İmmünfluoresans Ile Küçük Hücreli Olmayan Akciğer Kanseri Hastalarından Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin Yarı Otomatik PD-L1 Karakterizasyonu ve Numaralandırılması

Mikroakışkan teknolojiye dayanarak, ctc'lerin normal kan hücresinden izolasyonu ve karakterizasyonu spesifik CTC biyobelirteçlerinin kullanılmasını gerektirmez ve hücre kültürü ile uyumludur. Bu protokol yüksek oranda CTC ekstraksiyonu kolaylaştırır ve malign sitomorfolojik özellikleri değerlendirerek CtC'lerin kapsamlı bir sitolojik analizini sağlar. KTK'lar tarafından PD-L1 ekspresyonu akciğer kanseri yönetiminde prediktif bir değere sahiptir.

Bu testi kullanarak saptanması iyileştirilmesi uzun vadede daha iyi bir hasta yönetimini teşvik edebilir. Bu protokolün diğer uygulaması FISH kullanarak genetik sapmaların saptanması veya KTK'larda transkripsiyon analizinin yapılmasının yanı sıra annelerde fetal kökenli hücreleri izole etmektir. Prosedürü gösteren Julie Balandier, laboratuvarımızdan bir teknisyen.

Öncesi analitik dolaşan tümör hücre zenginleştirme için, ilk bir potasyum EDTA tüp içine kan 7.5 mililitre toplamak, ve hücre sedimantasyon ve pıhtılaşma önlemek için nazik ajitasyon altında örnek tutmak. Toplama altı saat içinde, mikrobiyolojik güvenlik kabini altında serolojik bir pipet kullanın, yeni bir 50 mililitre santrifüj tüp içine tam kan 7,5 mililitreye kadar aktarmak için, ve oda sıcaklığında 1600 kez G 10 dakika için örnek santrifüj. Santrifüjsonunda, buffy ceket rahatsız etmeden plazma fraksiyonu toplamak için bir transfer pipet kullanın ve PBS eşdeğer hacmi ile plazma seyreltmek, kadar 7.5 mililitre.

Daha sonra, dikkatle kan örneğine kırmızı kan hücresi lisis tampon ekleyin, son hacmi ne 30 mililitre, ve yavaşça kan toplama tüpü üç kez ters, oda sıcaklığında tüp yerleştirmeden önce 10 dakika. Kuluçka sonunda, santrifüj ile hücreleri toplamak ve dikkatle supernatant son dört ila beş mililitre hariç tüm kaldırın. Kalan supernatant kaldırmak için filtrelenmiş bir mikropipet kullanın ve tüp duvarından aşağı resuspension tampon bir mililitre eklemek için filtreli ucu ile bir P1000 mikropipet kullanın.

Kabarcıklar tanıtmak önlemek için, örnek homojen olana kadar, nazik pipetleme ile hücre pelet yeniden askıya. Pelet yeniden askıya alındıktan sonra, kabarcıklar tanıtmadan tüpün duvarına üç mililitre resuspension tampon ekleyin ve hücreleri yavaşça tekrar karıştırın. Tümör hücre zenginleştirme dolaşan spiral mikroakışkan cihaz için, ilk cihazüzerine yeni bir spiral mikroakışkan çip yük ve giriş ve çıkış portlarının her birine boş bir 50 mililitresantrifüj tüp yükleyin.

Spiral mikroakışkan cihazı üç dakika asal için asal tıklatın. Döngü sonundaki giriş ve çıkış tüplerinin çıkarılması. Yeniden askıya alınan kan örneğini giriş portuna yükleyin ve çıkış portuna 15 mililitrelik konik bir tüp yükleyin.

Sonra çalıştır'a tıklayın ve 31 dakikalık dolaşımdaki tümör hücre zenginleştirme programını başlatmak için program 3'ü seçin. Çevrimin sonunda çıkış tüpünü santrifüje aktarın ve süpernatantın son iki mililitresi hariç hepsini çıkarmak için beş mililitrelik serolojik pipet kullanın. Sonra supernatant son 100 mikrolitre hariç tüm kaldırmak için bir mikropipet kullanın.

İmmünofloresan boyama için, hücreleri hemositometrede sayın ve zenginleştirilmiş numuneyi %0,2 anti-bağlayıcı çözelti konsantrasyonunun 100 mikrolitresi başına 10 ila beşinci hücrelere seyreltin. Daha sonra, numune haznesinin konturunu nemlendirmek için 50 mikrolitre anti-bağlayıcı çözelti ile ıslatılmış bir pamuklu bez kullanın ve numune odasına polilizin cam kaydırağı yerleştirin. Hazneyi kapatın ve pipet, süpernatantın son 100 mikrolitresinde numuneyi yeniden askıya almadan önce bir mikropipet ucunu bağlayıcı çözeltiyle kaplamak için üç kez yukarı ve aşağı kapatın.

Hücre çözeltisini numune odasına aktarın ve numuneyi düşük bir ivmeyle dakikada 400 dönüşte 400 dönüşle özel bir santrifüjde situp çevirin. Santrifüjsonunda, birikimetri alanının etrafına silikon bir izolatör yerleştirin ve iki dakika boyunca mikrobiyolojik güvenlik kabini altında slayt kuru izin, sonra oda sıcaklığında 10 dakika için% 4 paraformaldehit 100 mikrolitre ile sitospun örnek düzeltmek, üç iki dakika yıkama başına PBS 200 mikrolitre ile yıkama, oda sıcaklığında. Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında reaktifi bloke ederek 30 dakikalık kuluçka ile spesifik olmayan herhangi bir bağlamayı engelleyin ve ardından 100 mikrolitre antikor çözeltisi ile etiketlendi.

Etiketli kaydırağı 100'e 15 mililitrelik petri kabına, iki mililitre steril suyla nemlendirilmiş emici bir kağıda yerleştirin ve kabı bir gecede ışıktan korunan dört derece santigrat derecede kapatın. Ertesi sabah, numuneyi gösterildiği gibi PBS ile üç kez yıkayın ve numuneyi uygun bir montaj çözeltisi ve cam kapak fişi ile 10 mikrolitre monte edin. Sonra açık oje ile kapak kayma mühür.

Sitospun örneklerini görüntülemek için, slaytı X Y motorlu platformlu düz floresan mikroskoba yükleyin ve antikor etiketlemede kullanılan floroforlara göre 20 x nesnel ve uygun kanalları seçin. Cıva lambasını açın ve mikroskobu ve ilişkili yazılımı yarı otomatik çekime uyarla. Lamba hazır olduğunda, edinme menüsünde dört kanalı tanımlayın, pozlama süresini ayarlayın ve tarayıp döşemeleri tanımlayın.

Kutucukları ve gelişmiş denemeyi tıklatın ve tarayıp alanı tanımlayın. Ardından ekrandaki odağı ayarlayın ve denemeyi başlat'ı tıklatın. Denemenin sonunda, her kanal için TIF dosyalarını dışa aktarın ve özellikle dosyayı örnek, kaç kez, boyama ve alt kutucuk sayısını içerecek şekilde adlandırın.

Görüntü analizi için, Broad Institute web sitesinden görüntü analizi yazılımını açın ve dosyayı, dosyadan boru hattını tıklatın ve dört kanal CTC'yi analiz edin. Dosyaları dosya listesine bırakın ve dosyaları kutucuklara göre gruplandırmak için meta verileri güncelleştirin. Ardından, ölçüm yoğunluğu parametrelerine karşılık gelen elektronik tablo dosyasını açmak için görüntüleri analiz et'i tıklatın.

Optimize edilmiş dekontaminasyon protokolü olmadan, zenginleştirilmiş A549 hücre hatlarının doku kültürlerinde sadece 24 saat sonra yüksek bakteriyel kontaminasyon gözlenir ve ökaryotik hücrelerde ölüm ve sitomorfolojik değişikliklere neden olur. Buna karşılık, temizlik protokolünden sonra, doku kültürü ve orta kaldırma 10 saat sonra, 3D kültür koşulları altında, ve hasta örnekleri içinde 2D kültürlerde yaşayan A549 hücreleri elde edilir. Sitorspinli polilizin kaplı slaytlarda sıvı immünoresan boyama tahlilveya immünüfüloresan boyama tahlilleri kullanılarak, iki tahlil arasında numaralandırılmış çekirdek sayısında net bir ayrım görülebilir.

Sitospin adım olmadan, olmayan sitospin hücre preps bulanık anahatları nedeniyle, tümör hücrelerinden beyaz kan hücreleri ayırt etmek zordur. Burada farklı hasta örneklerinden farklı temsili bulgular görülebilir, özellikle beyaz kan hücrelerinin artık sayısı güçlü değişken olduğu tespit edilir ve tam kan örneğine bağlıdır. Elde edilen dolaşımdaki tümör hücrelerinde de yüksek değişkenlik gözlendi.

Situptaki her hücre görüntü analizi yazılımı tarafından tanımlanır ve hücrenin izlenmesini ve gerektiğinde sonuçları el ile onaylamasını sağlar. Nitekim, bir pilot analiz manuel numaralandırma ve görüntü analizi yazılımı numaralandırma arasında bir uyum gösterdi. Protein-antikor hibridizasyonu için kurum içi tasarlanmış nemli petri kabının kurulumu kritik öneme sahip, çünkü cihaz tüm kuluçka süresi boyunca yeterince nemli kalır.