Entegre hücre manipülasyon platformu tek süspansiyon hücrelerinde Ilaçların ve metabolitlerin Kütle Spektrometrisi analizi için tek prob ile birleştiğinde
21 Haziran 2019
Entegre hücre manipülasyon platformu, ortam koşullarında bireysel süspansiyon hücrelerinin on-line analizi için tek prob Kütle Spektrometrisi kurulumu ile birlikte kullanılmak üzere geliştirilmiştir.
Bu yöntem çözeltideki hücreleri analiz ettiği için, yakın yerel ortamdaki hücreleri incelemek için kullanılabilir. Bu hasta türetilmiş hücre örneklerinin analizini içerir. Bu teknik, hücrelerin çok az veya hiç örnek hazırlanması gerektirir.
Bu nedenle, biz bize hücresel heterojenlik keşfetmek için izin verir ortam koşulları altında online bireysel hücreleri analiz edebilirsiniz. Bu teknik, hasta örneklerinden doğrudan izole edilmiş farklı hücre türlerini analiz edebileceğinden, çeşitli hastalık durumlarından sıvı biyopsileri incelemek için uygulanabilir. Tek delikli cam boruyu keskin uçlu konik bir proba dönüştürmek için, ilk olarak tek bir delikli cam tüpü dikey pipet tutucunun kelepçelerine yerleştirin, camı ısıtma bobinine göre ortalayın ve tüpü yerinde sabitlemek için sıkın.
Isıtma bobini bir 18 gauge nikel krom direnç tel bir metal çubuk etrafında 2,5 kez kıvrılmış oluşur. Sıcaklık programı 19,5 ile cam boru ayarlayın. Solenoid pistonu saat dörtte ayarlayın.
Cam boruyu çekmek için solenoidi tetikle. Bu adım, uçta erimiş iki prob oluşturur. Her sondanın ucundan yaklaşık bir milimetre uzakta kesmek için kazak kullanın, sonda ucunda çapı yaklaşık 10 mikron bir delik oluşturma.
ICMP kolay bağlantı için cam prob bükmek için, tek prob SCMS kurmak. Önce mikroforge içine çekilmiş bir cam sonda sıcağa. Üstünü platin ısıtma kablosunun yaklaşık üç milimetre yukarısını yerleştirin.
Daha sonra platin telüzerindeki ısıyı maksimum sıcaklığın %30'una çevirin. Sondayı orijinal konumdan yaklaşık 45 derece bükün. Kütle spektrometresi ile kolay bağlantı için ters mikroskop mikroenjektörü motorlu bir masaya iki hücreli manipülasyon sistemine yerleştirin.
Cam hücre seçim cihazını kurmak için, uzun kaydırağı kılcal damar tutucuya yerleştirerek ve sondayı yerinde sabitlemek için vidayı sıkarak cam hücre seçim probunu mikroenjektörün metal tutucunun içine yerleştirin. Prob uçlarını ısıtmalı plakaya paralel olarak konumlandırın. Mikro enjektörün metal tutucuyu hücre manipülasyon sistemine sabitle.
Daha sonra sonda ucunu ters mikroskop ışığının ortasına yerleştirin. Hücre manipülasyon sisteminin kol kelepçesine tek sonda içeren cam kaydırağı sabitlayın. Kılcal damarı plastik ferrule'nin koluna yerleştirerek ve parmak montajı nı sıkarak kılcal damarı iletken bir birliğe bağlayın.
İletim birliğinin diğer tarafını, kapilleri kola yerleştirerek ve montajı sıkarak numune solventini içeren bir şırıngaya bağlanan bir kılcal damara bağlayın. Bu deneylerde örnekleme çözücü olarak %0,1 formik asit içeren asetonitril kullanın. Şırıngayı kütle spektrometresindeki şırınga pompasına sabitle.
Nanoelektrosprey iyonizasyonunu veya nano ESI yayımlayıcısını genişletilmiş iyon transfer tüpünün deifisesine yaklaşık bir milimetre yerleştirin. Tek probun aralıklı hareketlerini kontrol etmek ve nano ESI yayımlayıcısını genişletilmiş iyon transfer borusu önünde merkezi olarak konumlandırmak için hücre manipülasyon sistemini kullanın. Pipet hücre kültürü şişesinden hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüiçine.
Hücreleri 400 kez G'de 37 santigrat derecede beş dakika döndürün ve süpernatant'ı atın. İstenilen tedavi konsantrasyonunda ilaç bileşiği içeren RPMI orta dört mililitre hücreleri resuspend. Kütle spektrometresi için deneysel parametreleri özelleştirin.
Cihaz yazılımının tetkik modu başlığı altında, tetkik'i tanımla'yı seçin. Z 400 üzerinden M'de 60,000 çözünürlük, bir microscan 100 milisaniye maksimum enjeksiyon süresi ve otomatik kazanç kontrolü kullanın. Şırınga pompası altında, dakikada 150 nanolitre akış hızını seçin.
NSI kaynağını seçin ve yaklaşık 4,5 kilovoltluk bir voltaj uygulayın. Hem üst plaka hem de alt lens için seçilen 40 kat büyütmede ters mikroskobu açın. Canlı video akışlarını yakalamak için dizüstü bilgisayarın USB bağlantı noktasına bağlayın.
Isıtılan plakayı açın ve 37 santigrat dereceye ayarlayın. Bilgisayarda, elde edilen veri sekmesine gidin ve edinilen süre nin altında sürekli olarak seçin. Analiz için örnek hazırlamak için, pipet küçük bir petri kabın kapağına örnek iki ila üç.
Numuneyi ters mikroskobundan gelen ışığın ortasına ısıtılan plakanın üzerine yerleştirin. Analiz için cam hücre seçim sondasını hazırlayın. Sondayı hareket ettirmek için hücre manipülasyon sistemini kullanın, böylece üst kısmında hücrelerle aynı düzlemde ters mikroksope'nin altına odaklanın.
Hücre seçimi sondası ucunu analiz için hedeflenen bir hücreye taşımak için hücre işleme sistemini kullanın. Bu işlem ters mikroskop kullanılarak izlenir. Mikroenjektörün sapını yavaşça çevirerek mineral yağın tüpün içindeki konumunu ayarlayın.
Mikroenjektör tarafından, hedeflenen hücreyi hücre seçimi sondası ucuna sabitlemek için nazik bir emme sağlanır. Hücre seçimi sondaucundaki hücreyi tek sonda ucuna taşımak için hücre manipülasyon sistemini kullanarak bu işlemi izlemek için tek prob ucuna odaklanmış bir dijital mikroskop kullanın. Tedavi edilmeyen K-562 hücreleri deneysel yöntemi oluşturmak için kullanılır.
Tipik bir SCMS deneyinde, hücre içeriğinin algılanması sırasında ve ölçümü bitirdikten sonra hücre transferinden kütle spektrumlarında bariz değişiklikler gözlemlenebilir. PC 34:4, PC 36:4 ve PC 38:5 dahil olmak üzere üç yaygın hücresel lipid zirveleri hücre başarıyla transfer ve hücresel içeriği tespit emin olmak için izlenir. 750 ile 850 arasında değişen birçok bilgisayarda işlenmemiş hücre lisat örneklerinde MSMS kullanılarak doğrulanır.
ICMP tek probu MS kullanılarak, Gemcitabine, Taxol ve OSW1 K-562 hücreleri ile kuluçka sonrasında tespit edildi. Bu sonuçlar, bu yöntemin yakın bir yerli ortamda çözelti içinde hücrelerden tek hücre düzeyinde hücre içi lipidler, ilaçlar ve metabolitleri incelemek için kullanılabilir öneririz. Emmeyeterince uygulanabilir, böylece evrensel pipet tutucu içine güvenli bir şekilde cam hücre seçimi probu yerleştirmeyi unutmayın.
Bu yöntem aynı zamanda hücre metabolitleri arasındaki farklılıkları çeşitli hücre tiplerinden ayırt etmek için hasta kaynaklı örneklere de uygulanabilir, bu da bize bu hastalık durumlarını daha iyi anlamamızı sağlar. Bu yöntemi geliştirdikten sonra, potansiyel olarak tek hücre düzeyinde ilaç bileşiklerinin sayısallaştırılması uygulayabilir. Hücrelerle çalışırken, laboratuvar önlüğü ve eldivenler de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmana sahip olmak önemlidir.
Cam ile çalışırken ek göz aşınması kullanılabilir.
Genel Bakış
Bu makale, tek prob tek hücre kütle spektrometrisini (SCMS) bir hücre manipülasyon sistemiyle birleştiren ve yüzen bireysel hücrelerin doğrudan çözelti içerisinden hızlı ve hassas bir şekilde analiz edilmesini sağlayan entegre bir platform sunmaktadır. Bu yöntem, minimum örnek hazırlığına olanak tanır ve hücreleri doğal ortamlarına yakın bir durumda koruyarak hücresel heterojenliğin incelenmesini ve hücre içi metabolitlerin, lipidlerin ve ilaçların tek hücre düzeyinde tespit edilmesini kolaylaştırır. Bu yaklaşım, hasta kaynaklı örnekler için uygulanabilir olup hastalık biyolojisi ve kişiselleştirilmiş tıp alanındaki potansiyel uygulamaları desteklemektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Analitik Kimya
- Tek Hücre Analizi
- Kütle Spektrometrisi
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Geleneksel SCMS teknikleri immobilize edilmiş hücrelerle sınırlıydı ve bu durum analiz edilebilecek hücre türlerini kısıtlıyordu.
- Hücrelerin çözelti içinde analizi, hasta örneklerinden elde edilenler de dahil olmak üzere hücrelerin daha doğal durumlarının incelenmesine olanak tanır.
- Hücresel heterojenite, hastalık mekanizmalarının ve ilaç yanıtlarının anlaşılması açısından önemlidir.
- Örnek hazırlama sürecinin minimize edilmesi, potansiyel artefaktları azaltır ve hücresel bütünlüğü korur.
Çalışmanın Amacı
- Çözeltideki tekil yüzen hücrelerin SCMS analizi için bir platform geliştirmek.
- Hedefli hücre seçimi ve aktarımı için bir hücre manipülasyon sistemi entegre etmek.
- Hücresel bileşenlerin ortam koşulları altında hızlı ve çevrimiçi analizini sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Örnekleme ve hücre seçimi için konik cam probların üretimi.
- Hücre manipülasyon sisteminin (IVF'de kullanılanlara benzer) tek problu SCMS düzeneği ile entegrasyonu.
- Hassas hücre yakalama ve transferi için ters mikroskop ve mikroenjektör kullanımı.
- Nanoelektrospray iyonizasyon kullanılarak tekil hücrelerin çevrimiçi lizis ve kütle spektrometrisi analizi.
- Yöntemin K-562 hücrelerine uygulanması ve hücresel lipidlerin ile ilaç bileşiklerinin tespiti.
Temel Sonuçlar
- SCMS analizi için tekil yüzer hücrelerin başarılı şekilde yakalanması ve transferi.
- Etkili hücre lizini ve içerik analizini doğrulayan temel hücresel lipid piklerinin (örneğin, PC 34:4, PC 36:4, PC 38:5) saptanması.
- İşlem görmüş K-562 hücrelerinde, tek hücre düzeyinde ilaç bileşiklerinin (Gemcitabine, Taxol, OSW1) tanımlanması.
- Yöntemin, hasta kaynaklı örneklerden elde edilen hücreleri minimum hazırlıkla analiz edebildiğinin kanıtlanması.
Sonuçlar
- Entegre platform, çözeltideki tekil hücrelerin hassas ve hızlı SCMS analizine olanak tanır.
- Bu yaklaşım, hücresel heterojenliğin ve ilaç yanıtlarının doğal ortama yakın bir ortamda incelenmesini kolaylaştırır.
- Yöntem; hastalık biyolojisi, kişiselleştirilmiş tıp ve likit biyopsi analizi uygulamaları için gelecek vaat etmektedir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Tek problu kütle spektrometrisinin bir hücre manipülasyon platformuyla entegrasyonu, hasta türevli örneklerdeki tekil süspansiyon hücrelerinde ilaçların ve metabolitlerin doğrudan ve kantitatif analizini mümkün kılar. Bu yaklaşım, hücresel heterojenliğin ve ilaç yanıtının doğal ortama yakın bir çevrede incelenmesi zorluğunu aşarak, erken keşif ve translasyonel araştırmalarda öngörüsel güveni destekler. Platformun minimum numune hazırlığı gerektirmesi ve sıvı biyopsilerle uyumluluğu, hastalık biyolojisi ve kişiselleştirilmiş tıp alanlarındaki riskle uyumlu portföy kararları için onu değerli bir araç haline getirmektedir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Tek hücrelerdeki hücre içi ilaç ve metabolit seviyelerini nicelleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Hasta kaynaklı örneklerde hücresel heterojenliği ve fonksiyonel hedef etkileşimini ortaya çıkararak biyolojik risk azaltma sürecini destekler.
- Hastalıkla ilgili hücrelerden elde edilen doğrudan moleküler okumalar temelinde, hedeflerin önceliklendirilmesini ve öngörü güvenini kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Alt akış bileşik taramaları ve mekanistik çalışmalar için valide edilmiş tek hücreli sistemler hazırlar.
- Analiz standardizasyonu ve karşılaştırmalı değerlendirme için tekrarlanabilir, kantitatif kütle spektrometrisi çıktıları sağlar.
- İlaç alımı ve metabolizmasının tek hücre düzeyinde ölçeklenebilir, yüksek içerikli analizine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Vücut sıvılarından izole edilen hasta hücrelerinin analizine olanak tanıyarak translasyonel biyobelirteç stratejileriyle uyum sağlar.
- Sıvı biyopsi ve hastalık durumu profillemesini destekleyerek, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan süreçte süreklilik sağlar.
- Klinik olarak ilgili hücre popülasyonlarında ilaç etkisine dair doğrudan kanıtlar sunarak ilerleme kararlarındaki riskleri azaltır.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu platform, klinik örneklerden elde edilen tekil süspansiyon hücrelerinin doğrudan ve kantitatif analizine olanak tanıyarak erken keşif, öncü bileşik belirleme ve translasyonel araştırmalar arasında köprü kurar.
- Keşif Biyolojisi: Tek hücreli ilaç ve metabolit profilleme yoluyla hipotez testlerini ve yolakların netleştirilmesini destekler.
- Tarama: Heterojen hücre popülasyonlarında bileşik etkilerini değerlendirmek için analize hazır, tekrarlanabilir sistemler sağlar.
- Analitik: Farklı koşullar arasında karşılaştırmalı analiz için yüksek çözünürlüklü, kantitatif kütle spektrometrisi verileri sunar.
- Translasyonel Araştırma: Hasta türevli hücreler kullanarak keşif çıktılarını preklinik ve klinik biyobelirteç stratejilerine bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli hastalık modelleri ve örnek türleri için yeniden kullanılabilir bir analitik kapasite oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hücresel heterojeniteyi moleküler düzeyde çözerek öngörü güvenini ve hedef doğrulamasını artırır.
- Operasyonel Değer: Minimum numune hazırlığı ve sağlam, tekrarlanabilir çıktılarla iş akışlarını kolaylaştırır.
- Stratejik Değer: Klinik olarak ilgili numunelerden uygulanabilir veriler sağlayarak devam/durdur kararlarını ve sermaye verimliliğini iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Hasta kaynaklı hücrelerden elde edilen doğrudan kanıtlara dayanarak, riske göre ayarlanmış önceliklendirmeyi ve programların ilerletilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Tek hücre manipülasyonu, kütle spektrometrisi ve veri yorumlama konularında uzmanlık gerektirir.
- Mikroenjektörler, ters mikroskoplar ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometreleri dahil olmak üzere özel cihazlar gerektirir.
- Numune hazırlama ve analiz protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Çeşitli hücre tiplerine ve vücut sıvılarına uyarlanabilir, ancak spesifik hastalık modelleri için optimizasyon gerektirebilir.
- Pratik sınırlamalar arasında işlem kapasitesi ile hassas hücre seçimi ve transferi gerekliliği yer alır.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Glass Cell-Selection Probe Fabrication and Integrated Cell Manipulation Platform Assembly
2:32
Couple the ICMP with a Single-Probe Setup and Suspended Cell Sample Preparation
3:58
Perform SCMS Measurements Using the ICMP/Single-probe Setup
5:57
Results: Integrated Cell Manipulation Platform Testing of Single Suspension Cells
7:07
Conclusion
