar Etiketleme Bandı</td><td>VWR</td><td>89097-912</td><td></td></tr><tr><td>Standart mouse pad</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Motic</td><td></td><td>Model SMZ-168</td></tr><tr><td>CO2 anestezi istasyonu (Üfleme tabancası, ayak valfi, Ultimate Flypad)</td><td>Genesee Scientific</td><td>54-104, 59-121, 59-172</td><td>Yapmaz t iinclude CO2 tankı</td></tr><tr><td>İnce Uçlu Fırçalar</td><td>SOLO HORTON FIRÇALAR, INC.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Kuluçka</td> makinesi <td>VWR</td><td>89510-750</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>gen haritalama</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CantonS</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>9517</td><td></td></tr><tr><td>w1118</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>5905</td><td></td></tr><tr><td>yw&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>6599</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila rekombinasyon haritalaması için kullanılan hat</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>3227</td><td>Genotip: wg[Sp-1] J[1] L[2] Pin[1]/CyO, P{ry[+t7.2]=ftz/lacB}E3</td></tr><tr><td>CyO/sno[Sco]&nbsp;</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>2555</td><td>Rekombinasyon haritalaması için kullanılan Drosophila dengeleyici hattı</td></tr><tr><td>Kromozom 2L için Eksiklik Kiti</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>DK2L</td><td>Cook ve diğerleri, 2012</td></tr><tr><td><güçlü>Histoloji analizi</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol, (%100)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Buzul Asetik Asit</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand & Trade; &nbsp; Premium Mikrosantrifüj Tüpleri: 1.5 mL</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice temizleme maddesi 1x</td><td>VWR Yaşam Bilimleri</td><td>97060-934</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hematoksilen</td><td>VWR</td><td>95057-858</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific & Trade; &nbsp; Richard-Allan Bilim ve Ticaret; Montaj Ortamı</td><td>Thermo Scientific&trade; 4112</td><td>22-110-610</td><td>CyO/sna[Sco]</td></tr><tr><td>Unifrost Poly-L-Lysine mikroskop slaytları, 75 mm x 25 mm x 1 mm, EverMark Select Plus</td><td>Azer Scientific Fisherbrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>& trade; &nbsp; Kapak Camları: Dikdörtgenler</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545M</td><td>Boyutlar: 24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>İzlenebilir zamanlayıcı</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sürgülü Isıtıcı</td><td>Barnstead International</td><td></td><td>model no. 26025</td></tr><tr><td>Sürgülü tepsi ve raflar</td><td>DWK Yaşam Bilimleri</td><td></td><td>Rafı 20 slaytı tutmak için</td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; &nbsp; Genel Amaçlı Ekstra Uzun Forseps</td><td>Fisherbrand</td><td>10-316A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes&trade;</td><td>Kimberly-Clark ve ticaret; Profesyonel&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 inç Püriten aplikatörleri</td><td>Parke Ürünleri Şirketi, Guilford, Maine</td><td>807-12</td><td></td></tr><tr><td>VWR & reg; Tıraş Bıçakları</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Histoloji sıvıları</td><td></td><td></td> için Tupperware veya cam kaplar <td>16 + 1 akan su için</td></tr><tr><td>Yüksek Profilli Kaplamalı Mikrotom Bıçakları</td><td>VWR</td><td>95057-834</td><td></td></tr><tr><td>Corning&trade; &nbsp; Kapaklı Yuvarlak Buz Kovası, 4 L</td><td>Corning&trade;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beher</td><td></td><td></td><td>veya buzlu su ve kasetler için başka bir kap</td></tr><tr><td>Doku Banyosu</td><td>Hassas Bilimsel Şirket</td><td>66630</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Molecular analiz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wizard&reg; SV Jel ve PCR Temizleme Sistemi</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Ex Taq DNA polimeraz</td><td>TaKaRa</td><td></td><td>5 U/&mu; l</td></tr><tr><td>Canlandırıcı ve ticaret; &nbsp; SYBR ve ticaret; Güvenli ve ticaret; DNA Jel Boyası&nbsp;</td><td>&nbsp; Canlandırıcı ve ticaret;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltraPure ve ticaret; Agaroz</td><td>&nbsp; Canlandırıcı ve ticaret;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 Kb Plus DNA Merdiveni</td><td>&nbsp; Canlandırıcı ve ticaret;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ApE-A plazmid Düzenleyici yazılımı</td><td></td><td></td><td>Ücretsiz indirilebilir</td></tr><tr><td>İstatistiksel analiz</td>R yazılım paketi<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Daha fazla analiz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y[1] w[*]; wg[Sp-1]/CyO; Dr[1]/TM3, Sb[1]</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>59967</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo ileri genetik ekran drosophila melanogaster yeni nörokoruyucu genler tanımlamak için

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

Nörodejeneratif hastalıkların başlangıcı ve ilerlemesi hakkında anlaşılması gereken çok şey vardır, temel alınan genler de dahil olmak üzere sorumlu. Kimyasal mutajenler kullanarak ileri genetik tarama Drosophila ve insanlarla uyumlu hücresel yollar paylaşan diğer model organizmalar arasında genler için mutant fenotipleri haritalama için yararlı bir stratejidir. Eğer ilgi mutasyona uğramış gen sineklerin erken gelişimsel aşamalarında ölümcül değilse, bir tırmanma tahlil düşük tırmanma oranları gibi, azalmış beyin işleyişi fenotipik göstergeleri için ekrana yapılabilir. Daha sonra, beyin dokusunun ikincil histolojik analizi, nörodejenerasyon phenoypes skorlayarak genin nörokoruyucu fonksiyonunu doğrulamak için gerçekleştirilebilir. Gen haritalama stratejileri, bu aynı testlere dayanan meiyotik ve eksiklik eşlemesinin, faiz geninde olası nükritit değişikliklerini belirlemek için DNA sıralamasına göre izlenmesini içerir.

Bu aerticle 'da, Yetişkin sinekler17' de nöronal bütünlüğünü (örneğin, nörokoruma) bakım rolü oynarken gen beyin tümörü (brat) tanımlamak için kullanılan adımları sunuyoruz; nörokoruma dahil genler tanımlamak için kullanılabilecek bir metodoloji. Biz ileri genetik bir yaklaşım kullanılan (strateji Şekil 1aözetlenmiştir) bir tırmanma tahlil kullanarak kimyasal mutagenized sinekler bir koleksiyon aracılığıyla ekrana (Bu...

Drosophila melanogaster'da nörodejenerasyon gösteren mutantlar için ekrana ileri genetik bir yaklaşım kullanarak bir protokol sunuyoruz. Bu bir tırmanma tahlil, Histoloji analizi, gen haritalama ve sonuçta nörokoruma süreci ile ilgili yeni genler belirlemek için DNA sıralaması içerir.

In vivo Ileri genetik ekran Drosophila melanogaster yeni Nörokoruyucu genler tanımlamak için

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Bu protokolün temel amacı, disregulated nörodejenerasyona yol açan genleri tanımlamak için ileri genetiğin gücünü kullanmaktır. Bu tekniğin en büyük avantajı, memeli modellerinde daha zor olabilecek nöroprotektif genlerin belirlenmesi için tarafsız ve basit bir yaklaşım sağlamasıdır. Bu teknik, Alzheimer ve Parkinson hastalığı gibi birçok hastalık koşulları ile ilişkili nörodejenerasyon sürecinde karıştığı yeni genleri tanımlamak için kullanılabilir.Nöroprotektif genlerin tanımlanmasına ek olarak, ileri genetik yaklaşım nöronal fonksiyon ve iletim gibi diğer biyolojik süreçlerde yer alan genleri keşfetmek için kullanılabilir. Başlamak için, ikinci kromozom eşlenen Drosophila mutantların ENU mutajenize koleksiyonuna ait hatlardan homozigot sinektoplamak. 10-12 günlük sinekleri anestezi olmadan bir test odasına çevirin ve beş dakika boyunca iyileşmelerini bekleyin.Beş santimetrelik çizgi işareti yan aşağı ile, zorla tüm sinekler alt tantifbaşlar, böylece katı bir yüzeye yerleştirilen bir fare altlığı üzerinde oda üç kez dokunun. 10 saniyelik bir süre içinde sinek hareket gözlemleyin. Bu süre içinde beş santimetrelik çizgiye ulaşan veya geçen sinek sayısını ve test edilen toplam sinek sayısını kaydedin.İkinci bir duruşmaya başlamadan önce bir dakika bekleyin. Satır başına en az üç deneme çoğaltmasını yineleyin. Bir karbondioksit yastığı üzerinde sinek anestezi sonra, bir cerrahi bıçak ile sinek kafaları kesmek ve hafifçe 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp Içinde Carnoy fiksatif bir mililitre onları yerleştirmek için bir paintbrush kullanın.Sonra tüpü bir gecede dört derecede saklayın. Ertesi gün, kafaları fiksatif çözüm battı emin olun. Bir duman kaputu altında, fiksatif çözeltiyi bir mililitre %70 etanol ile değiştirmek için p1000 pipetkullanın ve numuneleri gelecekteki analizler için dört santigrat derecede muhafaza edin.Pasteur pipeti kullanarak, sabit kafaları mikrobiyopsi kasetlerine aktarın ve kasetleri kapatın. Kasetleri işleme için bir histoloji tesisine gönderin veya sahada varsa otomatik doku işleme makinesine yerleştirin. Programı susuz kalmak, parafinle kafaları temizlemek ve sızmak için çalıştırın.Daha sonra kasetleri 60 derecede ısıtılan parafinle parafin gömme istasyonuna aktarın ve kasetleri ısıtmalı istasyona sığdıran metal taban kalıpları yerleştirin. Kafaları taban kalıbında üstle karşı karşıya gelecek şekilde yönlendirmek için ince periş kullanın. Doğru baş oryantasyonu histoloji analizi için çok önemlidir.Sertleştikten sonra, kesilecek yüzeyi en aza indirmek için her parafin bloğunu kırpın. Mikrotomüzerinde her bloğun beş mikrometre sini kesin. Daha sonra, en fazla beş dakika boyunca 35 santigrat derecede ısıtılmış bir su banyosunda kesitli parafin şeritler yerleştirin.Isıtmalı su banyosunda polilizin kaplı bir kaydırağı batırın ve kesitli şeritleri kaydırağa yerleştirmek için ahşap aplikatör kullanın. Slaytlar oda sıcaklığında bir gecede kuru masını bekleyin. Ertesi gün, slaytları 63 santigrat derecede 15 dakika ısıtmak için bir slayt ısıtıcıkullanın.Bir duman kaputunun altında, slaytları bir slayt boyama rafına yerleştirin ve rafı beş dakika boyunca HistoChoice'a iki kez yerleştirin ve ardından el yazmasına göre birkaç etanol ve distile su banyosu tedavileri yapın. Rafı Harris Hematoxylin ile dolu bir kapta 2-5 dakika boyunca lekeleyin. Daha sonra rafı Hematoksilin çözeltisinden alın ve aşağıdaki boyama adımlarından önce 10 dakika boyunca akan musluk suyunun altına yerleştirin.Forseps kullanarak boyama sonra, HistoChoice veya Xilene çözeltisi slaytlar almak. Numunenin üzerine ince bir kalıcı montaj ortamı katmanı damlatın ve üzerine hafifçe bir kapak kaydırın. Kabarcıklar oluşumunu önlemek.Montaj ortamı sertleştikten sonra, yaklaşık orta beyin de temsili beyin bölümlerigörüntüleri elde etmek için bir ışık mikroskobu altında slayt yerleştirin. İlk olarak, heterozigot dişi sinekler üretmek için şişe içeren bir gıda hazırlamak. Karbondioksit anestezi sonra, mutant hattının beş erkek ve sternopleural sıkışmış lob 10 bakire kadın aktarmak için bir boya fırçası kullanın ve bir haç yapmak için şişe içine Kıvırcık O hattı üzerinde pin.Şişeyi 25 santigrat dereceye yerleştirin. 10 ila 12 gün sonra, mutasyona uğramış kromozom ve marker kromozomtaşıyan en az 15 bakire kadın soyundan toplamak. Scutoid veya eşdeğer üzerinde başka bir görünür baskın marker Kıvırcık O taşıyan dengeli bir çizgiden beş erkek onları çapraz.10 ila 12 gün sonra, ya scutoid veya Kıvırcık O ve çapraz potansiyel olarak yeniden kombine kromozom taşıyan heterozigot erkek soyundan toplamak. Mutasyona uğramış kromozomu taşıyan stoktan bakire dişilerle tek tek çiftleşin. On ila 12 gün sonra, şişeler içeren yeni gıda içine son çapraz gelen döl toplamak ve yaş 29 santigrat derece santigrat 10 ila 14 gün sinekler.Sinek kafaları üzerinde histoloji gerçekleştirin ve her haç atası için tekrarlayın. Bu bilgilerle, resesif mutasyonun yerini hassaslaştırmak için kromozomun daralan bölgesinde eksiklik haritalama yapın. Her bir ekstansiyon hattı, kromozomların farklı bölgelerinin silinmesine ve tamamlayıcı lık testi için kullanılmasına olanak sağlar.Daha sonra, ikinci kromozom için Drosophila eksikliği kiti çapraz çizgiler ve ilgi fenotip olmayan tamamlayıcı arayın. DNA dizianalizi için referans elde etmek için, FlyBase'den BRAT geninin genomik konsensüs dizisini içeren fasta formatında bir dosya indirin veya genetik arka plan kontrolünün BRAT dizisi için sonuçlar içeren bir dosya kullanın, örneğin başlangıçta mutajeize Drosophila hattı. Plazmid Düzenleyicisi'nde sıralama dosyalarını açın.Düzenle'ye gidin ve Dizileri Hizala'yı tıklatın. Bilgisayarın faresini kullanarak karşılaştırmak için tüm dizileri seçin. Açılan menüde, bu hizalama için başvuru sırasını belirtin.Referans sırasıyla karşılaştırıldığında nükleotid değişiklikleri için sıralı bölgeyi inceleyin. İstenirse, Metin'e tıklayarak hizalamayı RTF formatında bir bilgisayara kaydedin ve kaydedin. Her haç F1 dölleri toplayarak kurtarma deneyi gerçekleştirin.İşaretli dengeleyicileri dikkatlice seçin. Yaş 29 santigrat derece Drosophila gıda orta sinekler ve daha önce olduğu gibi nörodejenerasyon aramak için beyin üzerinde histoloji analizi yapmak. 867 mutantta yaşa bağlı nörodejenerasyon analizini yapmak, sinekleri 5, 15 ve 25 güne yaşa getirmek ve sonraki histoloji analizini yapmak.Bu protokol, tırmanma testi kullanarak kimyasal olarak mutajenize edilmiş sinekler koleksiyonu aracılığıyla ekrana ileri genetik bir yaklaşım sunar. 235 homozigot hat arasında, test edilen hatların yaklaşık %37'si 10-12 günlük kentest edildiğinde %50'nin altında bir tırmanma geçiş oranı sergilemiştir. En düşük tırmanma geçiş oranını sergileyen çizgilerin 51'inde daha sonraki histolojik tarama, bu çizgilerin 29'unun beyin nöropilinde hafiften şiddetli nörodejenerasyona kadar değişen deliklerin görünür bir görünümünü gösterdiğini ortaya koymuştur.867 sinekteki nörodejenerasyon fenotipleri çekiniktir çünkü heterozigot 867 sineklerinin beyinleri yabani bir türe karşı çaprazlanmıştır. Eksiklik hattı Df24116 tırmanma testini temel alan 867 mutant fenotiptamamlamıyor. Histolojik doğrulama, Df24116 eksikliği çizgisinin 867 nörodejenerasyon fenotipini tamamlamadığını, Df9296 ise bunu gösterdiğini göstermektedir.Ek eksiklik çizgilerine geçen 867 mutantın beyin fenotipinin incelenmesi, mutasyonun BRAT genini içeren genom bölgesinde bulunduğunu doğruladı. Bu protokol, yanlış yürütülürse aday genlerde nörodejenerasyon ile mutantların belirlenmesini etkileyebilir birkaç adım birleştirir gibi bu işlem sırasında mümkün olduğunca titiz ve kesin olarak çalışmak için hatırlamak önemlidir. Tanımlanan genlere bağlı olarak, sonraki analizler nörodejenerasyonun bilinen yollarında rol oynayan genlerle ilgi veya etkileşim geninin ek ovules test içerebilir.Histoloji işlemi sırasında, kloroform içerdiğinden Carnoy'nin fiksatif çözeltisini dikkatli bir şekilde ele aldığıiçin unutmayın. Eldiven giyin ve duman kaputunun altında ideal olarak yeterli havalandırma ile kullanın. Benzer şekilde, duman başlık altında tüm histoloji boyama gerçekleştirin.

in-vivo-forward-genetic-screen-to-identify-novel-neuroprotective

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Kullanarak Bileşiklerin Biyoaktivite için eşli Nanoinjection ve Ekran için Elektrofizyoloji Testi Drosophila melanogaster Dev Elyaf Sistemi

Bu video, sinek hareketini ölçmek için basit bir yöntemi açıklar ve gerçekleştirilen tırmanma testini gösterir. Sinek tırmanma testi, negatif bir jeotaksi tepkisine dayanan genel bir motor fonksiyon testidir.

Sinek Tırmanma Deneyi: Drosophila melanogaster'de Genel Hareketi Test Etmek İçin Bir Yöntem

Burada dopaminerjik (DA) nöronların yaşa bağlı nörodejenerasyon incelemek için kurulmuştur iki deneyleri...

Içinde Nörodejeneratif fenotipleri değerlendirilmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Tırmanma Tahliller tarafından Dopaminerjik nöronlar ve Tüm Beyin immün

Bu iletişim kuralı diseksiyon ve yetişkin Drosophila melanogaster immunostaining açıklar beyin dokuları. Özellikle, bu iletişim kuralı doğru nöronal gelişim birçok yönlerini temel genel prensipler ortaya çıkarmak için kullanılabilecek örnek nöronal alt kümeleri olarak Drosophila mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanımı vurgulamaktadır.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Burada, duyusal nöron - vivo içinde birleştirir dendritik arborization (da) nöron yaralanma modeli, canlı görüntüleme Drosophila , İki fotonlu lazer axotomy/dendriotomy ve güçlü sinek genetik araç, olarak bir iletişim kuralı'nı mevcut olası rehberleri ve neuroregeneration inhibitörleri süzmek için bir platform.

Neuroregeneration periferik ve santral sinir sistemi çalışmak için bir Vivo Drosophila yaralanma modeli

Bu protokolün amacı, insan hastalıkları ile ilişkili nadir gen varyantlarının fonksiyonel sonuçlarını değerlendirmek için Drosophila melanogaster'deki in vivo deneylerin tasarımını ve performansını ana hatlarını ortaya çıkarmaktır.

Drosophila Kullanarak Hastalıkla İlişkili Nadir İnsan Varyantlarının Vivo Fonksiyonel Çalışmasında

Kan-beyin bariyerbütünlüğü sinir sistemi fonksiyonu için çok önemlidir. Drosophila melanogasterolarak, kan-beyin bariyeri geç embriyogenez sırasında glial hücreler tarafından oluşur. Bu protokol, D. melanogaster embriyolarında ve üçüncü instar larvalarında kan-beyin bariyeri oluşumu ve bakımı için taht yöntemlerini açıklamaktadır.

Drosophila melanogaster Kan-beyin Bariyer Bütünlüğü için Tahse

Bu makale, erişkin Drosophila'ya Penetrasyon Travmatik Beyin Hasarı (PTBI) uygulamak ve ortaya çıkan nörogenezleri incelemek için ayrıntılı protokoller sunmaktadır.

Drosophila Merkezi Beyninde Yetişkin Nörogenezini Uyarmak ve Analiz Etmek

Protokol, geleneksel memeli modellerine bir alternatif olarak lokomotor disfonksiyonun nicelleştirilmesi yoluyla meyve sineğindeki nörotoksisiteyi değerlendirmek için yüksek verimli, uygun maliyetli bir yöntem sunar. Farmasötik bileşiklerin, çevresel ajanların veya genetik modifikasyonların nörotoksik etkilerini hassas, tekrarlanabilir ve etik açıdan uygun bir model kullanarak değerlendirmeyi amaçlar.

Drosophila melanogaster'de Lokomotor Disfonksiyonun Nörotoksisite için Bir Okuma Olarak Davranışsal Analizi

Genetik Ustilago Maydis'in karalamak mantar işlemek için Biz sağlam bir gen değiştirme stratejisini açıklar. Bu protokol enfeksiyon fenotipleri araştırmak için silme mutantlarını üretmek açıklar. Bir floresan protein etiketi kodlayan bir sekansı ilave olarak, örneğin, arzu edilen herhangi bir şekilde, genleri değiştirme uzatılabilir.

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Keşfedin Drosophila melanogaster kullanarak ileri genetik tarama ile yeni nörokoruyucu genleri belirleme yöntemini. Tırmanma testi, histoloji analizi ve DNA dizilemesi ile nörodejenerasyonla ilişkili genleri tanımlayın.

In vivo Ileri genetik ekran Drosophila melanogaster yeni Nörokoruyucu genler tanımlamak için

Daha fazla video keşfet