Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar

CRISPR ekranlı açılır ekranlar, araştırmacılara genom genelindeki zincir fonksiyonunu sorgulamak için basit, verimli ve ucuz bir yöntem sunar. CRISPR'ın avantajı, kılavuz dizisini değiştirerek herhangi bir geni düzenleme becerisidir. CRISPR rehber kütüphaneleri, araştırmacıların bir deneyde herhangi bir organizmanın tüm genomunu tarafsız ve sistematik bir şekilde sorgulamalarına olanak tanır.

Şu anda, CRISPR ekranlar insan kanserleri yüzlerce arasında temel genleri belirlemek ve genetik etkileşimleri haritalamak için kullanılmaktadır. Ekranlar da kapsamlı eylem uyuşturucu mekanizmaları ortaya çıkarmak için ilaçların profilini çıkarabilirsiniz. Burada açıklanan CRISPR kütüphaneleri insan hücrelerini hedef almaktadır.

Ancak, fare gibi diğer türleri hedefleyen kılavuz kitaplıklar kullanılabilir ve benzer şekilde taranabilir. İnsan hücrelerinde genom genişliğinde ekranlar yapmak, on milyonlarca hücrenin işlenmesini gerektirdiği ve büyük veri kümelerinin analizini gerektirdiği için pratikte yıldırıcı olabilir. Bir ekrana başlamadan önce, hücre çizgilerinin dikkatle karakterize edildiklerinin sağlanmasını sağlayın.

Bu hücre hattının saflığını bilmek içerir, iki katına zaman, lentivirus transdüksiyon verimliliği, ve antibiyotik seçimi ajanları için duyarlılıkları. Görsel bir gösteri, bir ekranda gereken milyonlarca hücreyi pratik olarak nasıl işleyeceğiniz ve binlerce tedirginliğin sistematik bir şekilde nasıl izleyeceğinin bir resmini sağlayacaktır. Prosedürü gösteren Andrea Habsid, Kamaldeep Aulakh ve Ryan Climie, benim laboratuvar tüm teknisyenler olacaktır.

Hazır CRISPR sgRNA plazmidini elektroyit hücrelere dönüştürerek ve el yazması talimatlara göre büyüterek başlayın. Kolonileri hasat hazır olduğunda, her plaka carbenicillin ile LB yedi mililitre ekleyin ve hücre yayıcı ile kolonileri kazıyın. Kazınmış hücreleri steril bir litrelik konik şişeye aktarmak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın ve plakayı beş mililitre LIK LB ile karbenicillin ile durulayın.

Yine, şişeye durulama çözeltisi aktarın. Hücreleri el yazması yönlere göre santrifüj edin ve sonra ıslak peletin ağırlığını belirleyin. Plazmid DNA'sını Maxi veya Mega ölçekli plazmid arınma kiti kullanarak arındırın.

293 T-hücresi tohumlayarak ve bir gecede kuluçkaya yatarak hücreleri transfeksiyoniçin hazırlayın. Ertesi gün, 15 santimetreplakalar için üç transfection plazmid karışımı nı hazırlayın. Bir transfeksiyon için gerekli plazmid miktarını hesaplayın ve plaka sayısı için plazmidkarışımı yapmak, artı bir, transfected için.

Daha sonra, her transfeksiyon için bir lipid bazlı transfeksiyon reaktifi ve aliquot azaltılmış serum media için tek tek 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplere transfected plaka sayısı için hazırlayın. Transfeksiyon reaktifini ekleyin, hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra transfeksiyon reaktifine DNA kompleksinin mikrogramlarına 3-1 oranında DNA ekleyin.

Çözeltiyi hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Transfeksiyon karışımını ambalaj hücrelerine ekleyin ve el yazması talimatlara göre kuluçkaya yatırın. Viral hasat gününde, iyi bir virüs üretiminin bir göstergesi olarak anormal ve erimiş morfoloji için hücreleri kontrol edin ve supernatant toplayıp steril bir santrifüj tüpüne aktararak lentivirus hasat.

Ekran boyunca muhafaza edilecek CRISPR kılavuzu RNA kitaplık kapsamını seçerek başlayın. Kitaplık kapsamına bağlı olarak, kılavuz RNA başına korumak için gereken hücre sayısını ve MOI 0.3'te enfeksiyon için gereken hücre sayısını belirleyin. Daha sonra, enfeksiyonu kurmak için gerekli plaka sayısını belirleyin ve sonra, hasat ve her plaka hücreleri tohum.

Tüm plakalara hexadimethrine bromür ekleyin ve tarama ve kontrol iki plaka için virüs gerekli hacmi ekleyin. Kontrol etmek için virüs eklemeyin. Bu ses düzeyini medyayla değiştirin.

Plakaları yatırarak iyice karıştırın ve plakaları bir kuvöze yerleştirin ve düz olduğundan emin olun. El yazması talimatlara göre enfekte hücreleri hasat ve genomik DNA çıkarma için havuzlu hücrelerden hücre peletlerinin üç kopya toplamak. Hücreleri 500 kez g'de beş dakika santrifüj edin ve PBS ile yıkayın.

Tüpleri etiketle ve hücre peletlerini eksi 80 derecede kurutun. Virüslü hücre havuzunu üç çoğaltma grubuna bölün ve her çoğaltma içinde kitaplık kapsamını koruduğundan emin olun. Hücreleri genişletirken normalde kullanılacak bir yoğunlukta tohumlayın.

Her çoğaltma için aynı sayıda hücre ve çoğaltmalar arasında aynı toplam hücre sayısını kullanın. Hücreleri geçiş ve 15 ila 20 hücre iki katına kadar havuzlu enfekte hücrelerin her çoğaltma hücre pelet üç çoğaltma hasat devam edin. Her geçitte, her bir tabaktaki hücreleri birbiriyle çoğaltın.

Her peleti zamana göre etiketlendirin ve atamayı çoğaltın. 50 mikrolitrelik reaksiyon başına 3,5 mikrogram genomik DNA'da toplam 100 mikrogram genomik DNA ile el yazması talimatlara göre PCR1'i kurun ve istenilen kapsama alanını elde etmek için aynı 50 mikrolitrelik reaksiyonları ayarlayın. El yazması talimatlara göre bir PCR tüp reaksiyonu ayarlayın.

Bir şablon olarak havuza alınan PCR1 ürününün beş mikrolitresini kullanın ve sıralama kitaplığı örneklerinin biraraya getirmek için her bir örnek için benzersiz dizin astar kombinasyonları kullanın. PCR'yi tamamladıktan sonra, PCR tüp ürününü 1 ila 1/2 saat düşük voltajda %2 agarose jel üzerinde çalıştırın. Ürünü mavi ışık transilluminator üzerinde görselleştirin ve 200 baz çifti bandını çıkarın.

DNA'yı arındırın ve hem spektrofotometre hem de florometre ile miktarını ve kalitesini ölçün. İdeal bir kılavuz RNA kitaplığı her bir kılavuz RNA benzer miktarlarda temsil olmalıdır. Yeni nesil sıralama, kitaplığın kılavuz RNA'larının sıkı bir dağılımına sahip olduğunu doğrulamak için kullanılabilir.

Hassas hatırlama çözümlemesi ekran performansını değerlendirmek için kullanılabilir. Yüksek performanslı bir ekran, altıdan daha büyük bir baz faktöründe çok sayıda temel geni kurtarmalı ve %5'ten daha az bir yanlış keşif hızı hassas geri çağırma eğrisi keskin bir dirseğe ve terminal noktasına doğru düz bir çizgiye sahip olmalıdır. Bayes faktörü gen nakavt bir fitness kusuru sonuçları bir güven ölçüsü temsil eder.

Yüksek skorlar güvenin arttığını gösterirken, düşük puanlar gen nakavtın büyüme avantajları sağladığını göstermektedir. Genom çapında nakavt havuzları bastırıcı direnç genleri aramak için aşırı ilaç ajan varlığında kültürlü olabilir. Timidin bloğunun bastırıcısı için pozitif bir seçim ekranı gerçekleştirmek için, T0'daki tüm kılavuz RNA'lar için normalleştirilmiş okuma sayıları, timidin ile tedavi edilen numuneler için ortalama normalleştirilmiş okuma sayılarına göre çizilir.

CRISPR ekranlarının başarılı bir şekilde performans göstermesinin önemli bir ayrıntısı, plazmidin transdüksiyonundan hücrelerin transdüksiyonuna kadar her kılavuz RNA'nın iyi dağılımını sağlamaktır. Bu kılavuz RNA gösterimi çarpık ve yanlış pozitif veya olumsuz sonuçlara yol açabilir rasgele etkileri olasılığını en aza indirecektir. Bir ekran doğrulamasını takiben, birincil ekran yalnızca olası isabetleri tanımladığından, isabetleri doğrulamak için denemeler yapılmalıdır.

Vuruşların biyolojisi bağlı olarak çeşitli yöntemler kullanılabilir. CRISPR düzenleme, yeni nesil sıralama ile birlikte, çeşitli insan modeli sistemlerinde fonksiyon ekranlarının genom ölçeğinde kaybına olanak sağlamıştır. CRISPR basitliği nedeniyle, ekranlar bu tür artık geniş tüm araştırmacılar için erişilebilir, daha fazla bilim adamı biyolojik süreçler ve hastalık çalışma için fonksiyonel genetik yöntemler kullanmak için izin.