Name: Bir dizi pratik ve uygulanabilir yöntem kullanarak RAF aile Kinazlarının hastalıkla ilgili mutantları karakterize etme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Keşfedin RAF aile kinazlarının hastalıkla ilişkili mutantlarını karakterize etme yöntemlerini. In vitro kinaz analizi, RAF ko-aktivasyon ve bölünmüş lusiferaz testleri kullanarak hassas ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Yuan Jimin desteği için Tüylü hücre lösemi Bursu kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Asya Fonu kanser Araştırması (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS KBrFA/2018/0014), NCCRF köprüleme hibe (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot hibe (NCCRF-YR2017-JUL-PG3) ve SHF akademik tıp tarafından desteklenmektedir Araştırma hibe (AM/TP011/2018).

1. RAF mutantların katalitik etkinliğini ölçmek için In vitro kinaz assay
<ol><li>, Gibson Assembly ya da geleneksel moleküler klonlama yöntemleri kullanarak C-Terminus Flag (dykddddk) etiketi ile raf mutantlar (Şekil 1A) kodlama vektörler oluşturun.
	<ol>
<li>Flag etiketini ve mutasyonlar raf kodlama dizileri PCRs tarafından tanıtmak ve sonra tüm dizileri pcdna 3.1 (+) vector Gibson derleme veya T4 DNA ligasyonu kullanarak ve üretim protokolleri aşağıdaki ekleyin. PCR reaksiyonları için aşağıdaki koşulları kullanın: (1) 95 °C, 2 dak; (2) 95 °C, 30 s; (3) 59 °C, 30 s; (4) 68 °C, 3 dk; (5) 20 döngüleri (2 için 4); (6) 4 °C tutun. Not: Klonlama için PCR astar: 5-AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC-3 ve 5-CAGCGGGTTTAAACGGGCCCTCTA-3.</li>
		<li>GST-Fused raf mutantlar adım 1.1.1 açıklandığı gibi aynı yöntemleri kullanarak vektörler kodlama oluşturmak için raf mutant kodlama dizileri upstream GST kodlama sırası ekleyin.</li>
		<li>Transfeksiyon öncesinde DNA sequencings tarafından tüm vektörler doğrulayın.</li>
	</ol></li>
	<li>5 x 105 hücreli bir yoğunlukta 6-kuyu plakalı plaka 293T hücreler/transfeksiyon önce iyi bir gün. Ne zaman hücre yoğunluğu ulaşır 80 ~ 90% konfluence ikinci gün, vektörler kodlama ile transfekt FLAG-Tagged RAF kinazlar veya onların mutantlar adım 1,1 transfeksiyon reaktifler (malzeme tablosu) üretiminin protokolünü izleyerek hücrelere.</li>
	<li>Kültür ortamını değiştirmek 24 h transfeksiyon sonra.</li>
	<li>Transfeksiyondan sonra kültür orta 48 h aspirate ve 400 μL/Well liziz tamponu (25 mM Tris · HCl, 150 mM NaCl, 1 mM etylenediaminetetraasetic asit (EDTA), 0,25% NP-40, pH 7,2) buz üzerinde Lyse hücrelere proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile desteklenmektedir. Not: NP-40 liziz tamponunun konsantrasyonu, RAF mutantların katalitik aktivitesini orta dimer benzeşme/stabilite ile algılamak için önemlidir. Yüksek konsantrasyon deterjan veya lizis tampon güçlü bir deterjan raf dimerleri kırabilir ve böylece raf kinazlar veya mutantların katalitik etkinliğini öldürmek.</li>
	<li>Hücre endoglikozidazları transfer 1,5 ml tüp ve aşağı spin 12.000 x g 10 dk 4 °c ' de hücre enkaz tüketmek için.</li>
	<li>1,5 ml tüplere temiz tüm hücre endoglikozidazları örnek başına transfer 300 μL, Anti-Flag benzerliği boncuklar örnek başına 20 μl ekleyin ve 1 h için soğuk bir odada (4 °c) döndürün. Ayrıca aşağıda açıklandığı gibi immünoblots tarafından RAF mutantların ifade ve aktivite (phospho-ERK1/2) tespit için bir kenara temiz tüm hücre lysate örnek başına 40 μL alın.</li>
	<li>Anti-Flag boncukları bir kez lizis tampon ile yıkayın, sonra bir kez kinaz reaksiyon tampon ile (20 mm HEPES, 10 mm MgCl2, 0,5 mm na3VO4, 0,5 mm DTT, pH 7,2), ve eklemek 20 μl kinaz reaksiyon karışımı (2 μg MEK1 (K97A) ve 100 μM ATP içinde 20 μl kinaz Re eylem arabelleği) örnek başına. Not: Boncuk yıkama yavaşça ve hızlı bir şekilde tamamlanmalı, kinaz reaksiyonu karışımı eklemeden önce kalan tampon tamamen aspirasyonlu olmalıdır ve bu adımda yapılan tüm operasyonlar soğuk bir odada 4 °C ' de yapılmalıdır.</li>
	<li>Kinaz reaksiyonlarını oda sıcaklığında (25 °C) 10 dakika boyunca kuluçla ve kinaz reaksiyonları içeren tüpleri inkübasyon sırasında her dakika parmaklarla çevirin.</li>
	<li>5 μL 5x SDS örnek tampon ekleyin (375 mM Tris · HCl,% 9 sodyum dodecil sülfat (SDS), 50% gliserol, 0,03% Bromophenol mavi) örnek başına kinaz reaksiyonları durdurmak için, ve sonra ısı örnekleri 90 °C 5 dakika.</li>
	<li>Numuneleri 9 ~ 12% Poliakrilamid jel elektroforez (PAGE) ile 0,1% SDS ile çalıştırın, proteinleri nitroselüloz membrandan aktarın ve immünoblot örneklerinde phospho-MEK ve RAF mutantların seviyelerini algılayın. Not: Phospho-MEK de γ32P-ATP birleştirmesi kullanılarak nicelik olabilir. Kısaca, 10 μM γ32P-ATP kinaz reaksiyon tamponuna eklenir ve fosforilated mek miktarı, standart autoradiography, fosforlu görüntüleme veya sıvı scintilik sayma TEKNIKLERINI kullanarak sayfa ayrılması sonrasında nicelik olarak hesaplanır Uygun.</li>
</ol>2. RAF Co-kinase-Dead RAF mutantların Allosteric etkinliğini değerlendirmek için aktivasyon assay
<ol><li>Vektörler oluşturmak raf alıcısı (CraF kinaz alanı fosforsız NTA motif, aaff ile) veya kinaz ölü raf aktipolörleri (fosforilasyon-mimicked NTA motif, ssdd, ddee veya dgee ile raf kinaz etki) (Şekil 1A) olarak 1,1 adımda açıklanmıştır.</li>
	<li>İki vektörler hem RAF alıcısı ve kinaz ölü RAF aktivatörü ya da tek bir vektör olarak adımları 1,2 ve 1,3 açıklandığı gibi bir protein kodlama kodlama ile 293T hücreleri transfect.</li>
	<li>Nakli sonrası 24 saat içinde kültür ortamını değiştirin ve 1,4 ve 1,5 adımda açıklandığı gibi tüm hücre endoglikozidazları hazırlamak için 48 h 293t transfektanları hasat.</li>
	<li>Temiz tüm hücre lysate ile 5x SDS örnek tampon hızlı bir şekilde oda sıcaklığında (25 °C) karıştırın ve sonra 90 °C ' de 5 dakika kaynatın.</li>
	<li>% 0,1 SDS ile 9 ~ 12% sayfa haşlanmış tüm hücre lysate örnekleri çalıştırın, nitroselüloz membran için proteinleri aktarmak ve phospho-ERK1/2 ve immünoblots tarafından kontrol proteinleri düzeylerini tespit.</li>
</ol>3. RAF mutantların bağıl dimer affinity/Istikrar ölçme için ücretsiz Split luciferase assay
<ol><li>Vektörler kodlama yapı bayrak-Tagged raf mutantlar nluc n-Terminus (n-Terminus Firefly luciferase, AA2-416) veya c-Terminus Cluc (c-Terminus Firefly luciferase, aa398-550), adım 1,1 açıklandığı gibi erimiş.</li>
	<li>1,2 adımda açıklandığı gibi farklı Nluc-RAF mutantlar ve Cluc-RAF mutantlar kodlama vektörler bir çift ile 293T hücreleri transfekt.</li>
	<li>Transfeksiyondan sonra 24 saat, renk içermeyen orta ile iyi başına 2x105 hücre yoğunluğunda Krystal siyah görüntü plakaları Içine 293t hücre transfektanları replate (yani, fenol kırmızı olmadan dmem).</li>
	<li>24 saat sonra, D-Luciferin (0,2 mg/ml) 293t hücre transfererlerine ekleyin, 30 dakika boyunca inküye yapın ve çok algılama sistemi (malzeme tablosu) kullanarak Lusiferaz sinyallerini ölçün.</li>
	<li>Lusiferaz sinyallerini ölçmeden sonra, 1,4 ve 1,5 adımda açıklandığı gibi tüm hücre endoglikozidazları hazırlamak için lizis tampon ile orta ve Lyse 293t transfektanlar Aspire.</li>
	<li>% 0,1 SDS ile 9 ~ 12% Page tüm hücre lysate örnekleri çalıştırın ve adım 2,5 açıklandığı gibi anti-Flag immünoblot tarafından nluc-raf mutantlar ve Cluc-raf mutantlar ifade düzeylerini algılamak. 293T transfektanlarında Nluc-RAF mutant ve Cluc-RAF mutant göreli ifade seviyeleri kendi immünoblots gelen J görüntü kullanılarak nicelleşmiş.</li>
	<li>Nluc-raf mutantları ve Cluc-raf mutantların ifade seviyelerine göre 293t hücreli transfektanların Lusiferaz sinyallerini normalleştirin. Kısaca, bu adım 3,6 nluc-raf mutantlar ve Cluc-raf mutantların göreli ifade seviyeleri ile ham Lusiferaz sinyali bölünerek elde edilir.</li>
</ol>

<ol><li>Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+regulating+the+Raf+kinase+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of regulating the Raf kinase family.</a> Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).</li>
<li>Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAF+proteins+take+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The RAF proteins take center stage.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).</li>
<li>Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+nature%3A+biological+functions+of+the+Raf-1+%22kinase%22%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letter%22%5BJournal%5D)">Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase".</a> FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).</li>
<li>Lavioe, H., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+RAF+protein+kinases+in+ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).</li>
<li>Schreck, R., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raf+kinases%3A+oncogenesis+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Raf kinases: oncogenesis and drug discovery.</a> International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).</li>
<li>Roberts, P. J., Der, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Raf-MEK-ERK+mitogen-activated+protein+kinase+cascade+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer.</a> Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).</li>
<li>McCubrey, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+Raf%2FMEK%2FERK+pathway+in+cell+growth%2C+malignant+transformation+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Biophysics+Acta%22%5BJournal%5D)">Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance.</a> Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).</li>
<li>Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+Ras+in+developmental+disorders+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).</li>
<li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).</li>
<li>Garnett, M. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guilty+as+charged%3A+B-RAF+is+a+human+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene.</a> Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).</li>
<li>Pandit, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain-of-function+RAF1+mutations+cause+Noonan+and+LEOPARD+syndromes+with+hypertrophic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).</li>
<li>Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serine+and+tyrosine+phosphorylations+cooperate+in+Raf-1%2C+but+not+B-Raf+activation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation.</a> EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+activation+of+functionally+asymmetric+RAF+kinase+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers.</a> Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).</li>
<li>Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alike+but+different%3A+RAF+paralogs+and+their+signaling+outputs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs.</a> Cell. 161 (5), 967-970 (2015).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimer-dependent+catalytic+activity+of+RAF+family+kinases+is+revealed+through+characterizing+their+oncogenic+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants.</a> Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).</li>
<li>Wan, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+activation+of+the+RAF-ERK+signaling+pathway+by+oncogenic+mutations+of+B-RAF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF.</a> Cell. 116 (6), 855-867 (2004).</li>
<li>Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinases+and+pseudokinases%3A+lessons+from+RAF%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinases and pseudokinases: lessons from RAF.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).</li>
<li>Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudokinases+from+a+structural+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Pseudokinases from a structural perspective.</a> Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).</li>
<li>Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dimerization-dependent+mechanism+drives+RAF+catalytic+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation.</a> Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).</li>
<li>Heidorn, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase-dead+BRAF+and+oncogenic+RAS+cooperate+to+drive+tumor+progression+through+CRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF.</a> Cell. 140 (2), 209-221 (2010).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+mutations+in+MEK1+enhance+homodimerization+and+promote+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis.</a> Science Signaling. 11 (554), 6795(2018).</li>
<li>Yuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AMPK+inhibitor+overcomes+the+paradoxical+effect+of+RAF+inhibitors+through+blocking+phospho-Ser-621+in+the+C+terminus+of+CRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinase+regulation+by+hydrophobic+spine+assembly+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer.</a> Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).</li>
<li>Poulikakos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitor+resistance+is+mediated+by+dimerization+of+aberrantly+spliced+BRAF%28V600E%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E).</a> Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+that+blocks+ATP+binding+creates+a+pseudokinase+stabilizing+the+scaffolding+function+of+kinase+suppressor+of+Ras%2C+CRAF+and+BRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).</li>
<li>Taylor, S. S., Kornev, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinases%3A+evolution+of+dynamic+regulatory+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochemistry+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins.</a> Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).</li>
<li>Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+Raf-1+kinase+cascade+by+coumermycin-induced+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization.</a> Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).</li>
<li>Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+activates+c-Raf-1+through+a+Ras-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism.</a> Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).</li>
<li>Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+Ras+induces+heterodimerization+of+cRaf+and+BRaf%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf.</a> Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).</li>
<li>Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+and+mutant+B-RAF+activate+C-RAF+through+distinct+mechanisms+involving+heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization.</a> Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).</li>
<li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li>
<li>Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitors+transactivate+RAF+dimers+and+ERK+signalling+in+cells+with+wild-type+BRAF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF.</a> Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).</li>
<li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meaningful+relationships%3A+the+regulation+of+the+Ras%2FRAF%2FMEK%2FERK+pathway+by+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+Journal%22%5BJournal%5D)">Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions.</a> Biochemistry Journal. 351, Pt 2 289-305 (2000).</li>
<li>Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22RAF%22+neighborhood%3A+protein-protein+interaction+in+the+Raf%2FMek%2FErk+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">"RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway.</a> FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).</li>
<li>García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Protein+Interactions%3A+Emerging+Oncotargets+in+the+RAS-ERK+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cancer%22%5BJournal%5D)">Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway.</a> Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).</li>
<li>Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+regulated+protein%E2%80%93protein+interactions+revealed+with+firefly+luciferase+complementation+imaging+in+cells+and+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).</li>
<li>Chen, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+BRAF+deletions+that+function+as+homodimers+and+are+sensitive+to+inhibition+by+RAF+dimer+inhibitor+LY3009120%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120.</a> Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).</li>
<li>Foster, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+mechanism+of+oncogenic+deletion+mutations+in+BRAF%2C+EGFR%2C+and+HER2%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2.</a> Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar, rakip finansal çıkarların olmadığını beyan ederler.

Bu yazıda, içinde vitro kinaz assay, raf Co-aktivasyon tahlil ve ücretsiz bölünmüş Lusiferaz tahlil dahil hastalık ile ilgili raf mutantlar, karakterize etmek için üç yöntem sundu. Raf kinazları hem katalitik aktivite ve allosterik aktivite olduğundan, çeşitli raf mutantlar iki farklı mekanizmalar aracılığıyla akış sinyalizasyon aktive edebilir13,14,16,17, 18....

Raf aile kinazları RAS/raf/mek/erk sinyalizasyon Cascade, Mitojen aktif protein kinaz (mek)1,2,3,4etkinleştirmek için RAS bir sinyal iletme önemli bir bileşenidir. Bu kinazlar ailesi hücre büyüme, hayatta kalma ve farklılaşma önemli bir rol oynar, ve onların değişiklikler birçok hastalık neden, özellikle kanser5,6,7,8. Son zamanlarda, genomik sequencings RAS/raf/mek/erk Cascade9,10,11sinyal iletimi farklı özellikleri sergiler birçok hastalık ile ilgili raf mutantlar belirledi. RAF mutantların dikkatli bir karakterizasyonu bize RAF mutantların RAS/RAF/MEK/ERK Cascade sinyal çıkışını değiştirmek nasıl moleküler mekanizmaları anlamak yardımcı olacaktır, sonunda çeşitli RAF mutant odaklı hastalıklar tedavisinde uygun yaklaşımlar seçin.
RAF aile kinazlar üç üye içerir, CraF, BRAF, ve Araf, benzer moleküler yapıları ama farklı yetenekleri olan1,2,3,4sinyalizasyon akış etkinleştirmek için. Bu paraloglar arasında, BRAF onun kurucu fosforile NTA (N-tTerminal acidic) Motif tarafından en yüksek aktivite vardır12,13,14, Araf en düşük sahip iken , standart olmayan APE motif15' den kaynaklanan aktivite. Bu hastalıklarda RAF paralogları farklı mutasyon frekansları açıklayabilir: BRAF > CRAF > ARAF. Dahası, aynı RAF paralog içinde, farklı sitelerde mutasyonlar, RAF ailesinin kinazlarının düzenlenmesi için karmaşıklık başka bir katman ekler ayrı görgü, akış sinyalizasyon tetikleyebilir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar tüm raf kinlerinin katalitik ve allosterik faaliyetlere sahip olduğunu göstermiştir13, 14,16,17,18. Yapıcı aktif RAF mutantları, doğrudan fosforlama MEK tarafından geri akış sinyallerini açmak, kinaz ölü RAF mutantlar yan yana dimerization aracılığıyla vahşi tip meslektaşları transactivate ve Me-ERK sinyalizasyon aktive edebilirsiniz16 ,19,20. Dimer yakınlık/kararlılık sadece kinaz ölü raf mutantların allosterik etkinliğini belirler değil, aynı zamanda kurucu aktif raf mutantların katalitik etkinliğini etkileyen bir anahtar parametresidir15,21, 22. kinaz-ölü raf mutantlar yüksek dimer benzeşimi/stabilitesi ile doğrudan endojen vahşi tip RAFs transactivate olabilir15, ara dimer yakınlık ile olanlar/istikrar aktif RAS veya bir koordinasyon gerektirir 13,15,20,21,23işlevi için vahşi tip raf moleküllerinin yüksek düzeyde. Benzer şekilde, bir dimer bağımlı şekilde kurucu aktif raf mutantlar fosforylate mek, ve düşük dimer yakınlık/stabilitesi olan zayıf raf dimerleri tatili immünoprecipitation üzerine kendi katalitik etkinliğini kaybetmek15, 21,22. Dimer benzeşimi/kararlılık da kendi inhibitörleri için RAF mutantların duyarlılığı belirler ve pozitif RAF inhibitörleri direnci ile ilişkilidir24. Bu nedenle, hastalıkla ilgili RAF mutantlarını karakterize etmek için Katalitik ve allosterik aktivitelerini ve dimer yakınlık/stabilitesini ölçmek gerekir.
Son yıllarda, laboratuar ve diğerleri RAF aile kinazlar ve mutantları karakterize etmek için çeşitli yöntemler geliştirdik. Laboratuvarımıza ve başkalarının deneyimlerine göre, aşağıdaki üç testin hastalık ile ilgili RAF mutantları tanımlamada avantajları olduğunu düşünüyoruz: (1) kurucu katalitik etkinliğini algılamak için kolaylığı ile gerçekleştirilebilir in vitro kinaz tahlil aktif RAF mutantlar15; (2) kinaz-ölü raf mutantların allosterik etkinliğini ölçmek için güvenilir ve uygun bir yöntemdir raf Co-aktivasyon assay13,15,21,22,23, 25; (3) geleneksel Co-immünoprecipitation tahlil karşıt olarak raf mutantların bağıl dimer benzeşimi/istikrar ölçümünde çok daha yüksek hassasiyete sahip ücretsiz bölünmüş Lusiferaz tahlil, ve gelişmiş ekipman olmadan yürütmek mümkün SPR (SUrface Plasmon Resonance) analizi15,22gibi nicel analitik yöntemlerle kontrast. Bu üç asder birleştiren, biz kolayca nasıl bir hastalık ile ilgili RAF mutant akış sinyalizasyon değiştirir ve böylece bu RAF mutasyonu nedeniyle hastalığı tedavi etmek için uygun bir terapötik strateji yararlanmak anlayabiliriz.

<table><tbody><tr><td>anti-fosfoERK1/2</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>4370</td><td></td></tr><tr><td>anti-fosfoMEK1/2</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>9154</td><td></td></tr><tr><td>anti-ERK1/2</td><td>AB klonal</td><td>A0229</td><td></td></tr><tr><td>anti-MEK1/2</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojileri</td><td>9124</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG (fare)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>anti-HA</td><td>Novus Biologicals</td><td>MAB6875</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG (Tavşan)</td> <td>Hücre Sinyal Teknolojileri</td><td>14793</td><td></td></tr><tr><td>anti-&beta;-aktin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2228</td><td></td></tr><tr><td>anti-FLAG boncukları (M2)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A4596</td><td></td></tr><tr><td>HRP konjuge anti-fare IgG Jackson</td><td>Laboratuvarları</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>HRP konjuge anti-Tavşan IgG</td><td>Jackson Laboratuvarları</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1 (+)</td> <td>In vitrojen</td><td>V79020</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Montaj Klonlama&nbsp; Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Roche</td><td>11 814 443 001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM fenol kırmızı</td><td>Invitrogen</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>D-lusiferin ve nbsp;</td><td>GoldBio</td><td>LUCK-100</td><td></td></tr><tr><td>6xhis etiketli MEK1 (K97A)</td><td>&nbsp; Daha önceki çalışmalarımızda hazırlanan</td><td>N.A.</td><td>Referans 15.</td></tr><tr><td>GloMax-Multi Algılama Sistemi.</td><td>Promega</td><td>E7041</td><td></td></tr></tbody></table> İkinci El

bir dizi pratik ve uygulanabilir yöntem kullanarak raf aile kinazlarının hastalıkla ilgili mutantları karakterize etme

Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods

Hızla hızlandırılmış Fibrosarkom (RAF) aile kinazları hücre biyolojisinde merkezi bir rol oynamaktadır ve bunların fonksiyon bozukluğu kanserler ve gelişimsel bozukluklara yol açar. Hastalık ile ilgili RAF mutantlarının bir karakterizasyonu, bu hastalıkların tedavisinde uygun terapötik stratejileri seçmemize yardımcı olacaktır. Son çalışmalar RAF aile kinazların hem katalizör ve allosterik faaliyetler, sıkı dimerization tarafından düzenlenmiş olduğunu göstermiştir. Burada, katalitik ve allosterik faaliyetleri ve RAF ailesinin kinazlarının ve mutantların bağıl dimer yakınlık/stabilitesi belirlemek için pratik ve uygulanabilir Yöntemler bir dizi inşa ettik. Öncelikle, biz tampon deterjan konsantrasyonu azaltarak klasik in vitro kinaz tahlil değiştirildi, nazik bir hızlı yıkama prosedürü kullanarak, ve bir glutatyon S-transferase (GST) füzyon sırasında bunalımları raf dimerleri önlemek için istihdam Arıtma. Bu da bize, kurucu aktif RAF mutantların katalitik aktivitesini uygun şekilde ölçmemizi sağlar. İkincisi, biz bir roman raf Co-aktivasyon assay N-terminal kesilmiş raf proteinleri kullanarak kinaz-ölü raf mutantlar allosterik etkinliğini değerlendirmek için geliştirilen, geçerli protokollerde aktif RAS gereksinimini ortadan kaldırarak ve böylece daha yüksek bir elde Duyarlılık. Son olarak, biz kantitatif bağıl dimer yakınlık ölçmek için benzersiz bir tamamlayıcı bölünmüş Lusiferaz tahlil oluşturulan/çeşitli raf mutantların istikrar, hangi daha güvenilir ve duyarlı geleneksel Co-immünoprecipitation tahlil kıyasla. Özetle, bu yöntemlerin aşağıdaki avantajları vardır: (1) Kullanıcı dostu; (2) gelişmiş ekipman olmadan etkili bir şekilde yürütmek mümkün; (3) maliyet-etkili; (4) son derece hassas ve yeniden oluşturulabilir.

RAF ailesinin kinazları hem katalizör hem de allosterik faaliyetlere sahiptir, bu da hastalıkla ilgili mutantların farklı mekanizmalar üzerinden akış sinyallerini açmasını sağlar13,14,16,17 ,18. Kurucu aktif RAF mutantları doğrudan fosforylate onların substratlar, kinaz-ölü RAF mutantlar vahşi tip meslektaşları transaktive yoluyla işlevlerini yerine getirmek....

Bu yazıda, içinde vitro kinaz assay, raf Co-aktivasyon tahlil ve tamamlayıcı Split Lusiferaz assay dahil raf aile kinazları, hastalık ile ilgili mutantlar karakterize için pratik ve uygulanabilir Yöntemler bir dizi sundu.

Bir dizi pratik ve uygulanabilir yöntem kullanarak RAF aile Kinazlarının hastalıkla ilgili mutantları karakterize etme

The rapidly accelerated fibrosarcoma (RAF) family kinases play a central role in cell biology and their dysfunction leads to cancers and developmental ...

Bu yöntem, hastalığa bağlı RAF kinaaz yöntemlerinin etkili karakterizasyonu kolaylaştırır. Bu teknik son derece hassas ve tekrarlanabilir, uygun maliyetli, kullanıcı dostu ve herhangi bir gelişmiş ekipman gerektirmez. RAF mutantlarının katalitik aktivitesini ölçmek için, standart protokollere göre uygun vektöre tüm dizileri eklemeden önce PCR tarafından RAF kodlama dizisine bayrak teknolojisi mutasyonları getirin.Raf mutant kodlama dizilerinin transferaz kodlama dizisi olarak glutatyon ekleyin, transferaz erimiş RAF mutantlar olarak glutatyon kodlama vektörler oluşturmak için, aynı şekilde. Standart protokollerine göre RAF kinazlarını veya mutantlarını etiketledibayrağı kodlayan vektörlerle %80 ila %90'lık confluent 293T hücre kültürlerini transvect. Kültür 24 saat sonra, her kültürde orta değiştirin.Kültür 48 saat sonra, proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile desteklenen lysis tampon 400 mikrolitre ekleyin, buz her kuyuya. 5-10 dakika sonra hücre enkaz ını tortulamak için santrifüj için 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Her numunenin 300 mikrolitresini tek tek 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın.Aşağı doğru toptan fosil ekstra hücresel sinyal düzenlenmiş kizaz bir ve iki ekspresyon ve aktivite amino leke analizi için örnek başına 40 mikrolitre ayırın. Her tüpe 20 mikrolitre anti-FLAG afinite boncuk ekleyin, dört derece santigrat soğuk odada rotasyon ile bir saatlik kuluçka için. Kuluçka sonunda hızlı ve yavaşça soğuk odada lysis tampon ve kizaz reaksiyon uğrama tampon ile bir kez kisaz reaksiyon karışımı 20 mikrolitre eklemeden önce anti bayrak boncuklar bir kez yıkayın.Düşük Dima afinitesi olan Grafik Mutantlar Dima dissociation nedeniyle in vitro katalitik aktivite kaybedebilir. Bu nedenle, hızlı ve nazik yıkama önemlidir. Her dakika çevirme ile oda sıcaklığında 10 dakika sonra, örnek başına beş mikrolitre beş XSDS örnek tampon ile kizaz reaksiyonları durdurmak ve beş dakika boyunca 90 derece santigrat derecede örnekleri kaynatın.Kuluçka sonunda, %0.1 SDS ile %9-12 poliakrilamid elektroforez jeli üzerinde numuneleri çalıştırın, sonra proteinleri nitroselüloz membrana aktararak her numunedeki fosfo mitojen-aktive protein kiazaz ve RAF mutantlarının seviyelerinin immün blotting ile algılanmasını sağlar. Kiaz ölü RAF mutantların Allosteric aktivitesini değerlendirmek için, RAF alıcı veya kiaz ölü RAF aktivatörleri kodlama vektörler inşa. Transvect 293 T hücreleri iki vektör ile hem RAF alıcı ve kinaz ölü RAF aktivatör, ya da tek bir vektör gösterildiği gibi proteinlerin birini kodlama kodlama kodlama.Gösterildiği gibi 48 saatlik kültürden sonra tüm hücreli sıvıları hasat edin ve temiz hücre lisatını oda sıcaklığında beş XSDS numune tamponuyla hızlı bir şekilde karıştırın, lysates'i 90 derecede beş dakika kaynatmadan önce. Daha sonra haşlanmış tüm hücre lizat örneklerini %0,1 SDS olan 9-12% poliakrilamid elektroforez jeli üzerinde çalıştırın ve proteinleri nitroselüloz membrana aktarın. Göreceli dimer yakınlık ve RAF mutantların istikrarı ölçmek için firefly luciferase veya C Terminus bir ateş böceği luciferase terminus erimiş bayrak teknoloji taslak mutantlar kodlama vektörler inşa.Transvect 293 T hücreleri vektörleri farklı ve Terminus firefly luciferase RAF mutantlar ve C Terminus bir firefly luciferase RAF mutantlar kodlayan bir çift gösterildiği gibi. Transveksiyon replate iki kez 10 sonra 24 saat 5 293 T hücre işlemleri iyi başına renk siz ortamda kristal siyah görüntü plakaları içine. Transvesyondan 48 saat sonra luciferini 293 T hücre travestilerine ekleyin ve 30 dakika kuluçkaya yatırın.Çok algılama sistemindeluciferase sinyalleri ölçmeden önce. Ölçüm sonunda supernatents aspirate ve blice 293 T hücreleri lysas tampon ile gösterildiği gibi. Tüm hücre lizat örnekleri% 0.1 SDS ile 9-12% poliakrilamid elektroforez jel üzerinde çalıştırın.Firefly luciferase RAF mutantların son terminus ifade düzeylerini algıla, ya da firefly luciferase RAF mutantların C terminus anti bayrak amino leke tarafından gösterildiği gibi. Daha sonra Firefly luciferase ve Firefly luciferase RAF mutantların C terminus son terminus ifade düzeylerine göre 293 T hücre transvectants luciferase sinyalleri normalleştirmek. In vitro kinasa asa etkili bazı kurucu olarak aktif R-omurga mutantların katalitik aktivitesini araştırmak için kullanılabilir, ama bir erimiş C-omurga ile kimyaz ölü mutantlar değil.Ancak zayıf bir dimer yakınlık veya istikrar ile kurucu aktif RAF mutantların katalitik aktivitesi, onların dimers arıtma işlemi sırasında kırık olarak bu ASA kullanılarak probed olmayabilir. Zayıf dimer yakınlık veya istikrar ile RAF mutantların katalitik aktivite kaybını önlemek için, bu mutantlar mutantların katalitik aktivitesikurtarmak için glutothionas transferaz ile erimiş olabilir. RAF co-aktivasyon ASA kinaz ölü RAF Mutantlar allosteric aktivitesini değerlendirmek için kullanılabilir.Asidik son terminal motifi ve C omurga füzyonu ile resimli kinaaz ölü mutantlar gibi, allosteric aktivatörler olarak non fosfor göreceli asidik uç terminal motifi ile mutantların katalitik aktivitesini tetiklemek için işlev, co 293T hücreleri ifade zaman. Ayrıca ücretsiz bir bölünmüş luciferase SA göreceli dimer yakınlık veya RAF aile kinazları ve mutantların istikrarı ölçmek için kullanılabilir. Düşük oranda deterjan içeren lysas tamponu kullanmak ve numune saflaştırması sırasında hızlı bir yıkama işlemi, başarılı bir in vitro kinaaz SA için gereklidir. Bu teknik araştırmacılar ın, hastalığın RAF mutantlarını nasıl ileteceğini tam olarak belirlemelerine, aşağı akım yolunu etkinleştirmelerine ve hastalık tedavisi için uygun tedavi stratejilerinin seçilmesini kolaylaştırmalarına yardımcı olacaktır.

characterize-disease-related-mutants-raf-family-kinases-using-set

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Lösin Zengin Kinaz 2 tekrarlayın büyük bir multidomain kinaz, mutasyonlar olan Parkinson hastalığı, en sık rastlanan genetik nedenidir. Bu protein kinaz aktivitesinin analizi, biyoloji ve bu protein disfonksiyonu anlamada çok önemli bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Bu...

LRRK2 Kinaz Aktivitesi Assaying In vitro</em

Kinaz inhibitörü tedavisi karşı genetik direnç ortaya çıkması etkili kanser tedavisi için önemli bir sorun teşkil etmektedir. Yeni geliştirilen ilacın karşı tanımlanması ve dirençli mutasyonların karakterizasyonu daha iyi klinik yönetim ve yeni nesil ilaç tasarımında yardımcı olur. Burada, in vitro tarama ve dirençli mutasyonların doğrulama için bizim protokol açıklar.

Kinaz İnhibitörleri Karşı Dayanıklı Mutasyonlarının Tarama ve Doğrulama için Bir Yöntem

Protein kinazlar, inter-ve intraselüler sinyal iletimi için kritik olan, oldukça gelişen sinyalleme enzimleri ve iskeletleridir. Radyoaktif işaretli adenosin trifosfatın ([γ- 32 P] ATP) kinaz aktivitesini ölçmek için bir protokol sunuyoruz, bu hücresel sinyal düzenlenmesinin aydınlatılmasına yardımcı olan güvenilir bir yöntemdir.

Protein Kinaz Aktivitesini Radyoaktif Etiketli ATP ile Tahlil

Bu da çalışmanın Rab10 fosforilasyon endojen düzeyleri lösin yönünden zengin tekrar kinaz 2 algılama basit bir yöntem açıklanır.

Rab10 fosforilasyon algılama SDS-sayfa bir fosfat bağlayıcı etiketi ile kullanarak LRRK2 etkinliğini tarafından

Burada, bir protokol sinyal yolları çeşitli hücresel modellerinde değişiklikler tanımlamak antikor diziler için mevcut. Uyuşturucu/hipoksi/ultra-violet ışık/radyasyon, veya overexpression/downregülasyon/altını gizleme, neden bu değişiklikleri çeşitli hastalık modelleri için önemlidir ve bir tedavi etkili olacak veya mekanizmaları ilaçların belirleyebilirsiniz olup olmadığını gösterir direnç.

Direnç Tirozin kinaz inhibitörleri sinyal iletim yollarının antikor dizileri tarafından bir sorgulama tarafından değerlendirilmesi

Biz güçlü biyokimyasal yaklaşımlar kullanarak yeni bir kinaz protein karakterize: farklı hücre hatları ve dokularda adanmış spesifik antikor ile Batı Blot analizi, coimmunoprecipitation deneyler ile etkileşimler, Batı tarafından tespit kinaz aktivite Fosho spesifik antikor ve γ [32P] ATP etiketleme kullanarak Blot.

Yeni kinaz proteinin sağlam biyokimyasal yaklaşımlar kullanılarak moleküler düzeyde karakterize edilmesi

Kiaz inhibitörlerinin taranması için kendi kendine biraraya getirilen insan proteinmikrodizilerinin üretimi için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur.

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

Bu protokol, canlı hücrelerde CRAF kinazın 14-3-3 proteinleri ile etkileşimlerini ölçmek için BRET tabanlı bir testi tanımlar. Protokol, hücrelerin hazırlanması, BRET emisyonlarının okunması ve veri analizi için adımların ana hatlarını çizmektedir. Tahlil optimizasyonu için uygun kontrollerin tanımlanması ve sorun gidermenin yer aldığı örnek bir sonuç da sunulmaktadır.

Canlı Hücrelerde CRAF'ın 14-3-3 Proteinleri ile Etkileşimlerinin Ölçülmesi için Biyolüminesans Rezonans Enerji Transferi (BRET) Tabanlı Test

Kimyasal genetik, bir kapı bekçisi kalıntısının, hedef lokusta farklı bir yan zincir içeren bir amino asit ile değiştirilmesini içerir. Burada, cdpk1'in hipomorfik bir alelini içeren mutant bir parazit oluşturduk ve mutant arka planda parazit tarafından benimsenen telafi edici yolları belirledik.

Bitki Benzeri Kinazların Hipomorfik Alelini Barındıran Mutant Bir Sıtma Parazitinde Telafi Edici Yolların Gelişimini Anlamak

Bu protokol, rapamisin tarafından düzenlenen fosfatazların tasarımını, oluşturulmasını ve uygulanmasını açıklar. Bu yöntem, canlı hücrelerde fosfataz aktivasyonunun yüksek özgüllüğü ve sıkı zamansal kontrolünü sağlar.

Rapamisin ile Düzenlenmiş Tirozin Fosfatazların Geliştirilmesi ve Uygulanması

RASopatiler, RAS-MAPK yolağı hiperaktivasyonunun neden olduğu multisistemik genetik sendromlardır. Doğrulanmayı bekleyen potansiyel olarak patojenik varyantlar sürekli olarak ortaya çıkarken, zayıf klinik öncesi kanıtlar tedaviyi sınırlar. Burada, genç muhabir zebra balığında canlı FRET görüntüleme ile RASopati ile ilişkili ERK aktivasyon seviyelerini ve embriyogenez sırasındaki farmakolojik modülasyonunu test etmek ve çapraz doğrulamak için in vivo protokolümüzü açıklıyoruz.

Canlı FRET mikroskobu ve immünofloresan ile erken zebra balığı Noonan sendromu modellerinde ERK aktivite modülasyonunu değerlendirmek için etkili bir protokol

Keşfedin RAF aile kinazlarının hastalıkla ilişkili mutantlarını karakterize etme yöntemlerini. In vitro kinaz analizi, RAF ko-aktivasyon ve bölünmüş lusiferaz testleri kullanarak hassas ve tekrarlanabilir sonuçlar elde edin.

Bir dizi pratik ve uygulanabilir yöntem kullanarak RAF aile Kinazlarının hastalıkla ilgili mutantları karakterize etme

Daha fazla video keşfet