Entegre hücre manipülasyon platformu tek süspansiyon hücrelerinde Ilaçların ve metabolitlerin Kütle Spektrometrisi analizi için tek prob ile birleştiğinde

Bu yöntem çözeltideki hücreleri analiz ettiği için, yakın yerel ortamdaki hücreleri incelemek için kullanılabilir. Bu hasta türetilmiş hücre örneklerinin analizini içerir. Bu teknik, hücrelerin çok az veya hiç örnek hazırlanması gerektirir.

Bu nedenle, biz bize hücresel heterojenlik keşfetmek için izin verir ortam koşulları altında online bireysel hücreleri analiz edebilirsiniz. Bu teknik, hasta örneklerinden doğrudan izole edilmiş farklı hücre türlerini analiz edebileceğinden, çeşitli hastalık durumlarından sıvı biyopsileri incelemek için uygulanabilir. Tek delikli cam boruyu keskin uçlu konik bir proba dönüştürmek için, ilk olarak tek bir delikli cam tüpü dikey pipet tutucunun kelepçelerine yerleştirin, camı ısıtma bobinine göre ortalayın ve tüpü yerinde sabitlemek için sıkın.

Isıtma bobini bir 18 gauge nikel krom direnç tel bir metal çubuk etrafında 2,5 kez kıvrılmış oluşur. Sıcaklık programı 19,5 ile cam boru ayarlayın. Solenoid pistonu saat dörtte ayarlayın.

Cam boruyu çekmek için solenoidi tetikle. Bu adım, uçta erimiş iki prob oluşturur. Her sondanın ucundan yaklaşık bir milimetre uzakta kesmek için kazak kullanın, sonda ucunda çapı yaklaşık 10 mikron bir delik oluşturma.

ICMP kolay bağlantı için cam prob bükmek için, tek prob SCMS kurmak. Önce mikroforge içine çekilmiş bir cam sonda sıcağa. Üstünü platin ısıtma kablosunun yaklaşık üç milimetre yukarısını yerleştirin.

Daha sonra platin telüzerindeki ısıyı maksimum sıcaklığın %30'una çevirin. Sondayı orijinal konumdan yaklaşık 45 derece bükün. Kütle spektrometresi ile kolay bağlantı için ters mikroskop mikroenjektörü motorlu bir masaya iki hücreli manipülasyon sistemine yerleştirin.

Cam hücre seçim cihazını kurmak için, uzun kaydırağı kılcal damar tutucuya yerleştirerek ve sondayı yerinde sabitlemek için vidayı sıkarak cam hücre seçim probunu mikroenjektörün metal tutucunun içine yerleştirin. Prob uçlarını ısıtmalı plakaya paralel olarak konumlandırın. Mikro enjektörün metal tutucuyu hücre manipülasyon sistemine sabitle.

Daha sonra sonda ucunu ters mikroskop ışığının ortasına yerleştirin. Hücre manipülasyon sisteminin kol kelepçesine tek sonda içeren cam kaydırağı sabitlayın. Kılcal damarı plastik ferrule'nin koluna yerleştirerek ve parmak montajı nı sıkarak kılcal damarı iletken bir birliğe bağlayın.

İletim birliğinin diğer tarafını, kapilleri kola yerleştirerek ve montajı sıkarak numune solventini içeren bir şırıngaya bağlanan bir kılcal damara bağlayın. Bu deneylerde örnekleme çözücü olarak %0,1 formik asit içeren asetonitril kullanın. Şırıngayı kütle spektrometresindeki şırınga pompasına sabitle.

Nanoelektrosprey iyonizasyonunu veya nano ESI yayımlayıcısını genişletilmiş iyon transfer tüpünün deifisesine yaklaşık bir milimetre yerleştirin. Tek probun aralıklı hareketlerini kontrol etmek ve nano ESI yayımlayıcısını genişletilmiş iyon transfer borusu önünde merkezi olarak konumlandırmak için hücre manipülasyon sistemini kullanın. Pipet hücre kültürü şişesinden hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüiçine.

Hücreleri 400 kez G'de 37 santigrat derecede beş dakika döndürün ve süpernatant'ı atın. İstenilen tedavi konsantrasyonunda ilaç bileşiği içeren RPMI orta dört mililitre hücreleri resuspend. Kütle spektrometresi için deneysel parametreleri özelleştirin.

Cihaz yazılımının tetkik modu başlığı altında, tetkik'i tanımla'yı seçin. Z 400 üzerinden M'de 60,000 çözünürlük, bir microscan 100 milisaniye maksimum enjeksiyon süresi ve otomatik kazanç kontrolü kullanın. Şırınga pompası altında, dakikada 150 nanolitre akış hızını seçin.

NSI kaynağını seçin ve yaklaşık 4,5 kilovoltluk bir voltaj uygulayın. Hem üst plaka hem de alt lens için seçilen 40 kat büyütmede ters mikroskobu açın. Canlı video akışlarını yakalamak için dizüstü bilgisayarın USB bağlantı noktasına bağlayın.

Isıtılan plakayı açın ve 37 santigrat dereceye ayarlayın. Bilgisayarda, elde edilen veri sekmesine gidin ve edinilen süre nin altında sürekli olarak seçin. Analiz için örnek hazırlamak için, pipet küçük bir petri kabın kapağına örnek iki ila üç.

Numuneyi ters mikroskobundan gelen ışığın ortasına ısıtılan plakanın üzerine yerleştirin. Analiz için cam hücre seçim sondasını hazırlayın. Sondayı hareket ettirmek için hücre manipülasyon sistemini kullanın, böylece üst kısmında hücrelerle aynı düzlemde ters mikroksope'nin altına odaklanın.

Hücre seçimi sondası ucunu analiz için hedeflenen bir hücreye taşımak için hücre işleme sistemini kullanın. Bu işlem ters mikroskop kullanılarak izlenir. Mikroenjektörün sapını yavaşça çevirerek mineral yağın tüpün içindeki konumunu ayarlayın.

Mikroenjektör tarafından, hedeflenen hücreyi hücre seçimi sondası ucuna sabitlemek için nazik bir emme sağlanır. Hücre seçimi sondaucundaki hücreyi tek sonda ucuna taşımak için hücre manipülasyon sistemini kullanarak bu işlemi izlemek için tek prob ucuna odaklanmış bir dijital mikroskop kullanın. Tedavi edilmeyen K-562 hücreleri deneysel yöntemi oluşturmak için kullanılır.

Tipik bir SCMS deneyinde, hücre içeriğinin algılanması sırasında ve ölçümü bitirdikten sonra hücre transferinden kütle spektrumlarında bariz değişiklikler gözlemlenebilir. PC 34:4, PC 36:4 ve PC 38:5 dahil olmak üzere üç yaygın hücresel lipid zirveleri hücre başarıyla transfer ve hücresel içeriği tespit emin olmak için izlenir. 750 ile 850 arasında değişen birçok bilgisayarda işlenmemiş hücre lisat örneklerinde MSMS kullanılarak doğrulanır.

ICMP tek probu MS kullanılarak, Gemcitabine, Taxol ve OSW1 K-562 hücreleri ile kuluçka sonrasında tespit edildi. Bu sonuçlar, bu yöntemin yakın bir yerli ortamda çözelti içinde hücrelerden tek hücre düzeyinde hücre içi lipidler, ilaçlar ve metabolitleri incelemek için kullanılabilir öneririz. Emmeyeterince uygulanabilir, böylece evrensel pipet tutucu içine güvenli bir şekilde cam hücre seçimi probu yerleştirmeyi unutmayın.

Bu yöntem aynı zamanda hücre metabolitleri arasındaki farklılıkları çeşitli hücre tiplerinden ayırt etmek için hasta kaynaklı örneklere de uygulanabilir, bu da bize bu hastalık durumlarını daha iyi anlamamızı sağlar. Bu yöntemi geliştirdikten sonra, potansiyel olarak tek hücre düzeyinde ilaç bileşiklerinin sayısallaştırılması uygulayabilir. Hücrelerle çalışırken, laboratuvar önlüğü ve eldivenler de dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmana sahip olmak önemlidir.

Cam ile çalışırken ek göz aşınması kullanılabilir.