Name: Insan kök hücresinde M hücre benzeri hücrelerin kaynaklı farklılaşma-türev ıleal Enteroid Monolayers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Öğrenin, insan kök hücre kaynaklı ileal monolayerlerde M hücrelerinin indüklenmiş farklılaşmasını ve gelişimlerinin değerlendirilmesi yöntemlerini. Bu protokol, bağırsak homeostazı ve bağışıklık savunması araştırmaları için güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Dr Isberg (Tufts Üniversitesi Tıp Fakültesi) ve Dr kaplan (Tufts Üniversitesi) NıAıD U19AI131126 tarafından desteklenmektedir; (JM proje 2 lideri) ve NıAıD R21AI128093 JM olduğunu. ACF kısmen NIAıD T32AI007077 tarafından destekleniyordu. SEB ve MKE NIAıD U19AI116497-05 tarafından destekleniyor. Mecsas laboratuvarının üyelerine, NG laboratuvarına ve Tufts Üniversitesi Tıp Fakültesi 'nde Dr. Isberg 'e yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. <span style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Calibri, sans-serif; color: black; background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">Konfoksel görüntüleme beyin bilimi araştırma Için Tufts merkezi 'nde yapıldı, P30 NS047243.

Burada açıklanan tüm yöntemler Tufts Üniversitesi ıBC ve ıRB tarafından onaylanmıştır.
1. Insan Ileal Enteroid türevi Monolayerlerin M hücre farklılaşma inducing
Not: Bu protokol insan dokusu biyopsisinden elde edilen ileal enteroidleri kullanır. Lütfen bu hücrelerin18,24' ün nasıl büyümesine ve geçişine ilişkin yöntemler için yayımlanan protokollere bakın. Monolayerlerin geliştirilmesi için aşağıdaki yöntemler Zou ve al.24' ten uyarlanmıştır. Ileal enteroid türev kültürlerde M hücrelerinin İndükleme yöntemleri önceki raporlardan21,22,23' e uyarlanmıştır. Tüm çalışmalar steril bir doku kültürü kaputu içinde gerçekleştirilir ve inküler gösterildiği gibi başlık veya doku kültürü kuluçte vardır. Ileal enteroid monolayers ve çeşitli Medias hazırlamak için gerekli malzeme tablosuna bakın.
<ol><li>4-10 gün boyunca ekstrasellüler matriks (ECM) (bkz. malzeme tablosu) (Şekil 1), iç büyüme oranlarına bağlı olarak, transwells üzerine tohumlama yapmadan önce ileal enteroidler büyütün.</li>
	<li>Kaplama transwell membranlar
	<ol>
<li>24 kuyu plakasında istenilen sayıda transwells yerleştirin ve iki oda sistemi oluşturma.</li>
		<li>Dilüt ECM 25-kat soğuk steril fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) ve eklemek 100 μL soğuk seyreltilmiş solüsyon her üst odaya membran üzerine. Not: ECM ve seyreltilmiş ECM çözeltisi, eklenmeden hemen önce buzda tutulmalıdır.</li>
		<li>24 kuyu plakasını kapak ile Kapla ve plakayı 37 °C ' de bir doku kültürü kuluçinörüne yerleştirin, membranda ECM katılaşma izni vermek için 2 h.</li>
		<li>2 saat sonra, plakayı kuluçsa ve bir doku kültürü kaputu yerleştirin. Steril Cımbız kullanarak, kalan çözümü yavaşça kaldırmak için her transwell 'i ters çevirin. Hücreler toplanırken membranların kapakta açık olarak hava kurutmasına izin verin (Steps 1.3.1-1.3.11).</li>
	</ol></li>
	<li>İleal enteroidlerin tek hücrelere dağılılması
	<ol><li>İleal enteroidlerin plakasını kuluçgandan çıkarın ve kültür medyasını vakum aspirasyonu veya pipet ile yavaşça çıkarın. Not: Yaklaşık 100 sağlıklı kistler içeren ileal enteroidlerin bir kuyusu 1,5-2 kuyuları tohum için yeterlidir.</li>
		<li>500 μL buz soğuk 0,5 mM etylenediaminetetraasetic asit (EDTA) eklemek ECM 'de askıya alınan her iyi ıleal enteroidleri içeren ECM kırmak için. ECM 'yi kırmak için 500 μL olarak ayarlanmış bir P1000 pipettör ile güçlü bir şekilde yukarı ve aşağı pipet yapın, böylece ileal enteroidleri çözüme bırakmaktır. ECM 'nin kesilmesi için, pipetleme işleminden sonra, plakası 4 °C ' de 30 dakika boyunca güçlü bir şekilde sallayın.</li>
		<li>Her iyi 15 mL konik borular içine çözüm toplayın. Not: Optimum tek hücreli toplama için 15 mL konik tüp başına 10 kuyuya kadar toplayın.</li>
		<li>140 x g ve 4 °c ' de 5 dk. Pelet için santrifüjdeki hücreleri Pelet görünür ama kolayca yerinden edilebilir, bu yüzden yavaşça vakum aspirasyon veya bir pipet ile süpernatant çıkarın. Not: Pelet ve hücrelerin kaybı hakkında endişe varsa, bir pipet kullanın ve ayrı bir tüp içinde süpernatant kaydedin.</li>
		<li>Sıkı kavşak bağlantıları sindirmek ve tek hücrelere ileal enteroidler kırmak için, 500 μL Oda sıcaklığı tripsin içinde Pelet yeniden pelletini adım 1.3.3 toplanan her 5 kuyular başına. Bir P1000 kullanarak, pipet yukarı ve aşağı kümeleri disaggregate ve 5 dk veya daha az için bir 37 °C su banyosunda tüpler inkübe. Not: Optimizasyonun, hücrelerin kırılması için gerekli süreyi belirlemek için gerekli olan zaman, onlar öleceği noktaya trypsinized değil. Hücre tripsin tedavi sonra uygulanabilir olduğundan emin olmak için adım 1.3.9 Trypan mavi kullanın.</li>
		<li>500 başına% 10 fetal Sığır serum (FBS) ile 1 mL gelişmiş DMEM/F12 ekleyin tripsin inaktive etmek için mg</li>
		<li>500 μL 'de bir P1000 seti ile yukarı ve aşağı pipet, konik tüpün yan tarafına karşı en az 50 kez, kalan kümeleri tek hücrelere daha fazla parçala.</li>
		<li>Bir 50 mL konik üzerinde bir 40 μm hücre süzgeci yerleştirin ve 1 mL gelişmiş DMEM/F12 ile 10% FBS hücre süzgeci ıslak ekleyin. Tek hücreli süspansiyonu 15 mL 'den süzgecin üzerine pipet yapın. % 10 FBS ile 1 mL gelişmiş DMEM/F12 ile süzgeci yıkayın.</li>
		<li>50 mL konik yeni bir 15 mL konik tüp içine hücre süzgeci geçti hücreleri aktarın. Santrifüjleme adımında 1.3.10, hücresel Pelet 15 ml konik tüpte daha kolay görülecektir. Bir hemokytometer kullanarak hücreleri saymak. Hücrelerin hala canlı olduğunu doğrulamak için tripan mavisi kullanın. Tipik olarak, >% 95 canlılığı gözlenmektedir.</li>
		<li>Hücreleri sayarken, yeni 15 mL tüpteki hücreleri Santrifüjüne 400 x g ve oda sıcaklığında 5 dk. hücre Pelet görünür olmalıdır. Dikkatlice bir pipet ile süpernatant kaldırmak, yine Pelet yerinden olur durumda süpernatant tasarruf.</li>
		<li>10 μM Y-27632 ile tamamlayıcı modifiye komple büyüme medya25 (mcmgf + medya) hazırlayın. 2,5 x 105 hücreli/200 ΜL 'de MCMGF + ' da pelletli hücreler resuspend. Hücre tohumlama numarasını en iyi duruma getirme hakkında tartışmada açıklamalar bakın. Not: MCMGF + medya gelişmiş DMEM/F12 ile 75% L-Wnt3a Klima medya,% 10 R-spondin Klima medya, 5% noggin Klima medya, 1x B27 takviyesi, 1x N2 Supplement, 1 mM N-asetilsistein, 50 ng/mL fare rekombinant EGF, 500 nM A-8301, 10 nM [Leu15]-gastrin ı, 10 mM HEPES, 2 mM GlutaMAX, ve 1x penisilin/streptomisin (opsiyonel).</li>
		<li>1,2 adımda hazırlanan ECM kaplı membranların göz tarafından değerlendirildiği şekilde tamamen kurutulduğundan emin olun. Üst odası 200 μL MCMGF + ile yıkayın. Her üst odaya 200 μL hücre çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Her alt odaya 10 μM Y-27632 ile 700 μL MCMGF + ekleyin. Plakayı 5% CO2Ile 37 °c ' lik doku kültürü küvatörün içine yerleştirin.</li>
		<li>Büyüme 1 gün sonra, üst odasından medya çıkarın ve 200 μL taze MCMGF + ile yerine, birden fazla hücre katmanlarının büyümesini önlemek için.</li>
	</ol></li>
	<li>Orta değiştirme
	<ol>
<li>Bir kez monolayers ~ 80% konfluent, genellikle gün 1-3 sonrası tohumlama arasında, kontrol kuyuları için farklılaşma medya (DM) ile bazolateral medya yerine (daha fazla ayrıntı için adım 1.4.2 bakın) veya m hücre indüksiyon kuyuları için m hücre medya (daha fazla ayrıntı için adım 1.4.3 bakın). Her iki koşul için üst odada bulunan medyayı DM ile değiştirin. Not: DM% 5 noggin Klima medya ile gelişmiş DMEM/F12 olduğunu, 1x B27 takviyesi, 1x N2 Supplement, 1 mM N-asetilsistein, 50 ng/mL fare rekombinant EGF, 500 nM A-8301, 10 nM [Leu15]-gastrin ı, 10 mM HEPES tampon, 2 mM GlutaMAX, ve 1x penisilin/streptomisin (opsiyonel ). M hücreli medya DM 200 ng/mL RANKL ve 50 ng/mL TNFα ile desteklenmektedir.</li>
		<li>M hücreleri içermeyen kontrol kuyuları için, üst odaya 200 μL DM ve alt odaya 700 μL DM ekleyin.</li>
		<li>M hücrelerini teşvik etmek için, üst odasına 200 μL DM ve alt odaya 700 μL M hücreli medya ekleyin.</li>
		<li>Medyayı her 2 günde bir değiştirin. Kontrol kuyuları için, üst ve alt odalarında DM değiştirin. M hücre kuyuları için, alt odasında üst oda ve M hücre medyasında DM değiştirin. Not: Gün 7 Post Cell-tohumlama, M hücreleri tam monolayers indüklenir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. qRT-PCR ile M hücresi farklılaşmasını doğrulama
Not: Steril bir RNAse-Free tezgah alanında aşağıdaki işi gerçekleştirin. QRT-PCR için tercih edilen malzemelerin listesi için malzeme tablosuna bakın.
<ol><li>Üst ve alt odalardan medyayı çıkarın ve 300 μL oda sıcaklığında PBS ile üst odası 2x hafifçe yıkayın.</li>
	<li>Her üst odaya 300 μL Trizol ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe. DIKKAT: üreticinin talimatında belirtildiği gibi cilt ile temas önlemek için Trizol kullanırken eldiven ve göz koruması kullanın.</li>
	<li>Bu arada, her iyi için mikrosantrifüjlü tüpler etiket ve her tüp için 700 μL Trizol ekleyin.</li>
	<li>Bir P1000 ile hafifçe yukarı ve aşağı 3x pipetleme ile hücre homojenliği toplayın ve ilgili mikrosantrifüj tüp içine içeriği aktarın. 5 s için Vortex karışımı.</li>
	<li>Örnekleri oda sıcaklığında ilave 3 dakika tutun. Sonra-80 °C ' ye kadar bir aya kadar saklayın.</li>
	<li>RNA yalıtımı, DNase tedavisi, Ters transkripsiyon ve qRT-PCR reaksiyonları için standart qRT-PCR metodolojisi takip edin. Malzeme tablosundaprimer listeye bakın.</li>
</ol>3. Immünofluorescence tarafından M hücresi farklılaşmasını doğrulama
Not: Membranlar ıslak kalması için plakanın alt odasını her zaman PBS ile dolu tutun. Bu prosedür Bench üzerinde gerçekleştirilir. İmmünofluorescence için tercih edilen malzemelerin listesi için malzeme tablosunu görün.
<ol><li>Üst odadan medyayı çıkarın ve 300 μL oda sıcaklığında PBS ile hafifçe 2x yıkayın. 100 μL Oda sıcaklığının 4% PFA cinsinden üst odasına ekleyin. Folyo ile plaka kapağı ve oda sıcaklığında 25 dakika stand izin. % 4 PFA kaldırın. Dikkat: % 4 PFA tehlikeli kimyasal atık olarak düzgün bir şekilde bertaraf edilmelidir.</li>
	<li>Üst odası 3x, 300 μL oda sıcaklığında PBS ile yıkayın. Bu noktada örnekler, boyama işleminden bir ay önce 4 °C ' de kalabilir. Bir kez lekelenmiş, örnekleri en iyi kalitede görüntüler için bir hafta içinde görselleştirilmelidir.</li>
	<li>Monolayerleri 100 μL,% 5 ' lik Sığır serum albumin (BSA) ile PBS 'de 30 dakika boyunca, oda sıcaklığında karanlık olarak çözülür.</li>
	<li>1:100 bir seyreltme PBS 1% BSA içinde GP2 primer antikor solüsyonu hazırlayın. Ekle 100 μL başına iyi. Karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat için leke. Çözümü kaldırın. Not: M hücrelerinin optimum birincil GP2 yüzey boyama geçirgen olmadan elde edilir çünkü GP2 için birincil leke önce monolayers geçirmez etmeyin.</li>
	<li>300 μL oda sıcaklığında PBS ile üst odası 3x kez yıkayın.</li>
	<li>1:200 de floresan etiketli keçi Anti-fare IgG ikincil leke solüsyonu hazırlayın, PBS 'de 1:100 ve DAPı 'de% 1 BSA + 0,1% Triton ' da khalloidin. Ekle 100 μL başına iyi. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika leke. Not: Triton, uygun phalloidin lekesi için bu adımda hücreleri nüfuz etmek için ikincil leke çözüme eklenir.</li>
	<li>300 μL PBS ile 3 kat yıkayın.</li>
	<li>Cam kaydırağa 5 μL damla montaj çözeltisi (malzeme tablosu) yerleştirin. 24 kuyu plakasını ve tersine çevirme iyi çıkarın. Dikkatle bir neşter kullanarak kuyunda membran kesti. Membranı, cam slayttaki montaj çözeltisinin damlacığına dönük hücrelerle yerleştirin. Membranın üst ve ortasına 10 μL montaj çözeltisi ekleyin ve cam kaydırağı ile lamel magazini arasındaki membranı mühürlemek için üstüne bir lamel magazini yerleştirin.</li>
	<li>24 saat boyunca karanlıkta oda sıcaklığında slaytları kurutun. 1 hafta sonrası boyama içinde Konfokal mikroskop üzerinde lekeli slaytlar görüntülenmesi gerekir.</li>
</ol>

<ol><li>Kraehenbuhl, J. P., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+M+cells%3A+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial M cells: differentiation and function.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 301-332 (2000).</li>
<li>Neutra, M. R., Frey, A., Kraehenbuhl, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+M+cells%3A+gateways+for+mucosal+infection+and+immunization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial M cells: gateways for mucosal infection and immunization.</a> Cell. 86 (3), 345-348 (1996).</li>
<li>Nakamura, Y., Kimura, S., Hase, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell-dependent+antigen+uptake+on+follicle-associated+epithelium+for+mucosal+immune+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">cell-dependent antigen uptake on follicle-associated epithelium for mucosal immune surveillance.</a> Inflammation and Regeneration. 38, 15(2018).</li>
<li>Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-cell+surface+beta1+integrin+expression+and+invasin-mediated+targeting+of+Yersinia+pseudotuberculosis+to+mouse+Peyer%27s+patch+M+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer's patch M cells.</a> Infection and Immunity. 66 (3), 1237-1243 (1998).</li>
<li>Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+the+invasive+pathogens+Salmonella+typhimurium%2C+Listeria+monocytogenes%2C+and+Shigella+flexneri+with+M+cells+and+murine+Peyer%27s+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer's patches.</a> Infection and Immunity. 66 (8), 3758-3766 (1998).</li>
<li>Jones, B. D., Ghori, N., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+initiates+murine+infection+by+penetrating+and+destroying+the+specialized+epithelial+M+cells+of+the+Peyer%27s+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium initiates murine infection by penetrating and destroying the specialized epithelial M cells of the Peyer's patches.</a> Journal of Experimental Medicine. 180 (1), 15-23 (1994).</li>
<li>Marra, A., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasin-dependent+and+invasin-independent+pathways+for+translocation+of+Yersinia+pseudotuberculosis+across+the+Peyer%27s+patch+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Invasin-dependent and invasin-independent pathways for translocation of Yersinia pseudotuberculosis across the Peyer's patch intestinal epithelium.</a> Infection and Immunity. 65 (8), 3412-3421 (1997).</li>
<li>Ohno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+M+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intestinal M cells.</a> Journal of Biochemistry. 159 (2), 151-160 (2016).</li>
<li>Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+by+Peyer%27s+patch+lymphocytes+of+human+enterocytes+into+M+cells+that+transport+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria.</a> Science. 277 (5328), 949-952 (1997).</li>
<li>Gullberg, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+specific+markers+and+particle+transport+in+a+new+human+intestinal+M-cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Expression of specific markers and particle transport in a new human intestinal M-cell model.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 279 (3), 808-813 (2000).</li>
<li>Giannasca, P. J., Giannasca, K. T., Leichtner, A. M., Neutra, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+M+cells+display+the+sialyl+Lewis+A+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Human intestinal M cells display the sialyl Lewis A antigen.</a> Infection and Immunity. 67 (2), 946-953 (1999).</li>
<li>Jang, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+villous+M+cells%3A+an+antigen+entry+site+in+the+mucosal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Intestinal villous M cells: an antigen entry site in the mucosal epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6110-6115 (2004).</li>
<li>Beloqui, A., Brayden, D. J., Artursson, P., Preat, V., des Rieux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+intestinal+M-cell-like+model+for+investigating+particle%2C+antigen+and+microorganism+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A human intestinal M-cell-like model for investigating particle, antigen and microorganism translocation.</a> Nature Protocols. 12 (7), 1387-1399 (2017).</li>
<li>Martinez-Argudo, I., Jepson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+translocates+across+an+in+vitro+M+cell+model+independently+of+SPI-1+and+SPI-2%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Salmonella translocates across an in vitro M cell model independently of SPI-1 and SPI-2.</a> Microbiology. 154 (Pt 12), 3887-3894 (2008).</li>
<li>Lee, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+lab-to-lab+variability+in+Caco-2+permeability+assays%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of lab-to-lab variability in Caco-2 permeability assays.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 114, 38-42 (2017).</li>
<li>Mabbott, N. A., Donaldson, D. S., Ohno, H., Williams, I. R., Mahajan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfold+%28M%29+cells%3A+important+immunosurveillance+posts+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microfold (M) cells: important immunosurveillance posts in the intestinal epithelium.</a> Mucosal Immunology. 6 (4), 666-677 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Knoop, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANKL+is+necessary+and+sufficient+to+initiate+development+of+antigen-sampling+M+cells+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">RANKL is necessary and sufficient to initiate development of antigen-sampling M cells in the intestinal epithelium.</a> Journal of Immunology. 183 (9), 5738-5747 (2009).</li>
<li>Taylor, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin-independent+expression+of+TNF-related+activation-induced+cytokine+by+stromal+cells+in+cryptopatches%2C+isolated+lymphoid+follicles%2C+and+Peyer%27s+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin-independent expression of TNF-related activation-induced cytokine by stromal cells in cryptopatches, isolated lymphoid follicles, and Peyer's patches.</a> Journal of Immunology. 178 (9), 5659-5667 (2007).</li>
<li>de Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peyer%27s+patch+M+cells+derived+from+Lgr5%28%2B%29+stem+cells+require+SpiB+and+are+induced+by+RankL+in+cultured+%26%2334%3Bminiguts%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Peyer's patch M cells derived from Lgr5(+) stem cells require SpiB and are induced by RankL in cultured &#34;miniguts&#34;.</a> Molecular and Cellular Biology. 32 (18), 3639-3647 (2012).</li>
<li>Rouch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Functional+Microfold+%28M%29+Cells+from+Intestinal+Stem+Cells+in+Primary+Human+Enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of Functional Microfold (M) Cells from Intestinal Stem Cells in Primary Human Enteroids.</a> PloS One. 11 (1), e0148216(2016).</li>
<li>Wood, M. B., Rios, D., Williams, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+augments+RANKL-dependent+intestinal+M+cell+differentiation+in+enteroid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha augments RANKL-dependent intestinal M cell differentiation in enteroid cultures.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 311 (3), C498-C507 (2016).</li>
<li>Zou, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Intestinal+Enteroids%3A+New+Models+to+Study+Gastrointestinal+Virus+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Human Intestinal Enteroids: New Models to Study Gastrointestinal Virus Infections.</a> Methods in Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>Kozuka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Characterization+of+a+Human+and+Mouse+Intestinal+Epithelial+Cell+Monolayer+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Development and Characterization of a Human and Mouse Intestinal Epithelial Cell Monolayer Platform.</a> Stem Cell Reports. 9 (6), 1976-1990 (2017).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).</li>
<li>Mantis, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+adherence+of+IgA+to+murine+Peyer%27s+patch+M+cells%3A+evidence+for+a+novel+IgA+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Selective adherence of IgA to murine Peyer's patch M cells: evidence for a novel IgA receptor.</a> Journal of Immunology. 169 (4), 1844-1851 (2002).</li>
<li>Rios, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+sampling+by+intestinal+M+cells+is+the+principal+pathway+initiating+mucosal+IgA+production+to+commensal+enteric+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen sampling by intestinal M cells is the principal pathway initiating mucosal IgA production to commensal enteric bacteria.</a> Mucosal Immunology. 9 (4), 907-916 (2016).</li>
<li>Miller, H., Zhang, J., Kuolee, R., Patel, G. B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+M+cells%3A+the+fallible+sentinels%3F%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal M cells: the fallible sentinels?</a> World Journal of Gastroenterology. 13 (10), 1477-1486 (2007).</li>
<li>Heijmans, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+causes+rapid+loss+of+intestinal+epithelial+stemness+through+activation+of+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response.</a> Cell Reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Önemli bağırsak hücresi türlerine ve M hücrelerine doğru ayırt eden monolayers geliştirmek için, çeşitli faktörlerin farkında olmak önemlidir. Ileal enteroidler, ayırt edilemez olan ECM kültürlerinden hasat edilmelidir ve yüksek Lgr5 + kök hücrelerine sahiptir. Görsel olarak, ECM kültürlerinde ileal enteroidlerin çoğunluğu karanlık ve multilobular olmamalıdır ve bu kültürlerde QRT-PCR analizi ile LGR5 ifadesi tespit edilmelidir. Nitelikli medyanın kalite kontrolü, farklılaşmaz kültürlerin zamanla yayılması için gereklidir ve üretilen her bir toplu ortam için tamamlanmalıdır. Bazı ECM kültürlerinde yeni bir medya grubu test ederek ve ileal enteroidlerin morfolojisini bir hafta boyunca önceki bir medya grubu ile karşılaştırarak kalite kontrolü tamamlanabilir. LGR5 ifade, önceki toplu iş ile karşılaştırıldığında medyanın yeni toplu içinde yetiştirilen ileal enteroid kültürlerde nispeten benzer kalmalı.
Monolayers olarak tohumlama için ileal enteroidlerin hazırlanması sırasında, tek hücrelere ileal enteroidleri kırmak için tripsin ile inkübasyon sonrası hücre çözeltisi şiddetle pipet önemlidir. Hücre kümeleri, monolayers için seribaşı çok katmanlı oluşumuna yol açabilir. Buna ek olarak, elde edilen her bireysel ileal enteroid hattı için bir tek tabakalı oluşturmak için gereken hücre sayısını ampirik olarak belirlemek esastır. Tipik olarak, bu değer 2,5 x 105 – 5,0 x 105 hücreli/kuyu arasında değişebilir, ancak kültürlerde kistik olmayan ileal enteroidlere kistik derecesine bağlıdır ve her bir ileal enteroid hattı için değişir. Deneyimlerden daha az kistik görünen ECM 'de yetiştirilen ileal enteroidler, monolayerlere ulaşmak için daha yüksek hücre tohumlama yoğunluğu gerektirir. Yavaşça yukarı ve aşağı 2-3 kez medya pipetleme ve taze büyüme medya ile yerine tarafından büyüme 1 gün sonra üst odası yıkamak için tavsiye edilir. Bu işlem, çok katmanlı oluşumu olasılığını azaltan diğer hücrelerin üstüne indi hücreleri dislodges. Monolayerler ~ 80% confluent, genellikle 2 sonrası tohumlama oluşur, iyi M hücre farklılaşma elde yardımcı olur zaman büyüme medyadan M hücre ortamına üst odasında medya geçiş. M hücresi indüksiyon sırasında üst odasına rankl/TNFα ilavesi Tek tabakalı başına m hücrelerinin daha fazla sayıda gelişimine yol açmaz ve bu nedenle üst oda medyadan bırakılabilirler. Bu protokolde M hücresi gelişimini etkilemeden farklı Gözenek boyutlarının transwells kullanılabilir; Ancak, hücre tohumlama yoğunluğu daha büyük gözenek boyutları olanlar için optimize edilmelidir. Kollajen IV, belirli uygulamalar için daha uygun olabilir transwells veya iyi plakalar için bir Bodrum membran protein kaplama olarak ECM yerine olabilir.
Ileal enteroid türevi monolayers transkuyu üzerinde tanımlanan apikal ve bazolateral yüzeylerin oluşturulması için izin veren bir iki oda sistemi sağlar, 4-5 farklı türde epitelyal bağırsak hücrelerinin her biri üzerinde yüzey işaretçileri ifade polarize olabilir bağırsak içinde bulunan göreli yan. Parçacıklar, bulaşıcı ajanlar veya diğer hücre tipleri gibi her iki tarafa da ek faktörler eklenebilir. Ancak, bazı sınırlamalar bugüne kadar kalır. Açıklandığı gibi, bu sistem fizyolojik akış, bağırsak kasılmaları ve bağırsak içerikleri bulunmayan statik bir sistemdir. Ayrıca, villus-Crypt mimarisi düz bir monolayer oluşumu ile kaybolur. Bu sistemler Peyer 'ın yama bölgelerinin, bağışıklık hücrelerinin ve stromal hücrelerinden yoksun. M hücrelerinin altında yakın ikamet eden bağışıklık ve stromal hücrelerin eksikliği, bu sistemde gözlemlenmez invaginasyonlar etkiler ve diğer fizyolojik işleyişi araştırma önemli bir gelecek alanıdır. Bu protokol 96-kuyu plakasına veya çok iyi plaka biçimine adapte edilebilir. 96-kuyu plakasını ECM ile kaplamanın ve ileal enteroidlerden tek hücrelerle tohumlama prosedürü, transwells ile aynı kalır. Monolayers elde etmek için gerekli hücre tohumlama yoğunluğu titrasyon yapılmalıdır, ancak genellikle 1,0 x 105 – 3,0 x 105 hücreler/iyi bir 96-iyi plaka formatında değişmektedir. M hücreleri, monolayers% 80 confluent genellikle gün 1-3 ilk hücre tohumlama yoğunluğu bağlı olarak M hücre medya ile büyüme medya değiştirerek indüklenir.
M hücrelerini ileal enteroidler içinde vitro olarak ayıran bu yöntem, Caco-2 yöntemi üzerinde önemli geliştirmeler sağlar. İleal enteroidler primer hücrelerdir ve sistemde en az 4-5 epitelyal hücre çeşidi bulunmaktadır. Ayrıca, farklı insanlardan elde edilen ileal enteroid çizgiler, genetik veya hastalık durumunun M hücresi gelişimini ve davranışlarını nasıl etkilediğini araştırmak için incelenebilir. M hücre farklılaşma sırasında ileal enteroidlerin ek manipülasyon m hücre öncüsü hücreleri karakterize dahil olmak üzere M hücre gelişimi daha iyi bir anlayış sağlayacaktır. Son olarak, m hücreli phagositoz ve transytosis molekül mekanizmaları hala tamamen anlaşılır değildir bu yana3,29, bu model çalışma ve M hücreleri tarafından antijen ve parçacık alımı görselleştirmek için fırsat sağlar.

M (Mikrokat) hücreler, öncelikle folikül ilişkili epitelyum (FAE) küçük lenfoid bölgelerde bağırsaktaki Peyer 'ın yamalar1olarak adlandırılan bulunan özel bağırsak epiteli hücreler vardır. M hücreleri kısa düzensiz apikal mikrovilluslar var ve derin kendi bazolateral tarafında epitelinde, hangi bağışıklık hücrelerinin kendi hücre gövdesine yakından ikamet sağlar2. Bu benzersiz morfoloji, M hücrelerinin bağırsak apikal lümeninden antijen örneklenmesi ve doğrudan altta yatan bağışıklık hücrelerine teslim edilmesini sağlar2. Bu şekilde, M hücreleri bağırsak bağışıklık gözetimi için önemlidir ama ayrıca lamina propria giriş için patojenler tarafından istismar edilebilir1,2,3,4,5, 6,7.
M hücrelerinin çalışma çeşitli faktörler tarafından engellenmiştir. İlk olarak, M hücreleri fare ve insan bağırsak8düşük frekanslı bulunur. Kültürlü hücreler sistemlerinde, M hücre benzeri hücreler, fare Peyer yamaları veya b hücreli lenfoma hücre çizgisinin b lenfositleri ile birlikte bir polarize adenokarsinom hücre hattı, Caco-2, Co-kültürü ile ayırt etmek için indüklenen edilmiştir, k. b9,10 . Bu, M hücre işaretleyicilerini ifade eden caco-2 hücrelerinin bir alt kümesini oluşturmaktadır, polarize epitelyum içinde bir antijen ve UEA-1,9,10. (Bu işaretçileri de bağırsak dokularında kadeh hücrelerinde ifade edilir, bu nedenle günümüzde daha az sıklıkla kesin M hücre işaretçileri olarak kullanılır11,12.) Bu caco-2-M hücre sistemi partikül alımı ve bakteri translokasyon incelemek için kullanılmıştır13,14. Ancak, Caco-2 hücreleri, Caco-2 hücrelerinin farklı kaynaklarının Labs15' in farklı fenotürlerini görüntüleyecek olan, büyük bir bağırsak adenokarsinomunun kurulan bir hücre çizgidir. Ayrıca, onlar şu anda bilinen m hücre işaretçileri GP2 ve spıb16ifadesi eksikliği olarak, tam olarak gerçek m hücrelerinin transkripsiyon düzeylerini özetlemek olmayabilir. Bu nedenle, M hücresi geliştirme ve fonksiyonlarını incelemek için ek ve daha fizyolojik olarak ilgili kültür modelleri gereklidir.
Son on yıl içinde, bağırsaktaki enteroid-türev model sistemlerinin alanı, insan bağırsak biyopsisinden elde edilen bağırsak kök hücrelerinin kültürde kendini yayabilir ve kendi kendine yenileyebildiği ilk keşfinden hızla ileri ilerliyor 17 , 18. önemlisi, büyüme medyadan faktörler teşvik kök hücresi kaldırılması bu kök hücre kültürleri bağırsak18bulunan birçok hücre türlerine ayırt etmek için izin verir. Ayrıca, son çalışmalar bağırsak içinde M hücre gelişimi rankl-Rank sinyalizasyon önemini göstermektedir19,20. Rank reseptörü, bağırsaktaki epitelyal habercisi hücrelerinin üzerine ifade edilen reseptörlerin TNF ailesinin bir üyesidir19 iken rankl (rank reseptör ligand) Peyer 's yamalar stromal hücreler tarafından serbest bırakılır20. İleal enteroidlerde bulunan epitelyal hücre türleri rankl üretemez, ileal enteroid kültürlerde M hücre farklılaşma rankl kültür medyası21,22ilavesi ile indüklenen olabilir. TNFα 'nın kültür ortamına eklenmesi, ileal enteroids23' te M hücresi gelişimini desteklemeye yardımcı olur. Burada, insan ileal enteroidlerden elde edilen bağırsak monolayerlerinde M hücrelerinin farklılaşmasını tetikleyen yöntemler açıklanmaktadır. Yöntemlerimiz aşağıdaki protokoller21,22,23değişiklikleri kısmen dayanır.

<table><tbody><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td>MCMGF + ve DM bileşeni Çözücü: PBS Stok Konsantrasyonu: 10 &mikro; M Nihai Konsantrasyon: 10 nM</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>ECM Çözücüyü parçalamak için: PBS Stok Konsantrasyonu: 0,5 M Nihai Konsantrasyon: 0,5 mM</td></tr><tr><td>40 &mikro; m hücre süzgeci</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>Tek hücrelerden topakları hariç tutmak için Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Nihai Konsantrasyon:</td></tr> <tr><td>A-8301</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0788-5MG</td><td>MCMGF + ve DM bileşeni Çözücü: DMSO Stok Konsantrasyonu: 500 &mikro; M Nihai Konsantrasyon: 500 nM</td></tr><tr><td>Gelişmiş DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td>MCMGF+ ve DM Bazal ortam Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Son Konsantrasyon:</td></tr> <tr><td>Alexa Fluor 594 keçi anti-fare IgG Thermo</td><td>Fisher</td><td>A-11005</td><td>İkincil leke için Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Son Konsantrasyon: 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22287</td><td>F-aktin için isteğe bağlı ikincil leke Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Son Konsantrasyon: 1:100</td></tr><tr><td>B27 Takviyesi</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>MCMGF + ve DM bileşeni Çözücü: Stok Konsantrasyonu: 50x Son Konsantrasyon: 1x</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Chem-Impex</td><td>00535</td><td>Blokaj çözeltisi için% 5 Çözücü: PBS Stok Konsantrasyonu: Son Konsantrasyon: 0.01</td></tr><tr>RNA izolasyonu için<td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C298-500</td><td> Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Son Konsantrasyon:</td></tr> <tr><td>Daire lameller</td><td>Thomas Scientific</td><td>1157B50</td><td>Membranı cam slayt üzerine monte etmek için Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Nihai Konsantrasyon:</td></tr> <tr><td>DAPI (4 & prime ;, 6-diamidino-2-fenilindol)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>62247</td><td>İkincil boyama için Çözücü: PBS Stok Konsantrasyonu: 100x Nihai Konsantrasyon: 1x</td></tr><tr><td>DEPC ile Tedavi Edilmiş RNAse içermez H 2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP561-1</td><td>RNA izolasyonu için Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Nihai Konsantrasyon:</td></tr> <tr><td>DNA Çıkarma Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>AM1906</td><td>RNA izolasyonu için Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Nihai Konsantrasyon</td></tr><tr><td>: Etil Alkol, 200 kanıt</td> RNA izolasyonu için <td>Sigma Aldrich</td><td>EX0276-4</td><td> Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Nihai Konsantrasyon:</td></tr> <tr><td>Tüy Neşterler</td><td>VWR</td><td>100499-580</td><td>Transwells membran kesmek için Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Son Konsantrasyon:</td></tr> <tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Gibco</td><td>26140079</td><td>Tripsin Çözücüyü inaktive etmek için: Gelişmiş DMEM / F12 Stok Konsantrasyonu: 1 Son Konsantrasyon: 0.1</td></tr><tr><td>Cam slaytlar</td><td>Mercedes Scientific</td><td>MER 7200/90/WH</td><td>Cam slayt üzerine membran montajı için Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Nihai Konsantrasyon:</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>MCMGF+ ve DM içerik Çözücü: Stok Konsantrasyonu: 200 mM Nihai Konsantrasyon: 2 mM</td></tr><tr><td>GP2 Antikoru</td><td>MBL Uluslararası</td><td>D277-3</td><td>M hücreleri için yüzey lekesi Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Son Konsantrasyon: 1:100</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>MCMGF+ ve DM bileşeni Çözücü: Stok Konsantrasyonu: 1 M Nihai Konsantrasyon: 10 mM</td></tr><tr><td>İnsan Serumu IgA</td><td>Lee BioSolutions</td><td>340-12-1</td><td>M hücrelerinin fonksiyonel analizi için Çözücü: PBS Stok Konsantrasyonu: 1 mg/mL Nihai Konsantrasyon: 10 & g</td></tr><tr><td>L-Wnt3a klimalı ortam</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647'den</td> hücre hattı <td>L Wnt&sh için ATCC Ürün Sayfasına bakın; Koşullu ortam protokolü için 3A (ATCC CRL2647); MCMGF+ bileşen Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Nihai Konsantrasyon: MCMGF+ içinde %75 DM</td></tr><tr><td>Matrigel, GFR, fenol içermez</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Hücre Dışı Matris (ECM) Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Nihai Konsantrasyon:</td></tr> <tr><td>Fare rekombinant EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8043</td><td>MCMGF + ve DM bileşeni Çözücü: PBS Stok Konsantrasyonu: 50 &mikro; g / mL Nihai Konsantrasyon: 50 ng / mL</td></tr><tr><td>N2 Takviyesi</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>MCMGF + ve DM bileşeni Çözücü: Stok Konsantrasyonu: 100x Nihai Konsantrasyon: 1x</td></tr><tr><td>N-asetilsistein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>MCMGF + ve DM bileşeni Çözücü: H < alt > 2 O Stok Konsantrasyonu: 500 mM Nihai Konsantrasyon: 1 mM</td></tr><tr><td>Noggin koşullu ortam</td><td>Dr. Gijs van den Brink'ten (Amsterdam Üniversitesi) hücre hattı hediyesi,</td><td></td> <td>koşullu ortam protokolü için Ref 30; MCMGF+ ve DM Bileşen Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Nihai Konsantrasyon: MCMGF+ içinde %5 DM</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td><td>MP Biyomedikal</td><td>2199983</td><td>Tek katmanları sabitlemek için Çözücü: PBS Stok Konsantrasyonu: 0.16 Nihai Konsantrasyon: 0.04</td></tr><tr><td>PBS, -Mg, -Ca</td><td>Corning MT21040CV</td><td></td><td>0,5 mM EDTA için çözücü Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Son Konsantrasyon:</td></tr> <tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>MCMGF + ve DM isteğe bağlı bileşen Çözücü: Stok Konsantrasyonu: 100x Son Konsantrasyon: 1x</td></tr><tr><td>Altın</td><td>Canlandırıcı</td><td>P36930'u</td> <td>UzatınAntifade montaj çözeltisi Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Nihai Konsantrasyon:</td></tr> <tr><td>Qiagen RNeasy Kiti</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>RNA izolasyonu için Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Nihai Konsantrasyon:</td></tr> <tr><td>Rekombinant insan RANKL</td><td>Peprotech</td><td>310-01</td><td>M hücrelerini indüklemek için kullanılır Çözücü: H < alt > 2 O Stok Konsantrasyonu: 0.1 mg / mL Son Konsantrasyon: 200 ng / mL</td></tr><tr><td>Rekombinant murin TNFa</td><td>Peprotech</td><td>315-01A</td><td>M hücrelerini indüklemek için kullanılır Çözücü: H < alt > 2 O Stok Konsantrasyonu: 5 mg / mL Nihai Konsantrasyon: 50 ng / mL</td></tr><tr><td>R-spondin şartlandırılmış ortam</td><td>Trevigen</td><td>3710-001-01'den</td> hücre hattı <td>Trevigen Cultrex Rspo1 Hücreleri ürün kılavuzuna bakın (HA-R-Spondin1 293T hücre hattı) koşullu ortam protokolü için; MCMGF+ Bileşen Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Nihai Konsantrasyon: MCMGF+ 'da %10 DM'de %0</td></tr><tr><td>İkincil anti-insan IgA antikoru</td><td>Jackson İmmüno Araştırmaları</td><td>109-545-011</td><td>İkincil boya Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Son Konsantrasyon: 1:200</td></tr><tr><td>Süper Senaryo IV Ters Transkriptaz</td><td>Thermo Fisher</td><td>18091200</td><td>RNA'nın DNA Çözücüye dönüştürülmesi için: Stok Konsantrasyonu: Nihai Konsantrasyon:</td></tr> <tr><td>Transwell ekleri, 24 iyi boyutlu</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td>662641 0.4 ve mikro; M Gözenek Boyutu Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Son Konsantrasyon:</td></tr> <tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>GP2 birincil boyama sırasında gerekli değildir Çözücü: %1 BSA Stok Konsantrasyonu: Nihai Konsantrasyon: 0.001</td></tr><tr>RNA izolasyonu için<td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td> Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Nihai Konsantrasyon:</td></tr> <tr>Enteroidleri tek hücrelere ayırmak için <td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605010</td><td>Tripsin Çözücü: Stok Konsantrasyonu: Nihai Konsantrasyon:</td></tr> <tr><td>Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y-0503</td><td>MCMGF + bileşeni 0 Çözücü: H2O Stok Konsantrasyonu: 5 mM Nihai Konsantrasyon: 10 & mikro; M</td></tr><tr><td>GAPDH ön astar</td><td></td><td></td><td>CATGAGAAGTATGAACAACAGCCT</td></tr><tr><td>GAPDH ters astar</td><td></td><td></td><td>AGTCCTTCCACGATACCAAAGT</td></tr><tr><td>GP2 ileri astar</td><td></td><td></td><td>CAATGTGCCTACCCACTGGA</td></tr><tr><td>GP2 ters astar</td><td></td><td></td><td>ATGGCACCCACATACAGCAC</td></tr><tr><td>LYZ ön astar</td><td></td><td></td><td>CGCTACTGGTGTAATGATGG</td></tr><tr><td>LYZ ters astar</td><td></td><td></td><td>TTTGCACAAGCTACAGCATC</td></tr><tr><td>MUC2 ileri astar</td><td></td><td></td><td>ATGCCCTTGCGTCCATAACA</td></tr><tr><td>MUC2 ters astar</td><td></td><td></td><td>AGGAGCAGTCCGTCAAAG</td></tr><tr><td>SI ileri astar</td><td></td><td></td><td>TCCAGCTACTACTCGTGTGAC</td></tr><tr><td>SI ters astar</td><td></td><td></td><td>CCCTCTGTTGGGAATTGTTCTG</td></tr><tr><td>SPIB ileri astar</td><td></td><td></td><td>CAGCAGCCGCTTTTAGCCAC</td></tr><tr><td>SPIB ters astar</td><td></td><td></td><td>GCATATGCCGGGGGAACC</td></tr><tr><td>LGR5 ileri astar</td><td></td><td></td><td>TCAGTCAGCTGCTCCCGAAT</td></tr><tr><td>LGR5 ters astar</td><td></td><td></td><td>CGTTTCCCGCAAGACGTAAC</td></tr></tbody></table>

insan kök hücresinde m hücre benzeri hücrelerin kaynaklı farklılaşma-türev ıleal enteroid monolayers

Induced Differentiation of M Cell-like Cells in Human Stem Cell-derived Ileal Enteroid Monolayers

Bağırsak fonksiyonunun M (Mikrokat) hücreleri, apikal lümeninden antijen taşıması için, bağışıklık hücrelerinin ikamet ettikleri ve bu nedenle bağırsak içinde mukozal bağışıklık katkısı olan, altta yatan Peyer 'ın yamalarına ve lamina propria 'ya. M hücrelerinin bağırsak içinde nasıl ayırt edilebilmesi ve M hücrelerinin antijen alımı moleküler mekanizmalarının tam olarak anlaşılması eksiktir. Çünkü M hücreleri bağırsak hücrelerinde nadir bir nüfus ve M hücreleri için in vitro modeller sağlam değildir çünkü. Bağırsağın kendini yenileyen kök hücre kültürü sisteminin keşfi, enteroidler olarak adlandırılan, M hücrelerini kültür için yeni olanaklar sağlamıştır. Onlar, kadeh hücreleri, Paneth hücreleri, enteroendokrin hücreler ve enteranosit dahil olmak üzere bağırsak bulunan birçok ana hücre türlerine ayırt edilebilir çünkü enteroids standart kültürlü hücre hatları üzerinde avantajlı. Sitokin RANKL M hücre geliştirme esastır, ve RANKL ve TNF-α ek Kültür Medya M hücrelere ayırt etmek için ileal enteroids hücrelerin bir alt kümesini teşvik. Aşağıdaki protokol, insan ileal enteroidler kullanılarak bağırsak transwell epitelyal polarize tek tabakalı sistemi M hücrelerinin farklılaşma için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem M hücre geliştirme ve fonksiyon etüdüne uygulanabilir.

ECM 'de yetiştirilen Ileal enteroidler, ıleal enteroid kültürler için ve monolayerlerde kullanım için kalite kontrol aracı olarak göreli sağlık durumu ve farklılaşma durumları için görsel olarak ve QRT-PCR tarafından analiz edilir. ECM 'de yetiştirilen farklılaşılmış ileal enteroidler, birçok kök hücrenin varlığını gösteren, morfolojide net ve kistik görünür (Şekil 1a). Zamanla, büyüme medyasında yetiştirilen farklılaştırılmış ileal enteroidler bazı kistik görünecektir ve bazı opak görünür bir ara fenotip alabilir (Şekil 1B). Sıklıkla, farklılaşmış örneklerimiz şekil 1ayerine şekil 1B 'de gösterilenlere benzer. Bu ara kültürler, enterocayt işaretçisinin ifadesiyle ölçülen daha fazla farklılaşmış enteranosit içerir, Sükraz isomaltaz (sı), ve muhtemelen lümendeki ölü enteranosit ekstrüzyonu yoğun görünüşlerine katkıda bulunur. Ileal enteroidler bu ara durumda tek tabakalı gelişimi için kullanılabilir, ancak kültürlerde bulunan bağırsak kök hücrelerinin miktarının düşük olabilir ve bazı farklılaşan hücre türleri mevcut olabilir akılda tutulması gereken (örneğin, QRT-PCR bkz Şekil 2' deki Şekil 1B 'ye benzeyen ECM 'de yetiştirilen farklılaşılmış örneklerdeki seviyeleri). Karşılaştırmalı olarak, ECM 'de 5 + gün boyunca farklılaşma medyaları ile kültürlü ileal enteroidler, bu morfolojiye uygun şekilde koyu ve lobüler ve kültürler, tohumlama monolayerleri için iyi bir aday değildir (Şekil 1C).
Kök hücreli genler ve bağırsak hücresi farklılaşma genlerinin ifadesi, QRT-PCR tarafından ECM 'de yetiştirilen ileal enteroidlerin sağlık durumunu değerlendirmek için başka bir yol ve bir kez transwells üzerinde monolayers olarak seribaşı farklılaşma yetenekleri analiz edilebilir. Bir kök hücre geni ifadesi, LGR5, bir enterocayt geni, sı, bir kadeh hücre geni, MUC2, ve bir Paneth hücre geni, Lyz, ECM 'de yetiştirilen farklılaşmış ileal enteroid kültürler arasında karşılaştırılır ve ileal farklılaşmış RANKL/TNFα varlığı veya yokluğunda enteroid monolayers (Şekil 2). Değerler deneyler arasında farklılık gösterirken, LGR5 ifadesi, monolayers18,26farklılaşması sonrasında azalmalıdır. LGR5 ifadesi genellikle Rankl ve TNFα olmadan farklılaşan ileal monolayerlerin 7. Tersine, belirli hücre türlerinin farklılaşma işaretçileri ifadesi, böyle sı ve MUC2, farklılaşma sonra artış18. Lyz ifadesi genellikle Kültürlerimizin farklılaşması sonrasında azalır. Eğer monolayerler yapmak için kullanılan ileal enteroid kültürler Figure 1adaha Şekil 1B gibi görünüyor, intestinal farklılaşma işaretçileri artar bu ilk kültürler heterojen çünkü farklılaşma sonra mütevazı olabilir bağırsak hücresi türleri ve daha yüksek bazal düzeyine sahip si ve MUC2. Ancak, monolayerlerin farklılaşma hala LGR5 ifade ve mikroskopi (aşağıya bakınız) kaybı ile değerlendirilir oluşur. Ayrıca, RANKL ve TNFα farklılaşma medyasını eklenmesi LGR5 ifadesinin kaybını azaltır (Şekil 2). Paralel olarak, ifade sı ve MUC2 biraz farklılaşmış durumda daha düşük Rankl ve TNFα rağmen onların seviyeleri farklılaşmış durumun üzerinde artar.
Monolayerlerde m hücresi farklılaşması hem qRT-PCR hem de immünofluoresesans ile hücre yüzeyi glikoprotein 2 (GP2) ve transkripsiyon faktörü Spıb21dahil olmak üzere iki M hücreli spesifik Marker kullanılarak belirlenir. GP2 ve SPıB Ifadesi Rankl ve TNFα varlığında ileal enteroid türevi monolayerlerinde updüzenlenmiş ve Rankl olmayan ve TNFα tedavi örneklerinde algılanmıyor (Şekil 3). Bu işaretçileri ifadesi de küçük bağırsak dokusu bir parçası normalleştirilmiş olabilir22, eğer varsa. Bu, bu M hücre işaretleyicilerinin kat değişikine, bu işaretçilerin hiçbir ifadesine sahip olmayan monolayerleri kontrol etmek yerine M hücrelerine sahip olan dokuya göre karşılaştırılmasına izin verir ve bir laboratuvardaki deneyler arasında standardizasyon sağlar. M hücreleri Ayrıca immünofluorescence tarafından GP2 yüzey ifadesi ile algılanır (Şekil 4). Tipik olarak, bir confluent monolayer içinde, 1 ila 5 M hücreleri, RANKL ve TNFα (Şekil 4a-D) ile tedavi edilen örneklere 6 ile 8 sonrası tohumlama sırasında belirli bir mikroskop alanında 40X büyütmede gözlenir. Tedavi edilmemiş örneklerde hiçbir GP2 ifadesi görülür (Şekil 4E). Bir phalloidin prob ile kaplanmış XZ düzleminin ortogonal görünümü, M hücrelerinin (Şekil 4F-G) apikal yüzeyinde her hücre ve GP2 ifade çevreleyen aktin yapıları gösterir. Bu model, insan bağırsak1,2,8' de bulunan M hücrelerinin düşük frekansını geri atar. Daha fazla çalışma için M hücrelerini arındırmak ve izole etmek için, M hücreleri GP2 yüzey ifadesi kullanılarak lekelenebilir ve GP2 + hücreler için FACS kullanılarak sıralanır.
M hücreleri bağlamak ve epitel altında ikamet eden immün hücrelere intestinal lümenden antijen taşıma2. Bağırsak içinde üretilen salgı IgA bakterilere bağlanır ve mikropların taşınması kolaylaştırmak için M hücrelerinin apikal yüzeyine bağlayabilirsiniz27,28. Bu modelde geliştirilen M hücrelerinin IgA bağlamak mümkün olup olmadığını belirlemek için, insan serumu GA üst odasına eklenir, bağlamak için izin 1 h, ve sonra monolayers immünofluorescence analizi için hazırlanmıştır. M hücrelerinde IgA varlığı insan serum IgA ağır zincir tanıyan bir Fluor konjuge ikincil antikor kullanılarak görselleştirildi. M hücreleri IgA ile 1 h için tedavi edilen IgA apikal yüzeye bağlı (Şekil 5A), ancak kontrol kuyularında m hücreleri sadece Ilga için ikincil antikor ile tedavi edildi ancak algılanamayan sinyal var (Şekil 5B). Ayrıca, IgA özellikle M hücrelerinin apikal yüzeyine bağlar ve herhangi bir hücre GP2 yüzey leke eksik bağlı bulunamadı. Ayrıca, M hücrelerinin apikal yüzeyinde karakteristik olarak daha kısa yoğun aksini vardır2. Bu modelde M hücresi morfolojisi analiz etmek için, ileal enteroid türevi monolayers 7 gün boyunca yetiştirilen ve phalloidin kullanarak F-actin immünofluorescence analizi için hasat. Aktin piksel yoğunluğunun ölçümleri, m hücreleri ve ımagej yazılımı (Şekil 6a) kullanarak her m hücresine doğrudan bitişik olan m olmayan hücreler için hesaplanır. Bu modelde GP2 + M hücrelerinde actin yoğunluğu azalır ve Şekil 6B'de temsili bir görüntü gösterilir. Genel olarak, bu ileal enteroid türetilen Tek tabakalı modelinde geliştirilen M hücreleri karakteristik gen ifadesi, Morfoloji ve insan bağırsak m hücrelerinin bazı m hücre fonksiyonları, IgA bağlayıcı gibi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59894/59894fig01.jpg"> Resim 1: ECM 'de insan ileal enteroidlerin temsili morfolojisi bir hafta sonrası bölünmesi. (A) net ve kistik farklılaşılmış ileal enteroidler. (B) bazı kistik ileal enteroidler ve bazı opak lobüler ileal enteroidler ile ara fenotip. (C) koyu ve lobüler farklılaşılmış ileal enteroidler. Bir iPhone7 kamera kullanarak 4X büyütme ile optik ışık mikroskobu objektifi ile çekilen görüntüler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59894/59894fig01large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59894/59894fig02.jpg"> Şekil 2: ECM 'de yetiştirilen veya monolayers olarak ayırt edilen insan ileal enteroidlerin kök hücresi ve farklılaşma Işaretlerinin göreli ifadesi. Ileal enteroidler ECM 'de 7 gün boyunca yetiştirildiler (farklılaşmaz) ya da (ayırt edilmemiş) ya da RANKL ve TNFα (Diferententli + R/T) ile yetişkin ve ayırt edilir. Ileal enteroid kültürler veya monolayers RNA ekstraksiyon için Trizol hasat edildi. Gen ifadesi qRT-PCR tarafından belirlendi ve Gapdh'ye göre ifade edilir. Veriler, koşul başına ileal enteroids veya monolayers 3 bağımsız kuyuların ortalamasıdır. Hata çubukları SEM. ND algılanmıyor gösterir. İstatistiksel önem, Dunnett 'in farklılaşmadan karşılaştırıldığında birden fazla karşılaştırmalar testi ile tek yönlü ANOVA kullanarak günlük dönüştürülmüş değerler üzerinde belirlendi. * * p &lt; 0,01, * * * p &lt; 0,001 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59894/59894fig02large.jpg" target="_blank">lütfen buraya tıklayarak bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntüleyebilirsiniz.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59894/59894fig03.jpg"> Şekil 3: insan ileal enteroid türevi monolayerlerden M hücresinin spesifik işaretçileri GP2 ve spib göreli ifadesi. Rankl/TNFα tedavi edilmiş ve tedavi edilmemiş insan ileal enteroid türevi monolayer, 7 gün sonrası tohumlama SONRASıNDA RNA ekstraksiyonu Için Trizol 'da hasat edildi. Gen ifadesi qRT-PCR tarafından belirlendi ve Gapdh'ye göre ifade edilir. Veri, koşul başına 6 bağımsız monolayer ortalamasıdır. Hata çubukları SEM. ND algılanmıyor gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59894/59894fig03large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59894/59894fig04.jpg"> Şekil 4: zaman içinde insan ileal enteroid türevi monolayerlerde M hücrelerinde yüzey GP2 Ifade Immünofluorescence. RANKL/TNFα tedavi edilen ve tedavi edilmeyen insan ileal enteroid türevi monolayerler% 4 PFA 'da düzeltildi ve çeşitli belirtilen günlerde tohumlama sonrası immünofluoresesans için lekelenmiştir. Görseller ımagej yazılımı kullanılarak incelenmiştir. DAPı = mavi; Glikoprotein 2 (GP2) = kırmızı. (A-D) RANKL/TNFα çeşitli günlerde tohumlama sonrası tedavi edilen monolayerler. (E) 7 gün sonrası tohumlama yapılarak işlenmiş olmayan tek tabakalı. (F-G) F-actin için phalloidin prob ile günde 7 sonrası tohumlu monolayers ortogonal XZ düzlem. Phalloidin = mavi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59894/59894fig04large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59894/59894fig05.jpg"> Şekil 5: IgA özellikle M hücrelerinin apikal yüzeyine bağlar. RANKL/TNFα-tedavi edilen insan ileal enteroid türevi monolayers 7 gün boyunca büyüdü ve daha sonra (A) 1 h veya (B) sadece PBS Ile sahte tedavi (No IgA kontrolü) için 10 μg insan serumu ile tedavi edildi. 1 h sonra, monolayers 2x PBS yıkanmış,% 4 PFA,% 0,1 TritonX-100 ile geçirgen ve immünofluorescence için lekelenmiş. Görseller ımagej yazılımı kullanılarak incelenmiştir ve 3 bağımsız deneyin temsilcisidir. DAPı = mavi; Glikoprotein 2 (GP2) = kırmızı; Antikor insan serum IgA = yeşil; Phalloidin = mavi. Siyah oklar M hücre apikal yüzeyine bağlı IgA belirtmek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59894/59894fig05large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59894/59894fig06.jpg"> Şekil 6: m hücreleri bitişik olmayan m hücrelerine kıyasla akinin yoğunluğunu azalttı. RANKL/TNFα-işlenmiş insan ileal enteroid türevi monolayers 7 gün boyunca büyüdü ve sonra% 4 PFA sabit ve immünofluorescence için lekelenmiş. (A) ımagej kullanarak, GP2 + M hücreleri FreeHand seçim aracı kullanılarak özetlenmiştir ve alan ve entegre yoğunluk ölçümleri Phalloidin kanalında alınmıştır. Aynı analiz daha sonra M hücresini komşu olan her bitişik olmayan M hücresi için tamamlanmıştır. RAW entegre yoğunluk normalleştirme için her hücrenin alanı tarafından bölünmüştür. Her M hücresi için bitişik her M olmayan hücre için Ortalama entegre yoğunluk/alan hesaplanır. Görseller 3 bağımsız deneyden analiz edildi; Her nokta bir M hücresi veya komşu hücrelerin ortalamasıdır. Hata çubukları SD gösterir. Istatistiksel önem, eşleştirilmiş t testi kullanılarak günlük dönüştürülmüş değerlere göre belirlenmiştir. p = 0,0001 (B) A. görüntülerden XZ düzleminin temsili görüntüsü ımagej yazılımı kullanılarak incelendi. DAPı = mavi; Glikoprotein 2 (GP2) = kırmızı; Phalloidin = mavi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59894/59894fig06large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>

Bu protokol, insan kök hücresi türeyen ileal monolayerlerde M hücrelerinin farklılaşmasını ve gelişimini değerlendirmek için yöntemleri nasıl açıklar.

Insan kök hücresinde M hücre benzeri hücrelerin kaynaklı farklılaşma-türev ıleal Enteroid Monolayers

M (microfold) cells of the intestine function to transport antigen from the apical lumen to the underlying Peyer&#8217;s patches and lamina propria where ...

Bağırsaktaki M hücrelerinin nadirliği nedeniyle, Bağırsak homeostazve bağışıklık savunmasında M hücrelerinin oynadığı rolün tam olarak anlaşılması eksiktir. İnsan bağırsak kök hücre türetilmiş kültürlerde M hücrelerinin indüklenen farklılaşması M hücre gelişimi ve fonksiyonlarının incelenmesine olanak sağlayacaktır. Transwell membranları kaplamak için, iki odasistemi oluşturarak, 24 kuyu plakası içine istenilen sayıda Transwellyerleştirin.Ekstrasellüler matriks seyreltin, veya ECM, soğuk steril fosfat tamponlu tuzlu 25 kat. Daha sonra, membran üzerine her üst hazneiçine soğuk seyreltilmiş çözelti 100 mikrolitre ekleyin. Kapak 24 kuyu plaka bir kapak ile, ve membran üzerinde ECM katılaşma izin vermek için iki saat boyunca 37 santigrat derece bir doku kültürü kuluçka içine plaka yerleştirin.İki saat sonra, kuvözden plakayı çıkarın ve bir doku kültürü başlığı yerleştirin. Steril cımbız kullanarak, kalan çözümü nazikçe çıkarmak için her Transwell'i ters çevirin. Hücreler toplanırken kapakları açık olan kaputta membranların kurumasını bekleyin.Ileal enteroidlerin plakasını kuvözden çıkarın ve vakum aspirasyonu veya pipetle kültür ortamını her kuyudan nazikçe çıkarın. ECM'yi parçalamak için, ECM'de asılı olan ileal enteroidleri içeren her kuyuya 500 mikrolitre buz soğuğu 0,5 milimolar EDTA ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı bir P1000 pipet tervet ile şiddetle 500 mikrolitre ECM kırmak için ayarlanmış, bu nedenle çözelti içine ileal enteroidler serbest.15 mililitrekonik tüpler içine her kuyudan çözüm toplayın. 140G'de bir santrifüjdeki hücreleri peletleyin ve dört santigrat dereceye beş dakika. Pelet görünür olmalıdır, ancak kolayca yerinden olabilir, bu yüzden yavaş yavaş vakum aspirasyon veya bir pipet ile supernatant kaldırın.Sıkı kavşak bağlantılarını sindirmek ve ileal enteroidleri tek bir hücreye ayırmak için, toplanan her beş kuyuda 500 mikrolitre oda sıcaklığında tripsin peleti yeniden askıya alın. Bir P1000 pipetter kullanarak, pipet yukarı ve aşağı kümeleri ayrıştırmak için. Tüpleri 37 derece lik bir su banyosunda beş dakika veya daha kısa bir süre kuluçkaya yatırın.Trypsin'i inaktive etmek için 500 mikrolitre trypsin başına %10 FPS ile bir mililitre gelişmiş DMEM F-12 ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı 500 mikrolitre 500 mikrolitre konik tüp tarafında karşı en az 50 kez tek hücrelere kalan kümeleri daha ayrıştırmak için ayarlanmış bir P1000 ile. 50 mililitrelik konik tüpün üzerine 40 mikronluk bir süzgeç yerleştirin ve hücre süzgecini ıslatmak için %10 FPS ile bir mililitre gelişmiş DMEM F-12 ekleyin.Pipet süzgeç üzerine 15 mililitre konik tek hücre süspansiyon. Süzgeci bir mililitre gelişmiş DMEM F-12 ile %10 FPS ile yıkayın. Hücre süzgecinden geçen hücreleri 50 mililitrelik konik tüpten yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın.Hemositometre kullanarak hücreleri say. Oda sıcaklığında beş dakika 400G yeni 15 mililitretüp hücreleri santrifüj. Hücre pelet görünür olmalıdır.Dikkatle bir pipet ile supernatant kaldırmak, tekrar pelet yerinden olur durumda supernatant kaydedin. 10 mikromolar Y27632 ile MCMGF artı hücre pelet resuspend. ECM kodlu membranların gözle değerlendirildiği şekilde tamamen kurutulduğunu sağlayın.Üst hazneyi 200 mikrolitre MCMGF artı ile yıkayın. Daha sonra, her üst odaya 200 mikrolitre hücre çözeltisi ekleyin. Her alt hazneye 700 mikrolitre MMMGF artı 10 mikromolar Y27632 ekleyin.Plakayı %5 CO2 ile 37 derece santigrat doku kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Büyüme bir gün sonra, üst odasından medya kaldırmak ve taze MCMGF artı 200 mikrolitre ile birden fazla hücre katmanlarının büyümesini önlemek için değiştirin. Monolayers yaklaşık% 80 confluent, genellikle gün 1-3 post tohumlama arasında, kontrol kuyuları için farklılaşma ortamı ile basilateral medya değiştirin, ya da M hücre indüksiyon kuyuları için M hücre li media ile.Her iki koşul için de üst odadaki ortamı farklılaştırma ortamıyla değiştirin. QRTPCR tarafından M hücre farklılaşmasını doğrulamak için, önce ortamı üst ve alt bölmelerden çıkarın. Üst hazneyi oda sıcaklığında 300 mikrolitre PPS ile iki kez hafifçe yıkayın.Her üst odaya 300 mikrolitre TRIzol ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Bu arada, etiket mikro santrifüj tüpler her kuyu için, ve her tüp için TRIzol 700 mikrolitre ekleyin. P1000 ile üç kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak hücre homojenate'i toplayın ve içindekileri ilgili mikro santrifüj tüplerine aktarın.Girdap'ı karıştırmak için beş saniye. Numuneleri oda sıcaklığında üç dakika daha tutun ve ardından standart QRTPCR protokolleriyle devam edin veya numuneleri negatif 80 santigrat derecede saklayın. İmmünfloresan ile M hücre farklılaşmasını doğrulamak için, ilk olarak, üst odadan medya kaldırın.300 mikrolitre oda sıcaklığında PBS ile iki kez hafifçe yıkayın. Üst hazneye PBS'de 100 mikrolitre oda sıcaklığında %4 PFA ekleyin. Folyo ile plaka kapağı ve oda sıcaklığında 25 dakika bekletin.PFA'yı çıkardıktan sonra üst hazneyi 300 mikrolitre oda sıcaklığında PBS ile üç kez yıkayın. Çözeltiyi çıkarmadan önce monokatmanları engellemek için 100 mikrolitre %5 BSA ile monokatmanları oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika boyunca çözünmüş monokatmanları kuluçkaya yatırın. GP2 primer antikor çözeltisini PBS'de yüzde bir BSA'da 1 ila 100 arasında seyreltme ile hazırlayın ve kuyu başına 100 mikrolitre ekleyin.Çözeltiçıkarmadan önce, karanlıkta oda sıcaklığında bir saat boyunca leke. Oda sıcaklığında 300 mikrolitre PBS ile üst hazneyi üç kez yıkayın. Floresan etiketli keçi anti-fare IgG phalloidin ve DAPI ikincil bir leke çözeltisi hazırlayın ve kuyu başına 100 mikrolitre ekleyin.Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika leke. 300 mikrolitre PBS ile kuyuları üç kez yıkayın. Daha sonra, bir cam slayt üzerine montaj çözeltisi beş mikrolitre damla yerleştirin.24 kuyu plaka ve ters kuyu çıkarın. Transwell membran kaldırılması sırasında, membran tamamen düz kalmalıdır. Membrandaki çıkıntılar cam kaydırağa sağlam bir mühür girmesini önler ve görüntü kalitesini büyük ölçüde etkileyebilir.Başarıyı sağlamak için, keskin bir neşter kullanarak membranı dikkatlice kuyudan kesin. Membranı, cam kaydırak üzerine montaj çözeltisinin damlacıklarına kadar bakacak şekilde yerleştirin. Membranın üst ve ortasına 10 mikrolitre montaj çözeltisi ekleyin ve membranı cam kaydırak ile kapak fişi arasına kapatmak için üzerine bir kapak fişi yerleştirin.24 saat boyunca karanlıkta oda sıcaklığında slaytlar kuru. M hücreleri immünofloresanslar tarafından GP2 yüzey ekspresyonu ile tespit edilir. Tipik olarak, bir konfluent monolayer, bir ila beş M hücreleri rankl ve TNF alfa ile tedavi örneklerinde altı ila sekiz post tohumlama gün altı tarafından 40X büyütme belirli bir mikroskop alanında gözlenir.İşlenmemiş örneklerde GP2 ifadesi görülmez. Bir penisoidin sondası ile kapatılan XZ düzleminin ortogonal görünümü, her hücreyi çevreleyen aktin yapılarını ve M hücrelerinin apikal yüzeyinde GP2 ifadesini gösterir. Bu model, insan bağırsağı bulunan M hücrelerinin düşük frekansını özetler.Bu modelde geliştirilen M hücrelerinin IgA'ya bağlanıp bağlanabildiğini belirlemek için, M hücrelerinde IgA varlığı, insan serumu IgA'nın ağır zincirini tanıyan bir flor konjuge ikincil antikor kullanılarak görselleştirilmiştir. Bir saat boyunca IgA ile tedavi edilen M hücreleri IgA'ya apikal yüzeye bağlıdır, oysa sadece IgA'ya ikincil antikor ile tedavi edilen kontrol kuyularında bulunan M hücreleri tespit edilebilir bir sinyale sahiptir. Ayrıca, IgA özellikle M hücrelerinin apikal yüzeyine bağlanır ve GP2 yüzey lekesi olmayan herhangi bir hücreye bağlı bulunmaz.Buna ek olarak, M hücrelerinin apikal yüzeyinde karakteristik olarak daha kısa yoğun aktin bulunur. Monolayers yaklaşık% 80 confluent olduğunda RANKL TNF alfa tamamlayıcı farklılaşma medyaya geçiş, iyi M hücre farklılaşması elde etmek için anahtardır. Bu teknik, araştırmacıların M hücre gelişimiile ilgili soruları araştırmalarına ve M hücrelerini içeren patojen etkileşimlerini ve ilaç taşıma çalışmalarını araştırmalarına olanak sağlayacaktır.

induced-differentiation-m-cell-like-cells-human-stem-cell-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

İnce bağırsak kriptlerinden insan enteroidlerini ve hem cerrahi dokudan hem de biyopsilerden toplanan kolon kriptlerinden kolonoidleri oluşturmak için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu metodolojik makalede, insan enteroidlerinin ve kolonoidlerinin başarılı bir şekilde büyümesi ve sürdürülmesi için gerekli olan kültür modalitelerini sunuyoruz.

Tüm Doku ve Biyopsi İnsan Epitelyal Enteroids ve Colonoids kurulması

Burada, bir protokol kültür insan enteroid veya ana bilgisayar microbiota epitel etkileşimleri hücresel ve biyokimyasal düzeyde çalışmaya sağlam bariyer fonksiyonu var colonoid monolayers mevcut.

Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

Bu protokol, insan pluripotent hücrelerinin bağırsak organoidlerine farklılaşmasına izin verir. Protokol, hücreleri kesin endoderm, arka bağırsak endodermi ve ardından bağırsak epiteli popülasyonuna farklılaştırarak normal insan gelişimini taklit eder. Bu, protokolü hem bağırsak gelişimini hem de hastalık modelleme uygulamalarını incelemek için uygun hale getirir.

Gelişimsel ve Hastalık Modelleme Uygulamaları için hiPSC Kaynaklı Bağırsak Organoidlerinin Üretilmesi

Burada, bağırsak bariyer fonksiyonunu, geçirgenliğini ve taşınmasını incelemek için insan organoid türevi bağırsak epitel monokatmanlarının hazırlanmasını açıklıyoruz. Organoidler dış uyaranlara karşı orijinal epitel dokusu yanıtını temsil ettiğinden, bu modeller hücre hatlarının genişletilebilirliğinin avantajlarını ve birincil dokunun alaka düzeyini ve karmaşıklığını birleştirir.

Organoid Kaynaklı Epitel Tek Katmanlı: Bağırsak Bariyer Fonksiyonu için Klinik Olarak İlgili Bir In Vitro Model

Bu protokolde, murine primer epitel kolon monolayerlerinin doğrudan bağırsak mahzenlerinden nasıl üretılacağını açıklıyoruz. Geçirgen filtreler üzerinde birleştirici monolayerler, çizik yarası iyileşmesi ve biyokimyasal çalışmalar için birikme monolayerleri ve immünofluoresans analizi için seyrek ve birleştirici monolayerler üretmek için deneysel yaklaşımlar sunuyoruz.

Bağırsak Mezarlarından Murine Primer Kolon Epitel Monolayerlerinin Üretimi

Burada, insan pluripotent kök hücre kaynaklı ince bağırsak ve kolonik organoidlerin üretilmesi, sürdürülmesi ve karakterize edilmesi için ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. Bu yöntemler, tekrarlanabilirliği artırmak, ölçeklenebilirliği genişletmek ve organoidlerin kaplanması ve geçirilmesi için gereken çalışma süresini azaltmak için tasarlanmıştır.

İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Bağırsak ve Kolonik Organoidlerin Üretimi, Bakımı ve Karakterizasyonu

Bu protokol, murin ince bağırsak organoidlerinin oluşturulması, tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücrelerin murin ince bağırsak lamina propriasından izole edilmesi ve bağırsak epitel hücreleri ile tip-1 doğuştan gelen lenfoid hücreler arasındaki çift yönlü etkileşimleri incelemek için her iki hücre tipi arasında 3 boyutlu (3D) ortak kültürlerin oluşturulması için ayrıntılı talimatlar sunmaktadır.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

3 boyutlu kolonoidlerin gelişimi için murin kolonik kriptlerinin izolasyonunu detaylandıran bir protokol açıklıyoruz. Yerleşik kolonoidler daha sonra, enflamatuar bir meydan okuma almadan veya bir epitelyal tek tabaka oluşturmaya yönlendirilmeden önce konakçı epitelinin hücresel bileşimini yansıtacak şekilde terminal olarak farklılaştırılabilir.

İntestinal İnflamasyonun Yerleşik Murin Kolonoidleri Üzerindeki İn Vitro Epitelyal Etkilerinin İncelenmesi

Enteroidler, doku fizyolojisi ve patofizyolojisi, ilaç geliştirme ve rejeneratif tıp çalışmaları için yeni bir model olarak ortaya çıkmaktadır. Burada, ilgili doku hücresi tipleriyle ko-kültüre izin veren bir sığır birincil hücre 2D enteroid türevi kültür sistemini tanımlıyoruz. Bu model, gastrointestinal araştırma modellemesi için translasyonel bir avantaj sunar.

Translasyonel Biyomedikal Araştırma Uygulamaları için Sığır Primer Enteroid Türevli İki Boyutlu Tek Katmanlı Kültür Sisteminin Oluşturulması

Bu çalışma, ince ve kalın bağırsaklardan türetilen 2D tek katmanlı domuz organoidleri oluşturmak için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Bu tek tabakaların büyümesi, sağlam epitel bütünlüğünü gösteren artan TEER değerleri ile işaretlenir. Ek olarak, bu tek tabakalar, forskolin uygulamasını takiben Ussing odası deneylerinde fizyolojik salgı tepkileri sergiler.

Doğal Bağırsağın Fizyolojik Özelliklerini Yansıtan İki Boyutlu Domuz Bağırsak Organoidleri

Öğrenin, insan kök hücre kaynaklı ileal monolayerlerde M hücrelerinin indüklenmiş farklılaşmasını ve gelişimlerinin değerlendirilmesi yöntemlerini. Bu protokol, bağırsak homeostazı ve bağışıklık savunması araştırmaları için güvenilir bir model sunar.

Insan kök hücresinde M hücre benzeri hücrelerin kaynaklı farklılaşma-türev ıleal Enteroid Monolayers

Daha fazla video keşfet