Name: Yetişkin İnsan Beyninden Kısa Süreli Serbest Kayan Dilim Kültürleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Öğrenin yetişkin insan beyninden kısa süreli serbest yüzen dilim kültürleri hazırlama yöntemini. Bu basit ve uygun maliyetli protokol, nörodejenerasyon mekanizmalarını incelemek için biyokimyasal ve immünohistokimyasal analizler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma FAPESP (Grant 25681-3/2017 to AS), CAPES (Doktora Sonrası Burs PNPD/INCT-HSM'den A.F.'ye ve N.D.M.'ye Doktora Öncesi Burs) ve FAEPA tarafından desteklenmiştir. G.M.A., FAPESP'den (MS 2018/06614-4) yüksek lisans bursuna sahiptir. N.G.C.'nin CNPq Araştırma Bursu'na sahibivar. Bu çalışma için rezeke edilen dokuları bağışlayan hastalara ve ailelerine teşekkür ederiz. Biz ribeirão Preto Tıp Fakültesi Klinik Hastanesi, São Paulo Üniversitesi, sürecin çeşitli aşamalarında yardımcı sakinleri, hemşireler, teknisyenler ve CIREP ekibinin desteğini kabul etmek istiyorum.

Farmakodirençli temporal lob epilepsisi tedavisi için rezeksiyonlu nöroşirürji uygulanan hastalardan canlı erişkin beyin dokuları elde edilmiştir(Şekil 1A). Tüm prosedürler Ribeirão Preto Tıp Fakültesi Klinikler Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylandı (17578/2015) ve hastalar (veya yasal sorumlu kişi) kabul etti ve bilgilendirilmiş onay şartları imzaladı. Doku koleksiyonu Epilepsi Cerrahisi Merkezi'nde nöroşirürji ekibi tarafından yapıldı (CIREP - Klinikler Hastanesi Ribeirão Preto Tıp Fakültesi, São Paulo Üniversitesi, Brezilya).
1. Malzemelerin sterilizasyonu
NOT: Tüm malzeme ve çözeltiler kullanılmadan önce sterilize edilmelidir.
<ol><li>Tüm cerrahi aletleri ve vibratom dilimleme malzemelerini (bıçak tutucu, numune diski, tampon tepsi) kuru sterilizasyon fırınında 180 °C'de 4 saat sterilize edin.</li>
	<li>Uv veya gama ışınlama ile ısıya duyarlı malzeme veya ekipmanları sterilize edin.</li>
	<li>0,22 m'lik gözenek membranları ile otoklavasyon veya filtrasyon ile ortam ve çözümleri sterilize edin.</li>
</ol>2. Çözümlerin hazırlanması
<ol><li>15-20 mL taşıma çözeltisi hazırlayın: %50 v/v Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) pH 7.4, doğum sonrası ve erişkin beyin nöronlarının bakımı için %50 v/v bazal ortam(Malzeme Tablosu),10 mM 4-(2-hidroksitil)-1- piperazineeeesülfonik asit (Hepes), 3 mg/mL glukoz ve 33 μg/mL gentamisin. NOT: Taşıma çözeltisi numune toplamadan en az 20 dakika önce buzdolabında ve oksijenlendirilmelidir (karbogen gazı ile köpüren).</li>
	<li>300 mL dilimleme çözeltisi (HBSS 10 mM HEPES ve 3 mg/mL glikoz ile desteklenir) hazırlayın ve ilk kristal oluşumu noktasına kadar dondurucuda soğutun.</li>
	<li>Kültür ortamının 20 mL'sini hazırlayın: doğum sonrası ve erişkin beyin nöronlarının bakımı için bazal ortam(Malzeme Tablosu) %1 L-glutamin türevi (Malzeme Tablosu), nöral kültür için %2 ek (Tablo Malzemeler), %1 penisilin/streptomisin ve 0.25 g/mL amphotericin B.</li>
</ol>3. Dilimleme cihazının kurulması
NOT: Bu protokol, cerrahi odada numune toplamanın lojistiği nedeniyle bir meslektaşının yardımıyla ideal olarak gerçekleştirilmektedir.
<ol><li>Tuz ilave buz bir kova, karbogen karışımı köpüren altında dilimleme çözeltisi dinlenme sağlar (95% O2, 5% CO2) kullanmadan önce en az 20 dakika.</li>
	<li>Dilimleme sırasında doku örneğine ek mekanik destek oluşturmak için %3 agarose (yaklaşık 2 cm x 2 cm x 2 cm) bir blok hazırlayın ve vibratom numunediskine yapıştırın (Şekil 1E).</li>
	<li>Dilimleme için vibratomu ayarlayın: 200 μm'lik kesit kalınlığı, 100 Hz titreşim frekansı ve 0,5-1,0 mm/s arasında dilimleme hızı.</li>
	<li>Vibratom tampon tepsisini vibratom tabanına kilitleyin ve dilimleme çözeltisini ve numuneyi almadan önce ve dilimleme işlemi boyunca buzdolabında tutmak için buz ekleyin.</li>
</ol>4. Örnek toplama
NOT: Bu protokolde insan neokortikal dokusu cerrahi odada toplanarak laboratuvara taşınmış.
DİkKAT: İnsan örnekleri ile uğraşırken, Kurum tarafından belirlenen uygun güvenlik protokollerine uyun.
<ol><li>Oluşan taşıma aparatı(Şekil 1C)ayarlayın: taşıma ya gaz çıkışı bağlayan bir silikon boru bağlı gaz çıkışını kontrol eden bir basınç / akı vanasına bağlı karbogen karışımı ile taşınabilir bir gaz silindiri gemi; bir taşıma gemisi, genellikle gaz girişi için delikli kapaklı 50 mL konik santrifüj tüp, taşıma çözeltisi içeren; ve taşıma sırasında numune soğutma için buz.</li>
	<li>Numuneyi(Şekil 1B)hemen toplayın ve laboratuvara taşıyın. Numuneyi soğuk taşıma çözeltisi içine batırın (sürekli karbogen karışımı ile kabardır).</li>
</ol>5. Dilimleme
<ol><li>Numuneyi dilimleme solüsyonu içeren bir Petri kabına (100 mm x 20 mm) aktarın ve ince cerrahi aletlerle numunede kalan menenjlerin mümkün olduğunca dikkatli bir şekilde çıkarılmasını sağlar(Şekil 1D).</li>
	<li>Deneysel tasarımın belirli özelliklerine sahip dilimler üretmek için en iyi numune yönünü seçin ve 24 no'lu neşter bıçağıyla, numune diskine yapıştırılmış taban olacak şekilde düz bir yüzeyi kırpın.</li>
	<li>Tek kullanımlık plastik kaşık ve hassas boya fırçaları kullanarak, Petri kabından parça yıkın ve filtre kağıdı kullanarak fazla çözeltiyi kurulayın (kılcal damara göre kurulayın ve doku parçasına kağıtla dokunmaktan kaçının).</li>
	<li>Süper yapıştırıcı kullanarak, dokuyu diske sıkıca yapışıp agarose bloğuyla temas edene kadar vibratom numune diskine takın (Şekil 1E).</li>
	<li>Vibratom numune diskini (doku düzgün bağlanmış) tüm işlem boyunca köpürmesi gereken dilimleme çözeltisi ile dolu vibratom tampon tepsisine yerleştirin.</li>
	<li>Bıçak tutucuyu jilet sıkıca sabitlenmiş olarak yerine kilitleyin.</li>
	<li>Dilimleme çözeltisi hem numuneyi hem de bıçağı kapsamalı, ancak daha sonra dilimlemeye başlamalıdır (Şekil 1F).</li>
	<li>Numuneyi 200 μm dilimhalinde kesin. NOT: Bazı vibratomlar numuneleri otomatik olarak kesse de, süreç sırasında ki yakın gözlem ve dilimleme hızındaki küçük ayarlamalar daha iyi dilimler üretmeye yardımcı olabilir. İlk düzensiz dilimleri atın.</li>
	<li>Dilimleme çözeltisi ile tampon tepsiden bir Petri kabına dilimleri aktarın ve gevşek kenarları ve aşırı beyaz mater yaklaşık% 70 korteks/% 30 beyaz madde oranında kırpın.</li>
</ol>6. Kültür
NOT: Bu adımı steril ortamda laminar akış dolabında gerçekleştirin.
<ol><li>Her kuyubaşına 600 μL kültür ortamı ekleyin (24 kuyu plakalı) ve dilimleri kaplamadan önce en az 20 dakika 36 °C'de ve %5 CO2'ye kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Bir boya fırçası kullanarak her bir dilimde plaka(Şekil 1G).</li>
	<li>Plakada kullanılmayan kuyular varsa, 400 μL steril su ile doldurun.</li>
	<li>Plakayı 36 °C,%5 CO2'dekuluçkaya yatırın. NOT: İlk orta replasman dilimin büyüklüğüne bağlı olarak kaplamadan sonra 8-16 saat arasında yapılmalıdır.</li>
	<li>50 ng/mL beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) ile daha önce hazırlanmış kültür ortamının ek 10 mL'si. NOT: İlk 8-16 h sırasında, bu aşamada orta tüketim hızlandırılır beri, besin yoksunluğu ve asitleşme önlemek için orta 600 μL içinde kuluçkaya yatırılır. Bir sonraki adımdan itibaren, kuyu başına orta hacmi 400 μL'ye ayarlanır.</li>
	<li>Her kuyudan 333 μL'lik şartlı ortamı çıkarın ve 133 μL taze BDNF destekli ortam ekleyin.</li>
	<li>Her 24 saatte bir, şartlandırılmış ortamın üçte birini taze BDNF destekli ortamla değiştirerek orta replasman işlemini tekrarlayın.</li>
</ol>7. Kültürlü dilimlerde sağlık, morfoloji ve fonksiyonun değerlendirilmesi
NOT: Temsili sonuçlarda illüstrasyon amacıyla hücre ölümünü indüklemek için, bazı dilimler oksidatif stres indükleyici H2O2ile 24 saat tedaviye sunulmuştur. 7.1.2 ve 7.1.3 adımları hücre ölümünü tetiklemek için H2O2'nin kullanımını tanımlar.
<ol><li>Hücre canlılığı NOT: Sorunlu dilim kültürlerinde nörotoksik/nörokorumayı değerlendirmek için basit ve basit bir yöntem 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium (MTT) tsay36, metabolik aktif hücrelerin yüzdesini ölçen tedavi edilen numunelere göre normal koşullarda.<ol>
<li>Laminar akış dolabında, ortamın üçte birini taze orta ile değiştirin.</li>
		<li>%30 H2O2 stok çözeltisinden, hedeflenen nihai konsantrasyona (30 mM veya 300 mM) ulaşmak için kuyu başına2O2 hacmi ekleyin. NOT: H2O2, zorlu ktan önce taze besin lerin doğru şekilde tedarikini garanti altına almak için ortamın günlük değişiminden sonra eklenmiştir.</li>
		<li>Plakayı 36 °C'de 24 saat, %5 CO2'dekuluçkaya yatırın. NOT: H2O2 tedavisinden (veya diğer toksik uyarıcılardan) sonra, aşağıdaki adımlar MTT tayini ile hücre canlılığının belirlenmesini tanımlar.</li>
		<li>Plakadaki her kuyuya 0,5 mg/mL'lik son konsantrasyona 40 μL MTT çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Plakayı 36 °C'de, %5 CO2'de 3 saat kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Dilimleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve mikrotüp aktarın.</li>
		<li>Pipetleme yaparak kalan çözeltiyi dikkatlice çıkarın.</li>
		<li>Her dilimin kütlesini belirlemek için dilimleri içeren mikrotüpleri tartın (bu, elde edilen emici okumaları normalleştirmek için anahtardır). NOT: Gerekirse numuneler daha sonra işlenmesi için bu aşamada dondurulabilir (-20 °C).</li>
		<li>Motorlu bir zararlı madde kullanarak dilimleri 200 μL'lik isopropanol/HCl'de homojenize edin.</li>
		<li>2 dk oda sıcaklığında santrifüj (RT) 2600 x g.</li>
		<li>Supernatant toplamak ve 540 nm emici ölçmek.</li>
	</ol></li>
	<li>KCl'ye bağlı nöronal depolarizasyon NOT: Mitojen aktive protein kilaz (MAPK) sinyalçağlayan protein ERK, batı bloting takip fosforilasyon, KCl indüklenen depolarizasyon nöronal yanıtın sayısallaştırılması için kullanılabilir37 .<ol>
<li>Akış kabininde, kültür ortamını daha önce 36 °C'ye denk gelen HBSS'nin 300 μL'si ile değiştirin.</li>
		<li>HBSS'yi daha önce 36 °C'ye denk gelen 300 μL taze HBSS ile değiştirin.</li>
		<li>Plakayı 36 °C'de, %5 CO2'yi 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>HBSS'yi taze HBSS veya 80 mM KCl depolarizasyon çözeltisi (her ikisi de 36 °C' de) ve 36 °C' de %5 CO2 ile 15 dakika boyunca inkübünle değiştirin.</li>
		<li>Dilimleri plakadan mikrotüplere aktarın. Bu adımda, dilimler daha sonra işlenmesi için -20 °C'de saklanabilir.</li>
		<li>150 μL radyoimmünopreyağış (RIPA) tampon (50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; %1 noniyonik yüzey aktif madde; %0.1 sodyum dodecil sülfat; pH 7.5) şeklinde doku ekstrelerini hazırlayın. 16000 x g'da10 dk için 4 °C'de santrifüj özleri supernatant toplar ve Bradford yöntemini kullanarak toplam protein konsantrasyonu belirler.</li>
		<li>%12 sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforezine (SDS-PAGE) toplam proteinin 30 g'ını yükleyin.</li>
		<li>Elektroforezden sonra jel içeriğini nitroselüloz membrana aktarın.</li>
		<li>TBS artı% 0.1 Tween% 5 yağsız kuru süt ile membran bloke sonra, fare anti-pERK ile kuluçka anti-pERK (1:1,000) için 16 saat için 4 °C. Yıkandıktan sonra, tavşan anti-ERKile RT'de 2 saat kuluçkaya yatırın ve (1:1,000).</li>
		<li>1 saat için RT uygun HRP konjuge ikincil antikor ile kuluçka.</li>
		<li>Tercih edilen HRP substratı ile ortaya çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Morfolojik değerlendirme NOT: Hücre sağkalım ve fonksiyonel değerlendirmelere ek olarak doku morfolojisini analiz etmek önemlidir. Kültürlü dilimrezeksiyon morfolojik analiz için mümkün olduğunca çok yüksek kaliteli malzeme üretmek için önemli bir adım olduğunu unutmayın.<ol>
<li>Dilimlerin sabitlenmesi, kriyokoruma ve rezeksiyonu<ol>
<li>Kültür ortamına sahip kuyulardan dilimleri PBS içeren yeni bir 24 kuyu plakasına aktarın.</li>
			<li>PBS çıkarın ve% 4 paraformaldehit (PFA) 1 mL ekleyin. PfA eklemeden önce dilimlerin düz tutulması önemlidir. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
			<li>PfA çözeltisini dikkatlice çıkarın ve 1 mL %30 sakaroz çözeltisi ekleyin. 4 °C'de 48 saat kuluçka.</li>
			<li>Dondurucu mikrotomu -40 °C'ye ayarlayın.</li>
			<li>Dilimlerin yerleştirilmeleri gereken mikrotom aşamasında bir sakaroz tabanı hazırlayın(Şekil 2A). Tamamen dondurun ve dikkatlice dilim yerleştirilecek düz bir yüzey üretmek için dondurulmuş sakaroz bazı kesti.</li>
			<li>Gerilmiş plastik film üzerine her dilim yerleştirin ve doku düz bir paintbrush kullanın.</li>
			<li>Uzatılmış dilimi tek bir hamlede donmuş sakaroz tabanına aktarın. NOT: Dondurulmuş sakaroz tabanının üzerine çıktıktan sonra dilimin hareket ettirmesi mümkün değildir. Bu aktarım adımLarını dikkatle gerçekleştirin.</li>
			<li>Uygun dondurma için dilim 5-10 dakika dinlendirin.</li>
			<li>Dilimi 30 μm'lik bölümlere kesin.</li>
			<li>30 μm'lik bölümleri PBS içeren bir Petri kabına aktarın.</li>
			<li>Deneysel tasarım için daha yeterli histoloji protokolüne devam edin. NOT: 30 μm'lik kesitler serbest yüzen immünohistokimya için kolayca kullanılabilir, daha fazla histoloji için mikroskopi slaytlarına monte edilebilir veya -20 °C'de antifriz çözeltisinde saklanabilir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>İmmünohistokimya NOT: İmmünohistokimya ve immünofloresan standart protokolleri laboratuarlar arasında farklılık gösterir. Burada kullanılan protokolün ayrıntılı bir sürümü için Horta vd.38'ebakın. Şekil 2'de sunulan immünostainings için kullanılan primer antikorlar nöronal çekirdekler (NeuN), sağlıklı olgun nöron belirteci, glial fibrillary asidik protein (GFAP), astorsit belirteci, iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör (Iba-1) ve mikroglia Işaretleyici.<ol>
<li>Dilimleri 40 dakika boyunca bloklama çözeltisi (örneğin, PBS'de %2 normal eşek serumu) kuluçkaya yatırın.</li>
			<li>4 °C'de hafif ajitasyon altında primer antikor ile gece boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
			<li>PBS ile yıkandıktan sonra, RT hafif ajitasyon altında biyotinylated ikincil antikor ile 120 dakika kuluçka.</li>
			<li>PBS ile yıkandıktan sonra, avidin-peroksidaz konjuge(Malzeme Tablosu)ile 120 dk boyunca RT'de kuluçkaya yatırın.</li>
			<li>DAB + %0.04 nikel amonyum ile ortaya çıkarın.</li>
			<li>Jelatin kaplı mikroskopi slaytlar üzerine lekeli bölümleri monte edin ve onları kuru hava sağlar. Etanol dehydrate, ksilen diyafram, montaj ortamı ile bitirmek(Malzeme Tablosu),bir coverslip ile kapak, ve görüntü.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Serbest yüzen, kısa süreli dilim kültürleri üretmek için bu protokol yetişkin insan neokortikal dilimleri kültüriçin alternatif bir yöntemdir. Dilim kültürleri için böyle bir protokol optogenetik1,44,45, elektrofizyoloji2,3,4,5 çalışmaları için uygun olabilir , kısa süreli plastisite4...

Araştırmada insan örneklerinin kullanımı kesinlikle insan beyin patolojileri çalışma için harika bir seçenektir, ve modern teknikler hasta kaynaklı doku kullanarak sağlam ve etik deney için yeni yollar açmıştır. Yetişkin insan beyninden hazırlanan organotipik/dilim kültürleri gibi yöntemler optogenetik1, elektrofizyoloji2,3,4,5, plastisite gibi paradigmalarda giderek daha fazla kullanılmaktadır. 6,7,8,9, nörotoksisite / nörokoruma10,11,12,13, hücre tedavisi14, ilaç tarama15,16,17, genetik ve gen düzenleme12,18,19,20, diğerleri arasında, daha iyi bir strateji olarak yetişkinlik döneminde nörolojik hastalıkların anlaşılması.
İnsan beyin patolojilerinin altında yatan mekanizmaların kavrayışı, çok sayıda denek gerektiren deneysel stratejilere bağlıdır. Buna karşılık, dilim kültürleri söz konusu olduğunda, insan örneklerine erişim hala zor olsa da, tek bir kortikal örnekten 50 dilim emme olasılığı, birden fazla gönüllüyü toplanan doku başına kopya sayısı ve yapılan tahliller21.
Beyin organotipik / dilim kültürleri için çeşitli protokoller tarif edilmiştir, klasik oculo taslakları arasında değişen22,23 silindir tüp24,25,26, yarı geçirgen membranlar arayüzü27,28,29,30, ve serbest yüzen dilimler31,32. Deneysel bir tasarımın özelliklerine bağlı olarak, her tekniğin kendi avantajları ve dezavantajları vardır. Yetişkin insan beyinlerinden kısa vadeli, serbest yüzen dilimler kültürleri bazı durumlarda Stoppini ve ark.27tarafından kullanılan yöntem üzerinde avantajlıdır , eğer in vitro uzun vadeli hücre sağkalım genellikle önemli bir endişe olduğu gerçeğini göz önünde bulundurursak bir kültür yöntemi, birçok deneyde kültürde sadece kısa süreler gereklidir12,31,32,33,34,35. Bu koşullar altında, serbest yüzen kültürlerin kullanımı daha basit ve daha uygun maliyetli olmanın avantajı nı sunar, hem de daha doğru 2-3 hafta boyunca kültürde tutulan dilimleri daha orijinal insan dokusu durumu andıran.
Dilim kültürlerin nörolojik potansiyeline rağmen, bu tür kültürleri hazırlamak için yetişkin sinir dokusu nu kullanan çalışmalar, özellikle insan deneklerinden hala çok azdır. Bu makalede, serbest yüzen dilim kültürleri hazırlamak için rezeke beyin cerrahisi gönderilen yaşayan insan donörlerden toplanan beyin dokusu kullanmak için bir protokol açıklanmaktadır. Bu kültürleri kullanarak biyokimyasal ve hücre biyolojisi denemelerinin sürdürülmesi ve yapılması için prosedürler ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Bu protokol, yetişkinliğe bağlı nöropatolojilerin mekanizmaları üzerinde yapılan araştırmalarda canlılık ve nöronal fonksiyonuanaliz etmek için değerli olduğu kanıtlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>2-Propanol</td><td>Merck</td><td>1096341000</td><td></td></tr><tr><td>Akrilamid/Bis-Akrilamid, %30 çözelti</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3449&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat</td><td>Sigma</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin B</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Antikor anti-ERK 2 (tavşan)</td> <td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-154</td><td>Seyreltme 1: 1.000 BSA'da% 2.5</td></tr> <tr><td>Antikor, anti-pERK (fare)</td> <td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-7383</td><td>Seyreltme 1: 1.000 BSA'da 2.5%</td></tr> <tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRP3014</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 1x Boya Reaktifi</td><td>BioRad</td><td>500-0205</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>RIPA tamponunda kullanılır</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Merck</td><td>108337</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuzları</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1387-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Merck</td><td>1003171000</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen Peroksit (H2O2)</td> <td>Vetec</td><td>194</td><td></td></tr><tr><td>Fare IgG, HRP bağlantılı bütün Ab (fare karşıtı)</td> <td>GE</td><td>NA931-1ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>1064041000</td><td>RIPA tamponunda kullanılır</td></tr><tr><td>Neurobazal A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Yağsız kuru süt (Molico)</td> <td>Nestl&eacute;</td><td></td><td>Membran bloke etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>PBS Tampon pH 7,2</td><td>Laborclin</td><td>590338</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomisin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Merck</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>Prime Western Blotting Tespit Reaktifi</td><td>GE</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan IgG, HRP'ye bağlı bütün Ab (tavşan önleyici)</td> <td>GE</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr><tr><td>RIPA tamponunda kullanılan</td> <td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L5750</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>GE</td><td>17-1312-01</td><td></td></tr><tr><td>Tiazolil Mavi Tetrazolyum Bromür (MTT)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>M5655</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T-1378</td><td>RIPA tamponunda kullanılan</td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td>RIPA tamponunda kullanılan</td></tr><tr><td>Ultra saf Su</td><td>Milliporu</td><td></td><td>MiliQ su arıtma sisteminden elde edilen steril su</td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman ve Malzeme</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu plakalar</td><td>Corning</td><td>CL S3526</td><td>Kapaklı Düz Tabanlı</td></tr><tr><td>Amersham Potran Premium (nitroselüloz membran)&nbsp;</td><td>GE</td><td>29047575</td><td></td></tr><tr><td>Karbojen Karışımı</td><td>Beyaz Martins</td><td></td><td>% 95 O2,% 5 CO2</td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>CO-24</td><td>Dilimlerin inkübasyonu% 5 CO2, 36 & C</td></tr><tr><td>Mikroplaka Okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotüpler</td><td>Greiner</td><td>001608</td><td>1,5 mL mikrotüp</td></tr><tr><td>Motorlu havaneli</td><td>Kimble Chase</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastik kaşık</td><td></td><td></td><td>Tatlı kaşığı büyüklüğü</td></tr><tr><td>Jiletli</td><td>Bic</td><td></td><td>Krom Platin, vibratom ile dilimlemede kullanılır</td></tr><tr><td>Neşter Bıçağı</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>Sayı 24</td><td>Doku dilimlemek için kullanılır; aynı boyutta veya daha küçük önerilir</td></tr><tr><td>Süper Yapıştırıcı (Loctite Super Bonder)</td><td>Henkel</td><td></td><td>Kompozisyon: Etilcianoacrilato; 2-Propenoik asit; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-kresol; homopolimer</td></tr><tr><td>Vibratom ve nbsp;</td><td>Leica</td><td>14047235612 - VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>İmmünohistokimya için Malzeme/Ekipman Adı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antikor anti-NeuN (fare)</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>MAB377</td><td>Fosfat Tampon Antikoru</td></tr><tr><td>anti-GFAP (fare)</td> <td>Merck</td><td>MAB360</td><td>Seyreltme 1: 1.000 Fosfat Tampon</td></tr><tr><td>Antikoru anti-Iba1 (tavşan)</td> <td>Abcam</td><td>EPR16588 - ab178846</td><td>Fosfat Tamponunda Seyreltme 1: 2.000 Fosfat Tamponu</td></tr><tr><td>Biyotinillenmiş anti-fare IgG Antikoru (H + L)</td> <td>Vektör</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-9015</td><td></td></tr><tr><td>Entellan</td><td>Merck</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>1.00983.1000</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin</td><td>Synth</td><td>00G1002.02.AE</td><td>Slaytları kaplamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>SM2010R</td><td>Donma Aşaması (BFS-10MP, Physiotemp) ile donatılmıştır, -40&ordm'ye ayarlanmıştır; C</td></tr><tr><td>Normal Eşek Serumu</td><td>Jackson İmmüno Araştırması</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan IgG, HRP'ye bağlı bütün Ab (tavşan önleyici)</td> <td>GE</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Slaytlar (Star Frost)</td> <td>Knittel Glaser</td><td></td><td>Jelatin kaplı slaytlar</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Vetec</td><td>60REAVET017050</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC HRP Kiti (Peroksidaz, Standart)</td><td>Vektör</td><td>PK-4000, Kit Standart</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen</td><td>Synth</td><td>01X1001.01.BJ</td><td></td></tr></tbody></table>

yetişkin İnsan beyninden kısa süreli serbest kayan dilim kültürleri

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Organotipik, ya da dilim kültürler, yaygın in vitro işleyen merkezi sinir sisteminin yönlerini modellemek için istihdam edilmiştir. Nörolojide dilim kültürlerin potansiyeline rağmen, bu tür kültürleri hazırlamak için yetişkin sinir dokusu kullanarak çalışmalar hala kıt, özellikle insan deneklerin bu. Yetişkin insan dokusunun dilim kültürleri hazırlamak için kullanımı özellikle insan nöropatolojilerinin anlaşılmasını geliştirmek için çekicidir, çünkü kemirgenden (genellikle yenidoğan) üretilen dilimlerden yoksun olgun insan beyninin tipik benzersiz özelliklerine sahiptirler. sinir dokusu. Bu protokol, kısa süreli, serbest yüzen dilim kültürleri hazırlamak için rezeksiyon beyin cerrahisi ne gönderilen yaşayan insan donörler toplanan beyin dokusu nasıl kullanılacağını açıklar. Bu kültürleri kullanarak biyokimyasal ve hücre biyolojisi denemelerinin sürdürülmesi ve yapılması için prosedürler de sunulmaktadır. Temsili sonuçlar, tipik insan kortikal laminasyonunun 4 gün in vitro (DIV4) sonrasında, ana sinir hücre tiplerinin beklenen varlığıyla dilimler halinde korunduğunu göstermektedir. Ayrıca, DIV4'teki dilimler, bu modelin hücre ölümü tahlillerinde bir platform olarak hizmet etme potansiyelini gösteren, toksik bir uyarıcı (H2O2)ile meydan okunduğunda sağlam hücre ölümü geçirerek devam eder. Bu yöntem, membran kesici uçlar kullanarak yaygın olarak kullanılan protokole daha basit ve uygun maliyetli bir alternatif, esas olarak yaşilişkili beyin hastalıklarının arkasındaki nörodejenerasyon mekanizmalarını çözmeyi amaçlayan kısa süreli tahliller için tavsiye edilir. Son olarak, protokol farmakodirençli temporal lob epilepsisi cerrahisi tedavisine gönderilen hastalardan toplanan kortikal dokunun kullanılmasına ayrılmış olsa da, diğer beyin bölgelerinden/koşullardan toplanan dokunun da benzer serbest yüzen dilim kültürleri üretmek için kaynak olarak kabul edilir.

Kültürdilimlerinin kalitesini ve sağlığını değerlendirmek için kritik bir yönü beklenen nöral hücre tipleri, nöronlar ve glial hücrelerin varlığı ve tipik morfolojisidir. İnsan kortikal laminasyontipik mimarisi DIV4 bir dilim gözlendi, nöronal immünetiketleme ile ortaya (Şekil 2D). Buna ek olarak, mikroglia ve astroglia beklenen varlığı(Şekil 2B,C)de gözlendi. Bu sonuçlar doku mimarisinin cerrahi işlem/numune işleme veya in vitr...

Yetişkin insan beyninden serbest yüzen dilim kültürleri hazırlamak için bir protokol sunulmaktadır. Protokol membran ekler kullanarak yaygın olarak kullanılan dilim kültür yönteminin bir varyasyonudur. Bu basit, maliyet-etkin, ve yaşilişkili beyin hastalıkları arkasında nörodejenerasyon mekanizmaları çözmek için amaçlayan kısa vadeli tahliller çalıştırmak için önerilir.

Yetişkin İnsan Beyninden Kısa Süreli Serbest Kayan Dilim Kültürleri

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Rezeksiyon beyin cerrahisine gönderilen canlı insan donörlerinden toplanan beyin dokusundan serbest çesitli dilim kültürleri hazırlamak için bir protokol sayılmiyoruz. Bu kültür biyokimyasal ve hücre biyolojisi tahlilleri veya immünohistokimya yapmak için münakat. Bu ilişkili beyin hastalıklarında nörodejenerasyon altında yatan mekanizmanın açıklanmasına katkıda bulunması bekleniyor.Bu tekniğin en büyük avantajı membran kesici uçlar kullanarak klasik dilim kültürü protokolüne daha basit ve uygun maliyetli bir alternatif olmasıdır. Genel protokol karmaşık olmasa da, menenjlerin çıkarılması, dokunun vibratom numune diskine yapıştırMa ve immünohistokimya rezeksiyonu gibi bazı adımlar görsel olarak gösterildiğinde en iyi şekilde anlaşılmaktadır. Prosedürü göstermek için yardımcı Niele Mendes ve Glaucia Almedia yüksek lisans öğrencileri, ve Giovanna Nogueira, başka bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır.Bu prosedüre başlamak için, buz bir kova tuz ekleyin. Dilimleme çözeltisini bu kovaya aktarın ve kullanmadan önce en az 20 dakika boyunca karbogen karışımının altında dinlendirin. Daha sonra, iki santimetre iki santimetre yaklaşık iki santimetre olan% 3 agarose bir blok hazırlamak.Dilimle

short-term-free-floating-slice-cultures-from-the-adult-human-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

E18 Rat Brain Organotipik Dilim Kültür

Biz diğer beyin bölgelerine kolayca adapte edilebilir Organotipik hipokampal dilim hazırlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Beyin dilimlerini bir arayüz oluşturmak için izin gözenekli membranlar ve kültür ortamı üzerine koydu. Bu yöntem, kültür 2 hafta kadar hipokampus brüt mimarisi korur.

Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

Bu protokol, postnatal beyin ve rostral göçmen akışı neuroblast göç yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için optimize edilmiş bir Organotipik dilim tahlil açıklamaktadır.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Bu video, yetişkin insan beyninden serbest yüzen dilim kültürleri hazırlamak için bir tekniği göstermektedir. Bir vibratom kullanılarak bir beyin bölümünden ince dilimler oluşturulur. Bu dilimler daha sonra doku canlılığını korumak için büyüme faktörleri ile desteklenmiş bir kültür ortamında süspanse edilir.

Yetişkin Bir İnsan Beyninden Serbest Yüzen Dilim Kültürlerinin Hazırlanması

Video, glioblastoma dokusundan organotipik dilim kültürlerinin oluşturulmasını ve sürdürülmesini göstermektedir. İzole edilen doku bir agaroz matrisine gömülür ve bir vibratom kullanılarak ince kesitler elde edilir. Bu bölümler daha sonra bir mikroplaka içindeki geçirgen membran eklerine yerleştirilir ve uzun süreli bakım için bir dilim kültür bakım ortamında kültürlenir.

İnsan Glioblastoma Dokusundan Dilim Kültürlerinin Oluşturulması ve Sürdürülmesi

Bu yazıda, kesme için özel modifikasyonlar (sükroz eklemek gibi) olmadan ve dilim hazırlamadan önce hayvanın intrakardiyal perfüzyonu olmadan geleneksel bir fizyolojik çözelti kullanarak, fizyolojik sıcaklıkta akut beyin dilimleri hazırlamak için bir yöntem gösteriyoruz.

Slice It Hot: Fizyolojik Sıcaklık Akut Yetişkin Beyin Dilimleme

Burada organotipik dilim kültür tekniği kullanılarak hipokampal doğum sonrası nöron incelemek için bir teknik tarif. Bu yöntem, yetişkin nöron in vitro müdahale edilebilmesini sağlar ve kültürlenmiş hipokampus farmakolojik maddelerin doğrudan uygulama için izin verir.

POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler

Organotypic Hipokampal dilim kültürler (OHSC) vivo durumu çok iyi taklit bir vitro modeli temsil. Burada biz vibratome tabanlı açıklar yüksek kaliteli dilimleri tümör hücreleri biyolojik davranışını veya yeni maddeler nöroprotektif potansiyelini değerlendirmek amacıyla elde etmek için iletişim kuralı Dilimleme geliştirilmiş.

Organotypic Hipokampal dilim kültürler çalışma Neuroprotection ve tümör hücrelerinin Invasiveness Model olarak

Sunulan işte kültür için değiştirilmiş silindir tüp yöntemi ve hassas photoetched coverslips üzerinde yeniden konumlandırma ile birçok hafta boyunca zaman zaman yüksek çözünürlüklü görüntüleme kemirgen beynin dilimler. Nöronal canlılığı ve dilim Morfoloji korunur. Sağlanan virüsler hücre tipi için belirli ifade kullanarak bu tamamen kapalı sistem uygulamaları.

Tam yerelleştirilmiş ve tekrarlayan aralıklı görüntüleme sırasında beyin dilimler halinde kapalı bir sistemi uzun vadeli kültürü için değiştirilmiş Roller tüp yöntemi

Bu protokol, spontan keskin dalga dalgalanma aktivitesi sergileyen farelerden yatay hipokampal-entorhinal korteks (HEC) dilimlerinin hazırlanmasını açıklar. Dilimler basitleştirilmiş bir arayüz tutma odasında inkübe edilir ve kayıtlar, doku oksijenlenmesini ve ağ düzeyinde aktivitenin kendiliğinden ortaya çıkmasını teşvik etmek için hızlı akan yapay beyin omurilik sıvısı ile su altında koşullar altında gerçekleştirilir.

Spontan Hipokampal Ağ Aktivitesini Araştırmak için Akut Fare Beyin Dilimlemeyi

Bu protokol, yetişkin insan korteksinin uzun süreli organotipik kültürlerini, indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı kortikal progenitörlerin ex vivo intrakortikal transplantasyonu ile birlikte tanımlamakta ve insan nörodejeneratif bozuklukları için kök hücre bazlı tedavileri daha fazla test etmek için yeni bir metodoloji sunmaktadır.

İnsan Kök Hücre Nakli ve Validasyonu için Ex vivo Model Olarak Yetişkin İnsan Korteksinin Organotipik Kültürleri

Öğrenin yetişkin insan beyninden kısa süreli serbest yüzen dilim kültürleri hazırlama yöntemini. Bu basit ve uygun maliyetli protokol, nörodejenerasyon mekanizmalarını incelemek için biyokimyasal ve immünohistokimyasal analizler sunar.

Yetişkin İnsan Beyninden Kısa Süreli Serbest Kayan Dilim Kültürleri

Daha fazla video keşfet