Name: Monomers ve Use In vivo Alfa-Synuclein önceden biçimlendirilmiş fibrils üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Keşfedin alfa-sinüklein önceden biçimlendirilmiş fibrillerin monomerlerden üretimini ve in vivo kullanımını. Bu yöntem, Parkinson hastalığı modellerinde sinükleinopati patolojisini standartlaştırarak tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma Michael J. Fox Vakfı, Ulusal Enstitüsü nörolojik bozukluklar ve Inme (NS099416) ve Weston beyin Enstitüsü gelen hibe tarafından desteklenmektedir.

<ol><li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+alpha-synuclein+transmission+initiates+Parkinson-like+neurodegeneration+in+nontransgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice.</a> Science. 338, 949-953 (2012).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+Biological+Compatibility+with+Host+Alpha-Synuclein+Influences+Fibril+Pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity.</a> Cell Reports. 16, 3373-3387 (2016).</li>
<li>Paumier, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrastriatal+injection+of+pre-formed+mouse+alpha-synuclein+fibrils+into+rats+triggers+alpha-synuclein+pathology+and+bilateral+nigrostriatal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Intrastriatal injection of pre-formed mouse alpha-synuclein fibrils into rats triggers alpha-synuclein pathology and bilateral nigrostriatal degeneration.</a> Neurobiology of Disease. 82, 185-199 (2015).</li>
<li>Abdelmotilib, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+fibril-induced+inclusion+spread+in+rats+and+mice+correlates+with+dopaminergic+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein fibril-induced inclusion spread in rats and mice correlates with dopaminergic Neurodegeneration.</a> Neurobiology of Disease. 105, 84-98 (2017).</li>
<li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lewy+body-like+alpha-synuclein+inclusions+trigger+reactive+microgliosis+prior+to+nigral+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Lewy body-like alpha-synuclein inclusions trigger reactive microgliosis prior to nigral degeneration.</a> Journal of Neuroinflammation. 15, 129(2018).</li>
<li>Duffy, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+Over+Quantity%3A+Advantages+of+Using+Alpha-Synuclein+Preformed+Fibril+Triggered+Synucleinopathy+to+Model+Idiopathic+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Quality Over Quantity: Advantages of Using Alpha-Synuclein Preformed Fibril Triggered Synucleinopathy to Model Idiopathic Parkinson's Disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 621(2018).</li>
<li>Luk, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+seed+the+formation+of+Lewy+body-like+intracellular+inclusions+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 20051-20056 (2009).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exogenous+alpha-synuclein+fibrils+induce+Lewy+body+pathology+leading+to+synaptic+dysfunction+and+neuron+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death.</a> Neuron. 72, 57-71 (2011).</li>
<li>Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+exogenous+alpha-synuclein+preformed+fibrils+to+primary+neuronal+cultures+to+seed+recruitment+of+endogenous+alpha-synuclein+to+Lewy+body+and+Lewy+neurite-like+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Addition of exogenous alpha-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous alpha-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates.</a> Nature Protocols. 9, 2135-2146 (2014).</li>
<li>Kuusisto, E., Salminen, A., Alafuzoff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-binding+protein+p62+is+present+in+neuronal+and+glial+inclusions+in+human+tauopathies+and+synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-binding protein p62 is present in neuronal and glial inclusions in human tauopathies and synucleinopathies.</a> Neuroreport. 12, 2085-2090 (2001).</li>
<li>Neumann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misfolded+proteinase+K-resistant+hyperphosphorylated+alpha-synuclein+in+aged+transgenic+mice+with+locomotor+deterioration+and+in+human+alpha-synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Misfolded proteinase K-resistant hyperphosphorylated alpha-synuclein in aged transgenic mice with locomotor deterioration and in human alpha-synucleinopathies.</a> The Journal of Clinical Investigation. 110, 1429-1439 (2002).</li>
<li>Li, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Lewy+body+pathology+in+12-+and+16-year-old+intrastriatal+mesencephalic+grafts+surviving+in+a+patient+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Movement+disorders+%3A+official+journal+of+the+Movement+Disorder+Society%22%5BJournal%5D)">Characterization of Lewy body pathology in 12- and 16-year-old intrastriatal mesencephalic grafts surviving in a patient with Parkinson's disease.</a> Movement disorders : official journal of the Movement Disorder Society. 25, 1091-1096 (2010).</li>
<li>Shimozawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+pathological+alpha-synuclein+in+marmoset+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Propagation of pathological alpha-synuclein in marmoset brain.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5, 12(2017).</li>
<li>Polinski, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+Practices+for+Generating+and+Using+Alpha-Synuclein+Pre-Formed+Fibrils+to+Model+Parkinson%27s+Disease+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Best Practices for Generating and Using Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils to Model Parkinson's Disease in Rodents.</a> Journal of Parkinson's Disease. 8, 303-322 (2018).</li>
<li>Fares, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+de+novo+alpha-synuclein+fibrillization+in+a+neuronal+model+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction of de novo alpha-synuclein fibrillization in a neuronal model for Parkinson's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 912-921 (2016).</li>
<li>Fenyi, A., Coens, A., Bellande, T., Melki, R., Bousset, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+efficacy+of+different+procedures+that+remove+and+disassemble+alpha-synuclein%2C+tau+and+A-beta+fibrils+from+laboratory+material+and+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessment of the efficacy of different procedures that remove and disassemble alpha-synuclein, tau and A-beta fibrils from laboratory material and surfaces.</a> Scientific Reports. 8, 10788(2018).</li>
<li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivable+stereotaxic+surgery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2008).</li>
<li>Tarutani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+Fragmented+Pathogenic+alpha-Synuclein+Seeds+on+Prion-like+Propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Effect of Fragmented Pathogenic alpha-Synuclein Seeds on Prion-like Propagation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291, 18675-18688 (2016).</li>
<li>Wall, N. R., De La Parra, M., Callaway, E. M., Kreitzer, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+innervation+of+direct-+and+indirect-pathway+striatal+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential innervation of direct- and indirect-pathway striatal projection neurons.</a> Neuron. 79, 347-360 (2013).</li>
</ol>

Joseph Patterson, Kelvin luk, ve Caryl Sortwell Şu anda Proteos, Inc coauthor Nicole Polinski tarafından oluşturulan kalite kontrol α-SYN malzeme Michael J. Fox Vakfı ile sözleşme düzenlemeleri içinde yer almaktadır, Michael J. Fox bir çalışanı Temel, hangi Proteos sözleşmeli, Inc α-SYN monomer üretmek için. Coauthors Megan Duffy, Laura Volpicelli-Daley ve Nicholas Kanaan ifşa hiçbir şey yok.

Nöronlar tohumlama ve Lewy vücut gibi kapanımlar lider yeteneğine α-SYN pffs üretimi birden fazla faktör ve adımlara bağlıdır. Kritik bir faktör, fibriller oluşturmak için kullanılan monomerlerin özel olarak fibrilization4,9,14,15için formüle edilmesi gerekir. Monomerlerin fibrilasyon için formüle edilmesi durumunda, fibrler form olmayabilir veya form yapan fibriller α-SYN patolojisini üretemebilir. Aynı şekilde, monomerlerin de etkisi fibrilization olan tampon. Bu nedenle, en iyi sonuçlar için, tuz konsantrasyonu yaklaşık 100 mM NaCl ve pH 7,0 ile 7,3 arasında olmalıdır. Değişkenlik sunan bir ilk adım, ilk protein içeriğinin belirlendiği yöntemdir, A280 adresinde ölçüm ile daha doğru sonuçlar elde etmek muhtemeldir ve bu nedenle tercih edilen yöntemdir. Protein konsantrasyonunda tutarsızlık fibrilasyon sürecinin etkinliğini azaltabilir, hem de deneyler kullanılan kabul PFF konsantrasyonu değiştirebilirsiniz. Her ikisi de deneyler arasında tohumlama verimliliği ve toplu varyasyon bir azalma neden olabilir.
İlk kalite kontrol adımları pffs kritik özellikleri teyit edecektir, özellikle onlar bir fibriler konformasyon var (elektron mikroskobu), amiloid yapıları içeren (thioflavin T tahlil), ve pelletable (sedimantasyon assay). Bu Tiyoflavin t tahlil sonuçları zaman ile dalgalanma olacak ve amiloid yapıların miktarı doğrudan bir ölçü değildir dikkat etmek önemlidir, yerine, Tiyoflavin t tahlil sadece içinde amiloid yapıları varlığı bir göstergesi olarak kullanılmalıdır örnek. Thioflavin T tipik olarak kullanılan in vitro asder, gibi yukarıda bahsedilen tahlil liflerinde göstermek için amiloid yapıları içerir. Alternatif olarak, Tiyoflavin S, Şekil 7' de gösterildiği gibi amiloid yapıları tespit etmek için dokuda kullanılır. Sedimentasyon tahlil açısından, sonuçlar sadece PFFs ağırlıklı olarak peletlenebilir fraksiyonda bulunan gösterir. Numuneler denatüre koşullarda çalıştırılıyor gibi, yaklaşık 14 kDa, α-SYN monomerlerin boyutu, tek bir önemli Band, jeller üzerinde mevcut. Bu, bir yerli veya non-denaturing jel kullanıldığında PFFs ile beklenecek yüksek moleküler ağırlıkları mevcut birden fazla bant aksine. Son olarak, bu ilk kalite kontrol adımlarının başarılı bir şekilde geçirilmesi α-SYN dahil olmak üzere tohumlama etkinliğini garanti etmemektedir. Bu nedenle, hücre kültürü deneyleri veya cerrahi olarak enjekte edilen hayvanların küçük bir kohort daha büyük deneyler kullanmadan önce PFFs etkinliğini test etmek için kullanılmalıdır.
Sonication sürecinde önemli bir adımdır ve parametreler kullanılan sonicator modeline bağlı olarak farklılık gösterecektir. Sonication parametreleri uygulanan ve kısa PFF parçaları üretilen göstermek için doğrulanmalıdır. Fibril boyutu, daha kısa liflerinde daha verimli tohumlama ile tohumlama üzerinde taşıyan vardır. Daha kısa fibriller tohum daha verimli olmasına rağmen, bu etkisi yaylaları ve optimum pff uzunluğu yaklaşık 50 nm4,18. Ayrıca, numunelerin aşırı sıcaklığa düşmesine ve PFFs 'ı aşırı ısıya maruz bırakmayın, bu da tohumlama verimliliğini azaltabilir. Bu sonicated PFFs daha büyük ölçekli deneyler kullanmak için önce küçük hücre kültürü veya in vivo deneyler etkinliği için test edilmelidir. Farklı sonication oturumları değişkenlik tanıtmak potansiyeline sahip olarak, deneysel tedavi grupları buna göre planlanmalıdır.
Pffs in vivo teslim ederken, enjeksiyon site (ler) ve kullanılan toplam miktar pffs lokalizasyonu kapanımlar yanı sıra nörodejenerasyon7,14ölçüde geliştirecek nöronların sayısını etkileyebilir. Protokoldeki koordinatlar başlamak için bir yer sağlar, ancak istenen hedef bölgenin büyük ölçekli deneylerde kullanımından önce α-SYN patolojisini geliştirmesini sağlamak için laboratuar içinde test edilmelidir. İstenirse, PFFs kullanmadan önce bölgesel hedefleme sınamak için bir yol olarak boya veya floresan boncuklar izleme kullanılabilir. İçinde vivo kullanılan pffs miktarı gruplar arasında değişir, çoğu grup ile 5 ila 20 μg pffs arasında bir toplam kullanarak veya iki enjeksiyon siteleri arasında bölünmüş1,2,3,4,5 , 6 , 7 , 14. enjeksiyon siteleri sayısı, enjeksiyon sitelerin konumu, ve pffs miktarı enjekte sonuçları ve synucleinopati ilerlemesini etkisi olabilir, kullanılan parametrelerin aşağı çıkış sonuçları modeli kullanmadan önce karakterize edilmelidir potansiyel müdahaleleri test edin veya modelin geçici özelliklerini inceleyerek.
Terapiyi test etmek veya hastalık ilerlemesini incelemek için kullanılacak bir model seçerken, kullanılan model sorulan soruya en uygun şekilde cevap vermek için seçilmelidir. Tüm modellerde PD 'nin belirli hastalık özelliklerine sahip olmayacaktır veya potansiyel müdahaleleri test etmek için gereken zaman dilimini sunacaksınız. PFF modeli, PD 'nin α-SYN patolojisi ve Nörodejenerasyon gibi temel özelliklerini yeniden oluşturmaktadır ve mütevazı motor bozukluklara yol açabilir. Model, kapanımlar neurodegeneration önce ay formu öngörülebilir ve uzun süren zaman kursu sunar. Bu, araştırmacıların synucleinopati 'nin uzun süren ilerlemesi boyunca farklı aşamaları incelemesine ve yararlanmasına olanak tanır. Modelin geçerli ve gelecekteki kullanımı, hastalığın ilerlemesi ve yeni tedavilerin geliştirilmesi konusunda faydalı olması bekleniyor.

Parkinson hastalığı (PD), öncelikle iki büyük patolojik özellik ile postmortem karakterizedir: yaygın ve Progressive Alfa-synuclein (α-SYN) patolojisini ve nigrostriyatal dejenerasyonu. Wildtype fareler veya fareler içine enjeksiyon aşağıdaki, α-SYN önceden biçimlendirilmiş liflerinde (pffs) patolojik α-SYN Progressive birikimine neden, hangi kanıtlanmış bir Nigra pars Compacta uzun süren dejenerasyon neden olabilir (snpc) birçok ders üzerinde dopamin nöronlar ay, sensorimotor açıkları1,2,3,4,5,6yanı sıra. Nöronlar α-SYN fibrine maruz kalmaktadır, ya doğrudan intrakerebral enjeksiyon yoluyla ya da kültürlü nöronların medyasını ekledi. Pffs nöronların içine alındığında, pffs "Seed" templating ile kapanımlar oluşumu, ve fosforilated kapanımlar içine endojen α-SYN birikimi1,7,8, 9' a kadar. İnclusions Lewy gövdelere benzer özellikleri paylaşır: serin 129 (psyn), Ubiquitin ve P62 'de α-SYN fosforile içeren; pozitif Tiyoflavin boyama ile gösterilen amiloid dörernary yapıları sahip; ve proteinaz K sindirim dirençli1,3,5,7,8,9,10,11, 12' ye kadar. Pff pozlama birincil olarak α-SYN dahil oluşumu ve kültürde bazı ölümsüzleşmiş nöronlar, yanı sıra fareler, fareler, ve insan olmayan primatlar vivo1,2,3,4, 5,6,7,8,9,13. PFFs tüm hücre kültürü modellerinde α-SYN dahil oluşumu yol açmaz ve bazı kültürlü nöronlar diğerlerinden daha iyi tohum olacaktır dikkat etmek önemlidir.
İn vivo α-SYN PFF modelinin bir diğer önemli özelliği de birkaç ay içinde ortaya çıkan farklı sıralı patolojik fazlar. Kemirgenler, intrastriatal enjeksiyon aşağıdaki, α-SYN dahil oluşumu genellikle SNpc içinde doruklarına ve birçok kortikal bölgelerde 1-2 ay içinde. Bu toplama zirvesinde nigrostriyatal dejenerasyonu tarafından izlenen ≈ 2-4 ay sonra1,3,5. Bu farklı patolojik aşamalar, araştırmacıların, 1) α-SYN toplamasını azaltan, 2) zaten oluşan α-SYN inclusions ve/veya 3) sonraki nörodejenerasyonunu önlemeleri için hangi stratejilerle çalışma ve geliştirme platformunu sağlar. Pff modeli, önceden gözden geçirilmiş olarak nörotoksisant, transgenik ve viral vektör aracılı α-SYN ekspresyonu modelleri ile karşılaştırıldığında farklı avantajlar ve dezavantajları sunar6. Hangi model veya yaklaşım almak için seçim hangi model en iyi dedektifler soran soru uygun olarak belirlenmelidir.
PFF modeli birçok laboratuar tarafından başarıyla kullanılsa da, fibrler üreten ve tutarlı α-SYN patolojisi14üreten tutarsızlıklara sahip olan gruplar hala vardır. Küçük veya hiçbir α-SYN patolojisini üreten PFFs 'dan tutarsızlık örnekleri, toplu tohumlama verimliliği için toplu iş ve hatta fibrlerin bile başarısızlığı şeklinde değişir. Böylece, yeni terapötik müdahalelerin etkisi ile ilgili doğru yorumlara izin vermek için α-SYN PFF Generation ve in vivo uygulamasının standardizasyonu önemlidir. Aşağıdaki protokol α-SYN monomers gelen PFFs üretimi için gerekli adımları özetliyor, PFFs in vitro kalite kontrolü bir kez oluşturulan, sonication ve PFFs ölçüm önce kullanımı, ve öneriler başarılı in vivo enjeksiyon kolaylaştırmak için Rats veya fareler içine PFFs.

<table><tbody><tr><td>1x Dulbecco' s fosfat tamponlu tuzlu</td><td>su Thermo Fisher (Gibco)</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Anti-alfa-sinüklein (serin 129'da fosforile edilmiş) antikoru</td><td>Abcam</td><td>AB184674</td><td></td></tr><tr><td>Anti-alfa-sinüklein antikoru</td><td>Abcam</td><td>AB15530</td><td></td></tr><tr><td>Bikinkonik asit</td><td>Thermo Fisher (Pierce)</td><td>PI23228</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf Tıbbi Shrink Makaron (0.036 "iç çap)</td> <td>Nordson Medikal</td><td>103-0143</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf Medikal Shrink Makaron (0.044" iç çap)</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0296</td><td></td></tr><tr><td>Bakır sülfat</td><td>Thermo Fisher (Pierce)</td><td>PI23224</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>2231000574</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf ThermoTop ısıtmalı kapak</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Karbon kaplı elektron mikroskobu ızgaraları</td><td>Eletron Mikroskopi Bilimleri</td><td>FCF300-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Cam kılcal boru (0,53 mm dış çap; 0,09 mm iç çap; 54 mm uzunluk)</td><td>Drummond</td><td>22-326223</td><td></td></tr><tr><td>Cam iğne çektirme</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton şırınga</td><td>Hamilton</td><td>80000</td><td></td></tr><tr><td>Önceden oluşturulmuş fibriller oluşturmak için insan alfa-sinüklein monomeri</td><td>Proteos</td><td>RP-003</td><td></td></tr><tr><td>Önceden şekillendirilmiş fibriller oluşturmak için fare alfa-sinüklein monomeri</td><td>Proteos</td><td>RP-009</td><td></td></tr><tr><td>Turuncu Medikal Shrink Makaron (0.021" iç çap)</td><td>Nordson Medical</td><td>103-0152</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Invitrogen</td><td>25530015</td><td></td></tr><tr><td>Qsonica 3.2 mm uç</td><td>Qsonica</td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Qsonica Q125 sonikatör</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1892</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>EMD Millipore</td><td>596200</td><td></td></tr><tr><td>ToksinSensor Kromojenik LAL Endotoksin Test Kiti</td><td>Genscript</td><td>L00350C</td><td></td></tr><tr><td>Uranil asetat</td><td>Eletron Mikroskopi Bilimleri</td><td>22400</td><td></td></tr></tbody></table>

monomers ve use in vivo alfa-synuclein önceden biçimlendirilmiş fibrils üretimi

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Synucleinopati in vivo Alfa-synuclein önceden biçimlendirilmiş Fibril (α-SYN PFF) modeli kullanımı Parkinson hastalığı synucleinopati ve nigrostriyatal dejenerasyon modeli amaçlayan araştırmacılar arasında popülerlik kazanıyor. Tutarlı ve güçlü α-SYN patolojisini sağlamak için α-SYN PFF Generation ve in vivo uygulamasının standardizasyonu önemlidir. Burada, monomerik α-SYN, fibrilasyon sonrası kalite kontrol adımlarından liflerin üretimi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz ve α-SYN PFFs 'larının fare veya fareler içine başarılı Nöroşirürji enjeksiyonu için önerilen parametreler. Monomerik α-SYN ile başlayarak, en iyi tampon koşullarında, konsantrasyon ve sıcaklığa sıkışırken 7 günlük kuluçken döneminde fibrilasyon meydana gelir. Fibrilasyon sonrası kalite kontrolü, sedimentasyon tahlili ile peletlenebilir fibrlerin varlığı, bir Tiyoflavin T tahlil ile fibrlerin amiloid konformasyonunun oluşumu ve liflerin elektron mikroskobik görselleştirmesi ile değerlendirilir. Bu testler kullanarak başarılı doğrulama başarı için gerekli olduğu halde, onlar pffs her pff toplu gibi toplama aktivitesi hücre kültürü veya pilot hayvan kohorts test edilmelidir gibi, nöronlar içinde α-SYN kapanımlar tohum olacağını garanti etmek için yeterli değildir. Kullanmadan önce, PFFs hassas standartlaştırılmış koşullar altında sonicated, elektron mikroskobu veya dinamik ışık saçılma kullanarak muayene tarafından takip fibril uzunlukları en iyi boyut aralığında olduğunu onaylamak için, ortalama uzunluğu ile 50 Nm. PFFs daha sonra hücre kültürü ortamına eklenebilir veya hayvanlarda kullanılabilir. Fosforile α-SYN (psyn; serin 129) için immünostasyon tarafından algılanabilen patoloji sırasıyla hücre kültürü ve kemirgen modellerinde belirgin günler veya haftalar sonra görülür.

Α-SYN monomerlerin fibrerlerin üretimi, monomerlerin konsantrasyonunu belirlemekte başlar. Hem BCA tahlil ve emilme ölçümü 280 Nm (A280) protein içeriği ölçmek için kullanılabilir; BCA tahlil sonuçları, ancak, A280 yöntemi daha yüksek bir konsantrasyon önerdi. Fare α-SYN monomer türetilen PFFs 14,05 ± 0,22 ve A280 bir BCA değeri vardı 8,05 ± 0,03 μg/μL (Şekil 1). Aynı şekilde, insan α-SYN monomer türetilen PFFs da daha yüksek bir konsantrasyon olarak ortaya çıktı, bir BCA değeri 12,95 ± 0,38 ve bir A280 arasında 7,83 ± 0,05 μg/μL (Şekil 1). A280 ölçümleri, yok sayımın katsayısına bağlı olarak α-SYN ' e özeldir ve bu sonuçlar 7 günlük kuluçarı öncesinde monomerleri seyreltmek için kullanılmıştır.
İnkübasyon öncesinde, α-SYN monomerleri içeren sıvı açıktı, ancak fibril oluşumundan sonra bulanık görünmelidir. Şanzıman Elektron Mikroskopisi ile yapılan muayene, 10-20 Nm genişliğinde (Şekil 4) ölçülen uzun liflerin varlığını doğruladı. Karşılaştırıldığında, α-SYN monomerleri belirgin bir şekil görülmez (Şekil 4). Fibriler yapıların görsel onayı ile, fibrlerin amiloid konformasyonu bir Tiyoflavin T tahlil kullanarak teyit edilmelidir pffs bir sonraki özelliğidir. Thioflavin T amiloid bağlarken gelişmiş floresans sergiler; Böylece, örneklerden artan floresan sinyali amiloid varlığını gösterir. Örnek olarak, dpbs 'deki Tiyoflavin, 3.287 ± 580 bağıl floresan ünitelerinin (RFU) bir sinyalini üretti, fare α-SYN monomer bir sinyal üretilen 4.174 ± 158 RFU, ve fare pffs bir sinyal üretilen 59.754 ± 6.224 RFU (Şekil 5). Karşılaştırıldığında, insan α-SYN monomer fare monomer için 4.158 ± 105 RFU benzer bir sinyal üretilen ve insan PFFs, fare PFFs karşılaştırıldığında 1.235.967 ± 113.747 RFU daha yüksek bir sinyal üretilen (Şekil 5). Peletlenebilir fibrlerin varlığını değerlendirmek için bir sedimentasyon tahlil yapıldı. Fibrils santrifüjleme ile Pelet olacaktır. Hem fare hem de insan pff örneklerinde, süpernatant fraksiyonunda süpernatant daha Pelet daha fazla protein olmalıdır (Şekil 6). Buna karşılık, fare ve insan monomerlerin protein çoğunluğu supernatant vardı, Pelet az mevcut (Şekil 6). PFFs, elektron mikroskobu ile gözle görülür bir şekilde mevcut olan amiloid yapıları mevcut ve lifleri pelletlenebilir, PFFs tüm in vitro kalite kontrol adımlarını geçti.
Hem fare hem de insan pffs α-SYN kapanımlar4,18tohumlama için uygun uzunlukları pffs üretmek için sonicated. PFFs, 4 μg/μL ve sonicated istenilen konsantrasyona seyreltildi. Ameliyattan hemen önce, 25 temsilci lifleri elektron mikroskobu ile görüntülenmiş ve fiil boyutunu kontrol etmek için ölçüldü. Sonicated fare PFFs 48,8 ölçülen ± 3,1 Nm, insan PFFs ölçülen ise 52,1 ± 4,4 Nm uzunluğu; Her iki türün PFFs bu nedenle uygun uzunlukta (50 nm veya daha az) tohumlama aktivitesi neden oldu. Yaklaşık 500 liflerinde daha kapsamlı muayene sonicated fare liflerinde ortalama uzunluğu ve uzunluğu dağılımı ortaya. Ortalama uzunluğu 44,4 ± 0,6 Nm, PFFs% 86,6 ile 60 Nm veya daha az ölçüm (Şekil 4). Karşılaştırıldığında, insan PFFs ortalama 55,9 ± 1,1 Nm ile 69,6% PFFs ölçme 60 Nm veya daha az (Şekil 4).
Daha önce3,5, doku bölümlerin bir dizi işlenmiş olduğu gibi fareler içine sonicated fare pffs intrastriatal enjeksiyon takip 2 ay sonrası cerrahi, ne zaman dahil nöronlar içeren sayısı zirve bilinmektedir SNpc, fosforilated α-SYN inlüzyonlar onayı için5. Ekleme rulman nöronlar, pSyn için immunohistokimyasal boyama tarafından belirtildiği gibi ( malzeme tablosundaantikor) snpc içinde mevcut (Şekil 7), yanı sıra striatum inleme beyin boyunca diğer bölgeler (anterior koku çekirdeği, motor, cingulate, Piriform, prelimbic, somatoduyusal, entorhinal, ve Insular cortices, amygdala, striatum)1,3,4,5,19. Bu inlüzyonlar ile benzer özellikleri paylaşır Lewy organları, bağlayıcı Tiyoflavin S, ve direnç toplam α-SYN için proteinaz K (Şekil 7), immunhistokimyasal boyama tarafından gösterilen (antikor ve proteinaz k malzeme tablosu) . Beyin içinde tohumlama onayı in vivo kalite kontrol geçti olduğunu gösterir, ve daha önce dondurulmuş ve aynı toplu kaydedilmiş pffs plakaya aynı parametreler altında sonicated olabilir, uzunlukları ile doğrulanmış, büyük deneyler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig1.jpg"> Şekil 1 . Α-SYN fibrils üretimi için yöntemler. Α-SYN monomerinden fibril üretmek için gereken adımların anahattı. Monomerler 10 dakika (15.000 x g, 4 °c ' de) santrifüglü. Supernatant temiz bir tüp transfer edilir ve protein konsantrasyonu ya 280 nm de emici tarafından belirlenir, ya da bir BCA tahlil. Grafik, insan ve fare α-SYN monomerlerin konsantrasyonlarını gösterir. Sütunlar Grup anlamına gelir, hata çubukları ortalaması ± 1 standart hata temsil eder. Protein konsantrasyonu belirlendikten sonra, α-SYN monomerlerin seyreltilmiş, kısaca vortekslenir ve 37 °c için inkübe 7 gün, bir orbital Mikser üzerinde titreyerek 1.000 rpm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig2.jpg"> Şekil 2 . Şanzıman Elektron Mikroskopisi için boyama yöntemleri. Elektron mikroskobu için negatif boyama şeması. A) Elektron Mikroskopisi numune ızgaralarını tasvir eden görüntüler. Izgarada donuk veya hafif bir tarafı ve parlak ya da karanlık bir tarafı vardır. Parlak/karanlık tarafı bir formvar/karbon destek filmi ile kaplıdır. B) boyama prosedürü Illustration. Grid 1 dakika için ddH2O ilk damla üzerinde parlak/karanlık tarafı aşağı yüzen ve aşırı filtre kağıdı ile kötü uzakta. Süreç ddH2o, seyreltilmiş pffs veya monomerlerin ikinci damla ile tekrarlanan, uranyl asetat iki damla, ve DDH2o Iki ek damla. ızgaralar görüntülenmiş kadar bir kılavuz kutusunda depolanabilir. Ölçek çubuğu = 3 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın</a> .
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig3.jpg"> Şekil 3 . Özel cam iğne şırıngalar montajı. Cam iğne bağlı şırıngalar birleştirmek için gereken adımlar diyagramı. Silikonized cam kapiller tüpler çekti ve cam iğneler üretmek için ortasında kesilmiş. Shrink wrap tüp metal iğne hazırlamak ve cam iğne metal iğne üzerine kaydırılır zaman bir iç mühür oluşturmak için kullanılır. Cam iğne tabanı ve metal iğne üst üste daraltma Wrap boru iki ek katmanlar ardışık eklenir ve ısı cam iğne güvenli ve su geçirmez bir mühür oluşturmak için uygulanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig4.jpg"> Şekil 4 . Α-SYN monomerlerin ve α-SYN liflerinde iletim elektron mikroskobu ile görselleştirme. Α-SYN monomerlerin ve liflerin temsili MİKROGRAFİ. Üst paneller: fare ve insan α-SYN monomer. Orta paneller: tam uzunlukta fare ve insan α-SYN PFFs. alt paneller: fare ve insan α-SYN PFFs sonication sonra. Alt grafik: sonicated fare ve insan α-SYN PFF uzunlukları dağılımı. Ölçek çubuğu = 500 Nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig4large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig5.jpg"> Şekil 5 . Tiyoflavin T tahlil tarafından amiloid yapıların onayı. Fare ve insan α-SYN monomer ve PFF örneklerinden floresan sinyal ölçümü. Sol: fare α-SYN monomerlerin ve α-SYN pffs sonuçları. Sağ: insan α-SYN monomerlerin ve α-SYN PFFs sonuçları. Her grafikte bir dPBS negatif denetimi gösterilir. Tüm ölçümler göreceli floresan üniteleri (RFU) olarak ifade edilir. Sütunlar Grup anlamına gelir, hata çubukları ortalaması ± 1 standart hata temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig5large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig6.jpg"> Şekil 6 . Coomassie lekeli jellerden pelletable α-SYN. görüntüler için sedimentasyon tahlil. Gösterilen bantlar yaklaşık olarak 14 kDa protein merdiven dayanmaktadır. Sol: fare monomer ve PFFs. Sağ: Insan monomerleri ve PFFs. Tüm monomer ve pff örnekleri için, resuspended Pelet (P) ve süpernatant (S) gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig6large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59758/59758fig7.jpg"> Şekil 7 . Α-SYN patolojisi teyit sıçan modelinde kapanımlar özellikleri. 2 ay sonrası enjeksiyonla kanıtlanmış bir Nigra pars Compacta 'dan temsilci MİKROGRAFİ. Sol: pSyn içeren nöronlar ve kreil menekşe ile Counter,. Orta: Thioflavin S pozitif nöronlar. Sağ: α-SYN-proteinaz K. ölçek çubuğuna dayanıklı inlüzyonlar içeren = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59758/59758fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın</a> .

Bu makalenin amacı, monomerik Alfa-synuclein, sonraki kalite kontrol ve önceden biçimlendirilmiş liflerinde in vivo kullanımı liflerinde nesil için gerekli adımları özetlemesidir.

Monomers ve Use In vivo Alfa-Synuclein önceden biçimlendirilmiş fibrils üretimi

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Alfa-Sinüklein Preformed Fibril modeli sinükleininopatiler çalışma dünya çapında laboratuvarlar tarafından kullanılmaktadır. Model birçok laboratuvar tarafından başarıyla kullanılmasına rağmen, bazı gruplar fibriller üreten ve tutarlı alfa-sinüklein patolojisi üreten tutarsızlıklar yaşamışlardır. Alfa-sinüklein monomerlerinden fibrül lerin oluşumunu ve önceden oluşturulmuş fibrillerin vivo kullanımını ayrıntılarıyla detaya alan bu protokolün, araştırmacıların modelin kullanımı yla ilgili sorularını yanıtlayabileceğini umuyoruz.Alfa-Sinüklein Preblü Fibril modeli, Parkinson hastalığının alfa-sinüklein patolojisi ve nörodejenerasyon gibi temel özelliklerini özetler. Ve bazı hayvan modellerinde mütevazı motor bozukluklarına yol gösterdiği gösterilmiştir. Fosforilasyonalfa-sinüklein içeren dahil lerin oluşumu ve nörodejenerasyona doğru uzun süren zaman seyri araştırmacılara sinükleinopatinin ilerlemesi boyunca farklı aşamalar sunar, potansiyel terapötik müdahaleleri incelemek ve hedeflemek için.Özel cam iğnelerin hazırlanmasını gösteren laboratuvar teknisyenimiz Christopher Kemp. Bu prosedüre başlamak için, buz üzerinde alfa-sinüklein monomerleri eritin. Yeniden boru üzerinde hafifçe flicking tarafından çözülmüş monomerler suspened.Ve 15, 000 g ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj. Daha sonra, supernatant temiz bir 1,5 mL mikro santrifüj tüp aktarın ve aktarılan miktarı kaydedin. ML başına 5 mg son konsantrasyona 1x dPBS ile monomerleri seyreltin.Kısaca girdap karıştırmak ve kısaca tüpün altındaki sıvı nın tüm toplamak için santrifüj. Daha sonra, mikro santrifüj tüp kapağıkapalı güvenli yapıştırıcı film kullanın. 1, 000 rpm sallayarak sırasında 37 santigrat derece yedi gün boyunca bir kapak ile bir orbital termo mikser içine tüp yerleştirin.Yedi günün sonunda, tüpün içeriği bulanık görünmelidir. İlk olarak, eldiven, laboratuvar önlüğü ve yüz kalkanı da dahil olmak üzere gerekli tüm kişisel koruyucu ekipmanı donatın. Daha sonra, bir hücre kültür başlık, dönüştürücü bir 3,2 mm çapında prob takın.Sonicators genlik ayarlayın 30%ve nabız bir saniye ve bir saniye kapalı ve bir dakika için zaman. Oda sıcaklığında fibriller çözülme, ve hala kültür başlık iken, steril dPBS ile fibriller seyreltin. Sonra, %70 etanol ile bir laboratuvar dokusunemiş ve bunu sondayı silmek için kullan.Sondanın ucunu çift distilesu suya batırın ve sondayı daha fazla temizlemek için 10 kez darbeye batırın. Bundan sonra, sondayı bir laboratuvar dokusuyla kurutun. Temizlenmiş sonda ucunu seyreltilmiş fibriller tüpüne yerleştirin ve ucu tüpün altına yerleştirin.Sıvıdaki tüm fibrillerin sonicated olduğundan emin olmak için her darbe sırasında prob yukarı ve aşağı hareket ederken önceden ayarlanmış parametreleri kullanarak seyreltilmiş fibrils sonicate. Sonication sonra, kısaca 2 bir saniye için santrifüj, 000 g tüpün yanlarından tüm sıvı toplamak için. Sondayı temizlemek için sonda ucunu %1 SDS ve darbeye 10 kez batırın.Daha sonra, SDS ucu çıkarın ve çift distile su batırın ve darbe 10 kez. Sondayı %70 etanolle nemlendirilmiş bir laboratuvar dokusuyla silin ve kuru bir laboratuvar dokusuyla kurulayın. Prob'u dönüştürücüden ve depodan ayırın.Bundan sonra, % 1 SDS ve % 70 etanol ile kaputtaki tüm yüzeyleri silin. Başlamak için, bir cam iğne çekmece içine silikoncam kılcal tüp yerleştirin. Isıtma elemanını açın ve bağlı ağırlıkların ısıtılmış cam kılcal tüpü uzatmasına izin verin.Daha sonra, ortadaki en ince noktada çekilen cam kılcal tüp kesmek ve cam iğne yiğcam iğne çekmecesinden çıkarmak için makas kullanın. Daha sonra, yaklaşık 40 mm shrink şal boru uzunluğu kesmek için makas kullanın. 10 mikrolitre yontucu şırınga metal iğne üzerinde shrink şal kaydırın.Isı ve iğne için shrink şal yapıştırmak için açık bir alev kullanın, eşit ısı uygulamak için iğne döndürmek için emin yaparken. Çekilen cam iğnenin büyük ucunu şırınganın metal iğnesinin üzerine dikkatlice kaydırın. Bundan sonra, yaklaşık 40 mm'ye kadar shrink wrap borubir uzunluk kesmek ve dikkatle cam iğne tabanı ve şırınga metal iğne örtüşmek için cam iğne üzerinde kaydırın.Metal iğne için cam iğne güvenli shrink şal ısıtmak için açık bir alev kullanın. İğneyi daha fazla emniyete almak ve olası sızıntıları önlemek için, yaklaşık 40 mm'ye kadar ek bir shrink sargı borusu kesin ve cam iğnenin tabanıyla ve şırınganın metal iğnesiyle örtüşmek için dikkatlice cam iğnenin üzerine kaydırın. Metal iğne için cam iğne güvenli shrink şal ısıtmak için açık bir alev kullanın.Daha sonra, ucu yaklaşık 8 mm uzunluğunda olacak şekilde cam iğne kırpmamak için makas kullanın. İğneyi test etmek için, 1 mL'lik bir şırıngayı 26 gauge iğneile damıtılmış suyla doldurun. Metal pistonu özel cam iğne şırıngasından çıkarın ve su dolu şırınganın iğnesini özel şırınganın tabanına yerleştirin.Sızıntılar için cam iğne ve metal iğne nin arayüzünü inceleyin ve sürekli bir su akışını onaylayın. Sonra, distile su ile bir mikro santrifüj tüp doldurun. Distile su çekmek için özel cam iğne şırınga kullanın.Şırınganın içine sıvı alındığını ve kabarcık olmadığını doğrulamak için iğneyi inceleyin. Kabarcıklar varsa, ya da su iğne içine çizilmiş değilse, iğne kırpma basıncı hafifletmeye yardımcı olabilir. Bundan sonra, dikkatlice bağlı cam iğneler ile şırınga saklayın, ameliyatlar için gerekli olana kadar şırınga kutularında.Transmisyon elektron mikroskobu ile yapılan inceleme uzun fibrillerin varlığını doğrular. Buna karşılık, alfa-sinüklein monomerler arpa görünür ve fark edilebilir bir şekli vardır. Fibrillerin analoid onayı daha sonra Thioflavin T Tsay kullanılarak doğrulanır.Temsili bir teşp dPBS ve fare monomerleri göreli flouresent birimlerinde fare PFFs göre daha düşük bir sinyal üretmek gösterir. İnsan alfa-sinüklein monomer fare monomer benzer bir sinyal üretir. İnsan PFF'leri aynı şekilde monomerlerden daha yüksek bir sinyal üretirken.Pelitible fibrils varlığını asses için, bir sedimantasyon tsay yapılır. Hem fare hem de insan PFF örneklerinde, üst üste gelen ihlalin pelette süpernatanttan daha fazla proteine sahip olması gerekir. Buna karşılık, fare ve insan monomerler protein çoğunluğu pelet çok az mevcut ile supernatant mevcuttur.Hem fare hem de insan PFF'leri, alfa sinüklein inklütileri için uygun uzunlukta PFF'ler üretmek için sonicated edilir. Yaklaşık 500 fibrl kapsamlı bir inceleme fare fibrils ortalama uzunluğu yaklaşık 44 nanometre olduğunu ortaya koymaktadır. PFF'lerin %86,6'sı 60 nanometre veya daha az ölçülerindedir.İnsan PfFs, ancak, 60 nanometre veya daha az ölçme PFFs% 69,6 ile yaklaşık 55,9 nanometre ortalama uzunluğu var. PFF etkinliğinin in vivo muayenesi immünohistokimya kullanılarak doğrulanmıştır. Substantia nigra'da oluşan eklemeler, fosforirik alfa sinüklein içeren Lewy cisimlerine benzer özellikleri paylaşır, aminloyed yapılar içerir ve tioflavin S ile leke içerir ve Proteinaz K sindirimine dirençlidir.Sonication aerosolize önceden bilgili fibriller için bireysel sonicating ortaya çıkarabilir. Bu nedenle, uygun güvenlik kıyafetleri giyilmeli ve maruz kalma riskini en aza indirmek için bir başlık içinde sonication gerçekleştirilir.

generation-alpha-synuclein-preformed-fibrils-from-monomers-use

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, nöroinflamasyonu indüklemek için alfa-sinüklein fibrillerinin bir fareye enjeksiyonunu göstermektedir. Fibriller, mutasyona uğramış alfa-sinüklein proteinlerini eksprese eden transgenik bir fareye intraperitoneal olarak enjekte edilir. Merkezi sinir sistemine ulaştıktan sonra, fibriller nöronlara girer ve mutasyona uğramış proteinlerin toplanmasını indükler. Agregalar komşu nöronlara, mikroglialara ve astrositlere yayılır. Agregaların tanınması, nöroinflamasyonu indüklemek için...

Alfa-sinüklein Fibrillerinin Enjeksiyonu ile Farelerde Nöroinflamasyonun İndüksiyonu

Bu video, alfa-sinüklein önceden oluşturulmuş fibrillerle önceden tedavi edilmiş embriyonik fare dopamin nöronlarında alfa-sinüklein birikimini ölçme sürecini göstermektedir. İmmünofloresan kullanarak alfa-sinüklein agregatları içeren dopamin nöronlarını sabitleme, boyama ve nicelik belirleme adımlarını ana hatlarıyla belirtir.

Primer Embriyonik Fare Dopamin Nöronlarında Alfa-Sinüklein Birikiminin İncelenmesi

Proteinler ya doğal bir yapıyı benimseyebilir ya da çözünmeyen amiloid'e yanlış katlanabilir. Yanlış katlanma yolunu destekleyen koşullar, farklı tipte amiloid fibrillerin oluşumuna yol açar. Burada açıklanan yöntemler, doğal proteinlerin in vitro olarak amiloid'e hızlı bir şekilde dönüştürülmesine izin verir.

İn vitro Yerli Proteinlerden Hızlı Amiloid Üretimi

Yeni bir kantitatif yaklaşım sunan bir ELISA açıklanmaktadır. Spesifik olarak, bir transgenik fare modeli (M83) içindeki (M83) sinoleinopatide, Ser129 fosforile αS formu veya proteinin C-terminal kısmına karşı çeşitli antikorlar kullanarak hastalıkla ilişkili α-sineulini (αSD) tespit etmektedir.

İnsan A53T aşırı eksprese eden transjenik farelerin beyninde Geliştirilmiş ELISA ile Hastalık ile ilişkili α-sinüklein tespiti α-sinüklein Mutasyona uğramış

Burada, ölüm sonrası insan beyin dokusundan giderek çözünmeyen/kümelenmiş alfa-sinükleinin (α-syn) izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Deterjan mukavemeti arttırılmış tamponların ve yüksek hızlı ultrasantrifüj tekniklerinin kullanılmasıyla, hastalıklı ve hastalıksız dokularda α-syn agregasyonunun değişken özellikleri incelenebilir.

Parkinson Brains gelen Çözünür ve çözünmez alfa-sinüklein Sıralı Ekstraksiyon

(+/- M83: GFAP -Luc +/-) Tg periton ya da dil içine alfa-sinüklein fibrillerinin Çevresel enjeksiyon ailesel A53T mutasyon ve ateş böceği lusiferaz ile insan alfa-sinükleinin eksprese eden farelerden, nöro de dahil olmak üzere, nevropatlojinin uyarabilir bunların merkezi sinir sistemindeki.

Alfa-sinüklein fibrillerinin Çevresel Aşılama sonrası Tranjenik Farelerde Nöroinflamasyondan Biyoparlaklık Görüntüleme

Bu iletişim kuralı, Alfa-synuclein oluşumu çoğaltır hücre tabanlı bir sistem içinde vivoagrega sağlamak için hedeftir. Hücre içi Alfa-synuclein kapanımlar birincil nöronlarda tarafından içselleştirilmesi numaralı seribaşı ve eksojen yayılması hastalıklı Alfa-synuclein transgenik fareler izole yerli microsomes ilişkili Alfa-synuclein toplamları yönetilen.

Microsomes ilişkili Alpha-synuclein toplamları için birincil nöronlar eksojen yönetim olarak güçlü hücre modeli liflerinde oluşumu

Burada, birincil fare dopamin nöronlarında nöronal α-sinüklein birikimini incelemek için ayrıntılı bir protokol sıyoruz. Nöronlarda fosforial α-sinüklein agregaları önceden oluşan α-sinüklein fibrilleri ile indüklenir. İmmünfloresan etiketli hücrelerin otomatik görüntülemesi ve tarafsız görüntü analizi, bu sağlam protokolü α-sinüklein birikimini engelleyen ilaçların orta-yüksek iş akışı taraması için uygun hale getirilmiştir.

Primer Embriyonik Fare Orta Beyin Dopamin Nöronlarında Pre-formed Fibril Indüklenen α-Sinüklein Birikiminin İncelendirilmesi

Parkinson hastalığının patogenezini incelemek ve anlamak için α-sinükleinin in vivo fizyolojik modeli gereklidir. İnsanlaştırılmış bir maya modeli kullanarak α-sinükleinin sitotoksisitesini ve agrega oluşumunu izlemek için bir yöntem tanımladık.

İnsanlaştırılmış Bir Maya Modeli Kullanarak α-Sinüklein Toksisitesini ve Agregasyonunu İncelemek İçin Bir Yöntem

Mevcut protokol, α-sinüklein agregatlarının intranazal uygulaması için bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu yöntem, Parkinson hastalığında koku alma mukozasından koku soğancığına α-sinüklein yayılımı hakkında bilgi sağlar.

α-Sinüklein Agregatlarının İntranazal Uygulama Tekniği

Keşfedin alfa-sinüklein önceden biçimlendirilmiş fibrillerin monomerlerden üretimini ve in vivo kullanımını. Bu yöntem, Parkinson hastalığı modellerinde sinükleinopati patolojisini standartlaştırarak tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

Monomers ve Use In vivo Alfa-Synuclein önceden biçimlendirilmiş fibrils üretimi

Daha fazla video keşfet