Name: Yeni nesil sıralamanın ardından bağlantılı Multiplex polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak Onkojenik gen füzyon tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Öğrenin, bağlantılı Multiplex PCR ve yeni nesil sıralama ile klinik tümör örneklerinde onkojenik gen füzyonlarını tespit etme yöntemini. Bu protokol, kanser tanısı ve tedavi seçiminde kritik bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Colorado Üniversitesi Moleküler patoloji paylaşımlı kaynak tarafından destekleniyordu (Ulusal Kanser Enstitüsü Kanser Merkezi Destek Grant No. P30-CA046934) ve Colorado Merkezi tarafından Kişiselleştirilmiş tıp.

<ol><li>Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+translocations+and+gene+fusions+on+cancer+causation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The impact of translocations and gene fusions on cancer causation.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).</li>
<li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr%2Fabl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247 (4944), 824-830 (1990).</li>
<li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+a+specific+inhibitor+of+the+BCR-ABL+tyrosine+kinase+in+the+blast+crisis+of+chronic+myeloid+leukemia+and+acute+lymphoblastic+leukemia+with+the+Philadelphia+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome.</a> New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).</li>
<li>Solomon, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-line+crizotinib+versus+chemotherapy+in+ALK-positive+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).</li>
<li>Shaw, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crizotinib+in+ROS1-rearranged+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer.</a> New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).</li>
<li>Drilon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Larotrectinib+in+TRK+Fusion-Positive+Cancers+in+Adults+and+Children%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children.</a> New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).</li>
<li>Kawai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SYT-SSX+gene+fusion+as+a+determinant+of+morphology+and+prognosis+in+synovial+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma.</a> New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).</li>
<li>de Alava, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EWS-FLI1+fusion+transcript+structure+is+an+independent+determinant+of+prognosis+in+Ewing%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).</li>
<li>Pierron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+subtype+of+bone+sarcoma+defined+by+BCOR-CCNB3+gene+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion.</a> Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).</li>
<li>Papaemmanuil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Classification+and+Prognosis+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).</li>
<li>Arber, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2016+revision+to+the+World+Health+Organization+classification+of+myeloid+neoplasms+and+acute%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute.</a> Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).</li>
<li>Sanders, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+scanning+by+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+for+detection+of+known+and+novel+EML4-ALK+fusion+variants+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer.</a> Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).</li>
<li>Camidge, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+Detection+of+Lung+Cancer+Patients+Harboring+Anaplastic+Lymphoma+Kinase+%28ALK%29+Gene+Rearrangements+Potentially+Suitable+for+ALK+Inhibitor+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment.</a> Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).</li>
<li>Mino-Kenudson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+highly+sensitive+antibody+allows+for+the+routine+detection+of+ALK-rearranged+lung+adenocarcinomas+by+standard+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry.</a> Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).</li>
<li>Suehara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+KIF5B-RET+and+GOPC-ROS1+fusions+in+lung+adenocarcinomas+through+a+comprehensive+mRNA-based+screen+for+tyrosine+kinase+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions.</a> Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).</li>
<li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Molecular+Testing+Modalities+for+Detection+of+ROS1+Rearrangements+in+a+Cohort+of+Positive+Patient+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples.</a> Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).</li>
<li>Reeser, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Targeted+RNA+Sequencing+Assay+for+Kinase+Fusion+Detection+in+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).</li>
<li>Beadling, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multiplexed+Amplicon+Approach+for+Detecting+Gene+Fusions+by+Next-Generation+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).</li>
<li>Mamanova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-enrichment+strategies+for+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Target-enrichment strategies for next-generation sequencing.</a> Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).</li>
<li>Zheng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing.</a> Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).</li>
<li>Davies, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+Response+to+Crizotinib+in+a+Patient+with+Lung+Cancer+Positive+for+an+HLA-DRB1-MET+Gene+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22JCO+Precision+Oncology%22%5BJournal%5D)">Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion.</a> JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).</li>
<li>Vendrell, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+known+and+novel+ALK+fusion+transcripts+in+lung+cancer+patients+using+next-generation+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches.</a> Scientific Reports. 7 (1), 12510(2017).</li>
<li>Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+Spectrum+of+Genetic+Alterations+in+Pseudomyogenic+Hemangioendothelioma+With+Recurrent+Novel+ACTB-FOSB+Gene+Fusions%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).</li>
<li>Skalova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Profiling+of+Mammary+Analog+Secretory+Carcinoma+Revealed+a+Subset+of+Tumors+Harboring+a+Novel+ETV6-RET+Translocation%3A+Report+of+10+Cases%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases.</a> American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).</li>
<li>Guseva, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anchored+multiplex+PCR+for+targeted+next-generation+sequencing+reveals+recurrent+and+novel+USP6+fusions+and+upregulation+of+USP6+expression+in+aneurysmal+bone+cyst%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+and+Cancer%22%5BJournal%5D)">Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst.</a> Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).</li>
</ol>

D.L.A., Bayer Oncology, Genentech, AbbVie ve Bristol Myers Squibb 'den danışmanlık ücretleri aldı. K. D. D ArcherDx sponsorluğunda seyahat aldı.

Bağlantılı Multiplex PCR tabanlı hedef zenginleştirme ve kitaplık hazırlığı yeni nesil sıralamanın ardından, klinik tümör örneklerinde Multiplexed gen Fusion değerlendirmesi için de uygundur. Genomik DNA yerine RNA girişine odaklanarak, büyük ve tekrarlayan intron dizilme ihtiyacı kaçınılmaktadır. Ayrıca, bu yaklaşım füzyon ortağının kimliğine bakılmaksızın gen Fusions güçlendiriyor, yeni Fusions algılanır. Bu klinik alanda kritik bir avantajdır ve literatürde bildirilen amp aracılığıyla tanımlanan eyleme dönüştürülebili...

İki veya daha fazla genin tek bir transkripsiyon varlığı içine birleşmeleri, silmeler, yinelemeler, eklemeler, inversions ve translocations dahil olmak üzere büyük ölçekli kromozomal varyasyonların sonucu olarak ortaya çıkabilir. Değiştirilmiş transkripsiyonel kontrol ve/veya ifade gen ürünün fonksiyonel özellikleri değiştirilmiş sayesinde, bu füzyon genler kanser hücrelerine Onkojenik özellikleri görüşmek olabilir1. Birçok durumda, Fusion genler doğrudan hücresel proliferasyon ve hayatta kalma yollarını aktive ederek primer Onkojenik sürücüler olarak hareket bilinmektedir.
Kanser hastaları için gen Fusions klinik alaka ilk Philadelphia kromozom ve karşılık gelen BCR-ABL1 Fusion gen kronik Miyelojen lösemi (KML)2keşfi ile belirgin oldu. Küçük molekül inhibitörü İmatinib Mesilat özellikle bu füzyon geni hedef ve BCR-ABL1-pozitif KML hastalarda dikkat çekici etkinliği göstermiştir geliştirilmiştir3. Onkojenik gen Fusions terapötik hedefleme de katı tümörlerde başarılı olmuştur, alk ve ROS1 Fusion genleri temel örnekler olarak hizmet veren küçük hücreli olmayan akciğer kanseri inhibisyonu ile4,5. Son zamanlarda, NTRK inhibitörü larotrectinib FDA onaylı NTRK1/2/3 Fusion-pozitif katı tümörlerin, ne olursa olsun hastalık site6. Terapi seçimlerinin ötesinde, gen füzyon tespiti de hastalık tanısı ve prognoz rolleri vardır. Bu özellikle belirli Fusions ve/veya bir füzyon varlığı doğrudan prognoz bilgilendirir tarafından tanımlanan çeşitli sarkomu ve hematolojik malignite alt türleri yaygındır7,8 , 9 , 10 ' dan fazla , 11. Bunlar ancak kanser hastaları için gen füzyon algılama klinik uygulama örneklerinden birkaçı.
Klinik karar verme konusunda kritik rol oynadığı için klinik örneklerden doğru gen füzyon tespiti hayati önem taşımaktadır. Klinik laboratuvarlarda, sitogenetik teknikler, Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR), floresans in situ hibridizasyon (balık) gibi füzyon veya kromozomal yeniden düzenleme analizi için çok sayıda teknik uygulandı. immünhistokimya (IHC) ve 5 '/3 ' ifade dengesizliği Analizi (diğerleri arasında)12,13,14,15. Şu anda, kanserde harekete geçirilebilir gen Fusions hızla genişleyen listesi aynı anda birden fazla genlerin füzyon durumunu değerlendirmek için ihtiyaç sonuçlandı. Sonuç olarak, bir defada sadece bir veya birkaç geni sorgulayabilir bazı geleneksel teknikler verimsiz yaklaşımlar haline gelmektedir, özellikle de klinik tümör örneklerinin genellikle çok sonlu olduğunu ve çeşitli bulguların arasına bölünmeye imkan olmadığını düşünürsek. Ancak yeni nesil sıralama (NGS), çok gen testi için uygun bir analiz platformudur ve NGS tabanlı testler klinik Moleküler diagnostik laboratuvarlarda yaygın hale gelmiştir.
Şu anda kullanılmış NGS Fusion/yeniden düzenleme algılama için kullanılan giriş malzemesi, Kütüphane hazırlama ve hedef zenginleştirme için kullanılan kimyaları ve bir tahlil içinde sorgulanan genlerin sayısı açısından değişir. NGS Analizör, örnekten çıkarılan RNA veya DNA (ya da her ikisi) temelinde olabilir. RNA tabanlı analiz, klinik numunelerin son derece bozulmuş RNA içermesine eğiliminden kaçınmasına karşın, DNA tabanlı füzyon testinin hedefleri olan ama NGS için zor olduğu kanıtlanmış büyük ve sık tekrarlayan intronlar sıralama ihtiyacını aşmaktadır. Veri Analizi16. RNA tabanlı NGS uygulamaları için hedef zenginleştirme stratejileri büyük ölçüde hibrit yakalama veya Amplicon-aracılı yaklaşımlara bölünebilir. Fusion algılama için her iki strateji de başarıyla kullanılırken, her biri diğer17,18üzerinde avantajları içerir. Hibrid yakalama genellikle daha karmaşık kütüphaneler ve azaltılmış allelik bırakma sonucu, Amplicon tabanlı asder genellikle daha düşük giriş gerektirir ve daha az hedef sıralı19sonuç sağlar. Ancak, belki de geleneksel Amplicon tabanlı zenginleştirme birincil sınırlama tüm bilinen Fusion ortakları için astar gerekir. Birçok klinik olarak önemli genlerin düzinelerce farklı ortakla sigortalı olduğu bilinmektedir ve primer tasarım tüm bilinen ortakların algılanması için izin verilse bile, yeni füzyon etkinlikleri tespit edilmedi. Son zamanlarda tarif edilen teknik, bu sınırlama20' de (veya kısa amp) bağlantılı MULTIPLEX PCR olarak adlandırılır. AMP 'de, ' yarı işlevsel ' NGS bağdaştırıcısı, giriş RNA 'dan türetilen cDNA parçalarıyla bağlanıyor. Hedef zenginleştirme, gen spesifik astar ve adaptör için bir astar arasındaki amplifikasyon ile elde edilir. Sonuç olarak, bir yeni füzyon ortağı dahil olsa bile, ilgi genler için tüm Fusions, tespit edilmelidir (bkz. Şekil 1). Bu makalede ArcherDx FusionPlex katı tümör kiti kullanımı, bir NGS tabanlı tahlil, hedef zenginleştirme ve kitaplık hazırlama için AMP istihdam, katı tümör örneklerinde Onkojenik gen Fusions tespiti için (bkz: Tamamlayıcı Tablo 1 için tam gen listesi). Islak tezgah Protokolü ve veri analizi adımları, klinik laboratuar Iyileştirme değişiklikleri (CLIA) sertifikalı bir laboratuvarda titizlikle onaylanmıştır.

<table><tbody><tr><td>10 mM Tris HCl pH 8.0</td><td>IDT</td><td>11-05-01-13</td><td>TNA seyreltmesi için kullanılır</td></tr><tr><td>1M Tris pH 7.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9850G</td><td>Kütüphane havuzunda kullanılır</td></tr><tr><td>Bölücülü 25 mL Reaktif Rezervuarı</td><td>USA Scientific</td><td>9173-2000</td><td>Çok kanallı pipetleyiciler ve büyük reaktif hacimleri ile kullanım için</td></tr><tr><td>96 oyuklu TemPlate Yarı Etek 0.1 mL PCR plaka-doğal</td><td>ABD Scientific</td><td>1402-9700</td><td>Termosikler için kullanılan plaka</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Boncuklar</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Birkaç tahlil adımından sonra saflaştırmada kullanılır</td></tr><tr><td>Agencourt Formapure Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>A33343</td><td>TNA ekstraksiyonunda kullanılır</td></tr><tr><td>Archer FusionPlex Katı Tümör kiti</td><td>ArcherDX</td><td>AB0005</td><td>Bu kit, Illumina dizilemesi için kütüphane hazırlığı yapmak için gerekli reaktiflerin çoğunu içerir (Ion Torrent dizilimi için kitler de mevcuttur)</td></tr> <tr><td>Soğuk blok, 96 kuyulu</td><td>Light Labs</td><td>A7079</td><td>Numuneleri çeşitli adımlarda soğuk tutmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Labs</td><td>DSP-MD.43</td><td>Boncuk yıkamaları için kullanılır</td></tr><tr><td>Illumina Dahili Kontrol Standardı için Kütüphane Miktar Tayini</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4906</td><td>Kütüphane nicelemesi için kullanılır</td></tr><tr><td>Kütüphane Miktar Tayini Primerleri ve ROX Low qPCR karışımı</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4973</td><td>Kütüphane nicelemesi için kullanılır</td></tr><tr><td>Kütüphane Niceleme Standartları</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4903</td><td>Kütüphane nicelemesi için kullanılır</td></tr><tr><td>Mıknatıs Plakası, 96 kuyulu (N38 sınıfı)</td> <td>Alpaqua</td><td>A32782</td><td>Boncuk saflaştırma adımlarında kullanılır</td></tr><tr><td>MBC Adaptör Seti B</td><td>ArcherDX</td><td>AK0016-48</td><td>Multipleks dizilemeyi etkinleştirmek için örneğe özel indeksler içeren adaptörler</td></tr><tr><td>Micro Centrifuge</td><td>USA Scientific</td><td>2641-0016</td><td>PCR tüplerini döndürmek için kullanılır</td></tr><tr><td>MicroAmp EnduraPlate Optik 96 kuyulu Plaka</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4483485</td><td>Ön Sıralama QClibrary kantitasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Microamp Optik Film Sıkıştırma Pedi</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4312639</td><td>Kütüphane kantitasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Mini Plaka Döndürücü</td><td>Labnet</td><td>MPS-1000</td><td>Plaka kuyularının dibindeki sıvıyı toplamak için kullanılır</td></tr><tr><td>MiSeq Reaktif Kiti v3 (600 döngü)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3003</td><td>MiSeq dizileme çalışması için gerekli bileşenleri içerir</td></tr><tr><td>MiSeqDx Sistemi</td><td>Illumina</td><td></td><td>NGS Sıralama Cihazı</td></tr><tr><td>Model 9700 Termodöngüleyici</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td></td><td>sırasında birkaç adım için kullanılır. tahlil</td></tr><tr><td>nükleaz içermeyen su</td><td>Ambion</td><td>9938</td><td>Genel seyreltici olarak kullanılır</td></tr><tr><td>Optik ABI 96 kuyulu PCR plaka kapakları</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4311971</td><td>Pre-Seq QClibrary kantitasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>PCR İş İstasyonu Model 600</td><td>Hava Temizleme Sistemleri</td><td>BZ10119636</td><td>Bu 'ölü hava kutusunda' gerçekleştirilen ıslak tezgah tahlil adımlarıProteinaz</td></tr> <tr><td>K</td><td>Qiagen</td><td>1019499</td><td>Kullanılır TNA ekstraksiyonunda</td></tr><tr><td>QuantStudio 5</td><td>Applied Biosystems</td><td>LSA28139</td><td>PreSeq ve kütüphane kantitasyonu için kullanılan qPCR cihazı</td></tr><tr><td>Qubit RNA HS Test Kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Q32855</td><td>TNA örneklerinde RNA konsantrasyonunu belirlemek için kullanın</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Fisher</td><td>12-402-178</td><td>Çalışma alanlarının genel RNase dekontaminasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>Seraseq FFPE Tümör Füzyonu RNA Referans Materyali v2</td><td>SeraCare</td><td>0710-0129</td><td>Test pozitif kontrolü olarak kullanılır</td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>Fisher</td><td>BP359-212</td><td>Temizleme adımlarında ve sıralama kurulumunda kullanılır</td></tr><tr><td>SYBR Green Supermix</td><td>Bio Rad</td><td>172-5120</td><td>PreSeq QC Testinin Bileşeni</td></tr><tr><td>TempAssure PCR 8 tüplü Şeritler</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2700</td><td>Reaktif ve numune karıştırma vb. için kullanılır.</td></tr><tr><td>Şablon RT PCR filmi</td><td>USA Scientific</td><td>2921-7800</td><td>96 oyuklu plakaları kaplamak için kullanılır</td></tr><tr><td>U-Alt 96 kuyulu Mikroplaka</td><td>LSP</td><td>MP8117-R</td><td>Boncuk saflaştırması sırasında kullanılır</td></tr></tbody></table>

yeni nesil sıralamanın ardından bağlantılı multiplex polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak onkojenik gen füzyon tespiti

Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing

Gen Fusions sıklıkla kanser birçok farklı türde Onkojenik fenotipi katkıda bulunur. Ayrıca, kanser hastalarından numunelerde belirli Fusions varlığı genellikle doğrudan tanı etkiler, prognoz, ve/veya tedavi seçimi. Sonuç olarak, gen Fusions doğru tespiti birçok hastalık türleri için klinik yönetim kritik bir bileşeni haline gelmiştir. Yakın zamana kadar, klinik gen füzyon algılama ağırlıklı olarak tek gen assays kullanımı ile gerçekleştiriliyordu. Ancak, klinik öneme sahip gen Fusions sürekli büyüyen listesi aynı anda birden fazla genlerin füzyon durumunu değerlendirmek için bir ihtiyaç yarattı. Yeni nesil sıralama (NGS) tabanlı testler, kitlesel paralel moda nüklik asit sırası yeteneği ile bu talebi karşılamıştır. Gen hedef zenginleştirme için farklı stratejiler kullanan birden fazla NGS tabanlı yaklaşımlar artık her biri kendi güçlü ve zayıf yönlerini içeren klinik moleküler diagnostikte kullanılabilir. Bu makalede, bağlantılı Multiplex PCR (AMP) tabanlı hedef zenginleştirme ve kütüphanenin hazırlanması, klinik katı tümör örneklerinde gen Fusions değerlendirmek için NGS tarafından izlenen kullanılır. AMP, Fusion ortağının kimliğine bakılmaksızın gen Fusions 'i tanımladığı için Amplicon tabanlı zenginleştirme yaklaşımlarının arasında benzersizdir. Burada ayrıntılı olarak klinik örneklerden doğru gen füzyon tespiti sağlayan ıslak tezgah ve veri analizi adımları bulunmaktadır.

Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5 ' te gösterilen bir akciğer adenokarsinoma örneğinden sonuçları gösteren analiz kullanıcı arayüzünden ekran görüntüleri vardır. Şekil 3' te, adlandırılan güçlü kanıt Fusions yanı sıra QC durumu (kırmızı daire) listeler örnek Özet (üst) gösterilir. ADCK4-numbl Fusion (hangi 3 izoformlarının listelenir) hemen göz ardı edilir, çünkü kalıcı bir transkripsiyon readthrough...

Bu makalede, klinik katı tümör örneklerinde Onkojenik gen Fusions değerlendirmek için yeni nesil sıralamanın ardından bir bağlantılı Multiplex polimeraz zincir reaksiyon tabanlı kitaplık hazırlama kiti kullanımını ayrıntılarıyla. Hem ıslak tezgah hem de veri analizi adımları açıklanmıştır.

Yeni nesil sıralamanın ardından bağlantılı Multiplex polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak Onkojenik gen füzyon tespiti

Gene fusions frequently contribute to the oncogenic phenotype of many different types of cancer. Additionally, the presence of certain fusions in samples ...

Bu protokol hasta tümör örnekleri için kritik bilgilendirici gen füzyonlarının saptanmasında kullanılır. Düzinelerce genin füzyon durumu tek bir tözde eş zamanlı olarak değerlendirilir. Bu tekniğin avantajı, formülatif fiksasyon ile işlenen tümör örneklerinden füzyon partnerinin kimliğine bakılmaksızın gen füzyonlarını tanımlayabildiğimdir.Klinik tümör örneğinde bazı gen füzyonunun saptanması birçok kanser türünde tanı, prognoz ve tedavi seçimini doğrudan bildirir. Analiz algoritması tarafından çağrılan birçok füzyonun yapıt olduğunu anlamak önemlidir. Verileri çözümlerken en zor görev yapı ve gerçek füzyon çağrıları arasında ayrım.RNA istenilen konsantrasyonu elde etmek için toplam nükleik asit seyrelterek başlayın. Her numune için, seyreltmenin 20 mikrolitresini önceden soğutulmuş alüminyum bloktaki rastgele astar reaktif şerit tüplere aktarın ve altı ila sekiz kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın. Kısaca örnekleri aşağı spin, 96-iyi PCR plaka için tüm hacmi aktarın ve plaka mühür film ile mühür.Plakayı bir termocycler'a takın, sıkıştırma pedi ile kaplayın ve kapağı kapatın. 65 santigrat derecede 5 dakika kuluçkaya yat. Kuluçkadan sonra, ilk iplikreaktif şerit tüplerde rastgele astar lama ürününün tüm hacmini aktarın.Yukarı ve aşağı boru ile karıştırın ve kısa bir süre aşağı spin. Tüm hacmi 96 kuyulu bir PCR plakaya aktarın ve RT filmile mühürleyin. Plakayı termocycler'a takın ve müsvedde lerin talimatlarına göre reaksiyonuyguluyor.İkinci iplikçik cDNA sentezini gerçekleştirin ve onarım ve el yazması yönlere göre ligasyon adım bir ve ikinci ligasyon adım devam edin. Moleküler barkod veya MBC adaptörü şerit tüplerini numaralandırmak için tüpleri arkaya menteşelerle yatay olarak yerleştirin ve kalıcı bir belirteç kullanın. İlk ligasyon adımından boncuk arınma plakasını alın ve her numunenin 40 mikrolitresini MBC adaptör şerit tüplerine aktarın, boncuk peletini rahatsız etmemeye özen tinler.Pipetleme ile reaktifleri karıştırın, tüpleraşağı spin, ve ligasyon adım iki reaktif şerit tüpler için tüm hacmi aktarın. Örnekleri karıştırın, aşağı döndürün ve bir termocycler bloğuna yerleştirin. Isıtılan kapağı kapalı bırakın ve termocycler'ı 22 derecede beş dakika çalıştırın, ardından 4 santigrat derece tutun.Daha sonra, onları girdap ve PCR şerit tüpler yeni bir dizi 50 mikrolitre ekleyerek ligasyon temizleme boncuk hazırlamak. Bir dakika için mıknatıs inkübate ve supernatant atın. Mıknatıstan şerit tüpleri çıkarın ve yukarı ve aşağı borulama tarafından ligasyon temizleme tampon 50 mikrolitre boncuk lar yeniden askıya alın.İkinci ligasyon adımından tüm numune hacmini ligasyon temizleme boncuk şeridine aktarın. Girdap örnekleri karıştırmak ve 10 dakika oda sıcaklığında bırakın. Girdap örnek bir kez kuluçka yarısında.Daha sonra, örnekleri girdap, onları aşağı spin ve bir dakika için mıknatıs üzerinde kuluçka. Supernatant atın ve taze ligasyon temizleme tampon 200 mikrolitre ekleyin. Girdap yeniden askıya almak için, aşağı spin, ve bir dakika için mıknatıs üzerine yerleştirin.İki yıkamadan sonra tampon yerine ultra saf su kullanarak üçüncü bir yıkama gerçekleştirin. 5 milimetre sodyum hidroksit 20 mikrolitre boncuk resuspend ve 96-iyi PCR plaka örnekleri aktarın. Plakayı bir sıkıştırma yastığı olan bir termocycler'a yerleştirin ve 75 derecede 10 dakika çalıştırın ve ardından 4 derece santigrat tutun.Numuneler 4 dereceye kadar soğuduktan sonra plakayı en az üç dakika mıknatısın üzerine yerleştirin ve ilk PCR ile devam edin. İlk PCR reaktif şeridinin her kuyusuna iki mikrolitre GSP1 astar ı ekleyerek PCR reaksiyonlarını hazırlayın. İkinci ligasyon temizleme ürününün 18 mikrolitresini ilk PCR reaktif şerit borularına aktarın ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın.Örnekleri aşağı çevirin ve 96 kuyulu bir PCR plakasına aktarın. Onları termocycler'a yerleştirin ve el yazması talimatlara göre PCR çalıştırın. Her kuyuda 24 mikrolitre arınma boncukları ile dolu bir U-alt plakapcr ürün 20 mikrolitre ekleyerek boncuk arıtma ile devam edin.Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak ve beş dakika oda sıcaklığında plaka bırakın, sonra iki dakika boyunca mıknatıs üzerinde plaka kuluçka. Boncuklardan supernantant atın ve% 70 etanol 200 mikrolitre ile iki kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, tüm etanol çıkarın ve iki dakika boyunca örnek hava kuru izin.Plakayı mıknatıstan çıkarın ve 10 milimetretri-HCl ve pH 8.0'ın 24 mikrolitresinde boncukları yeniden askıya alın. Mıknatısı üç dakika kuluçkaya yatırın ve tabağı iki dakika lığına mıknatısın üzerine yerleştirin. 10 milimetre tris-HCl ikinci PCR ürün bir ila beş seyreltme ler hazırlayarak kütüphane nicelik başlar.Bunu 1:199, 1:199 ve 20:80'lik 10 milimetretri-HCl'de %05 polisorbatile seri seyreltme ile takip edin. Optik 96 kuyulu plakanın her kuyuya altı mikrolitre ana karışım ekleyerek anahtar PCR'yi kurun ve ardından uygun seyreltme veya standartdört mikrolitre. Plakayı aşağı çevirin ve qPCR aletine yükleyin.El yazması talimatlara göre qPCR gerçekleştirin. Kütüphane niceliği tamamlandıktan sonra, tüm kütüphaneleri 10 milimetre Tris-HCl ile iki nanomolara seyreltin. Normalleştirilmiş her kütüphanenin 10 mikrolitresini 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne birleştirerek bir kütüphane havuzu yapın.Daha sonra, 0,2 normal sodyum hidroksit 10 mikrolitre ile kütüphane havuzu10 mikrolitre birleştirerek ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca karışımı kuluçkaya yatırarak, denatüre amplicon kütüphane veya DAL havuzu hazırlayın. Kuluçkadan sonra, pH 7.0'da 200 milimetre tris-hcl 10 mikrolitre ekleyin, ardından 970 mikrolitre HT1 Hibridizasyon Tamponu. 300 mikrolitre HT1, 25 mikrolitre 20 picomolar PhiX ve DAL havuzunun 675 mikrolitresini birleştirerek son yük tüpünü yapın.Yük tüpünün tüm hacmini sıralayıcı reaktif kartuşunun numune kuyusuna ekleyin ve kartuşun uyanıcıya yükleyin. Pozitif kontrol örneğini seçerek başlayın ve beklenen tüm füzyonların ve onkojenik izoformların tespit edildiğinden ve güçlü kanıt sekmesinde listelendiklerinden emin olun. Her örnek için, GSP2 kontrol değeri başına ortalama benzersiz başlangıç sitelerini inceleyin, ardından kullanıcıyı bireysel füzyon destekleyen okuma yığınlarının web tabanlı JBrowse görünümüne götüren Visualize bağlantısını tıklatarak her olası birleştirme için destekleyici okumaları görselleştirin.Okumaların çoğunlukla uyumsuzlu olduğunu, ancak okumaların 30'dan fazla tabanının füzyon ortağıyla uyumlu olduğunu ve genler ve astar bağlama siteleri arasındaki kırılma noktasına bitişik dizilerin ekleme veya silme içermez olduğunu doğrulayın. Her çağrı füzyonunun genellikle uyumsuzlukiçermeyen olmasını ve okumaların önemli bir bölümünün füzyon ortağıyla uyumlu olmasını sağlamak çok önemlidir. Bu protokol akciğer adenokarsinom örneğinde gen füzyonu durumunu araştırmak için kullanılmıştır.Özet güçlü kanıt füzyonları gösterir ve Okuma İstatistikleri sayfası örnek ölçümleri gösterir. Bu örnek iyi RNA kalitesi sergiler, bu nedenle füzyon bulunmazsa negatif sonuçlar rapor edilecektir. Meşru bir füzyon çağrısı, yüksek sayıda destekleyici okuma sayısına, füzyonu destekleyen astardan okumaların yüksek bir yüzdeye ve yüksek sayıda başlangıç sitesi vardır.Okumaların görselleştirilmesi, füzyon ortağının büyük bölgelerine iyi bir uyum gösterir. Tersine, yapay bir kaynaştırma çağrısı, ortakla eşleme yaparken daha düşük destekleyici ölçümlere ve yüksek hata oranına sahiptir. Analiz algoritması tarafından yapılan yapay füzyon çağrıları yaygındır.Hasta örneğinde gerçek bir gen füzyonu temsil ettiğinden emin olmak için her çağrıyı elle incelemek çok önemlidir.

oncogenic-gene-fusion-detection-using-anchored-multiplex-polymerase

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Biz Barkodlanan DNA kütüphaneleri ve büyük ölçüde paralel "yeni nesil" dizisi ile klinik tümör numunelerinde önemli kanserle ilişkili mutasyonların saptanması için olan hibridizasyon-bazlı sonraki ekson yakalama hazırlanmasını tarif etmektedir. Hedefli ekson dizileme nedenle düşük frekanslı mutasyonları tespit etmek için yüksek duyarlılık verimli, yüksek verimlilik, düşük maliyet ve derin dizisi kapsama avantajlar sunmaktadır.

Ekson yakalama ve Devasa Paralel Dizilimine tarafından Tümör Örneklerinin somatik genetik değişiklikler tespit

Bu el yazması, iki yeni nesil dizileme paneli için klinik protokolleri açıklamaktadır. Bir panel hematolojik maligniteleri sorgularken, diğer panel solid tümörlerde sıklıkla mutasyona uğrayan genleri hedef alır. İnsan malignitelerindeki sürücü mutasyonlarının moleküler sınıflandırması, değerli prognostik ve öngörücü bilgiler sunar.

Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi

Onkoloji örneklerinin hedeflenen yeni nesil dizilimi için entegre bir sistem tanımlanmıştır. Bu çapraz platform sistemi, düşük kaliteli ve düşük miktarlı tümör biyopsileri için optimize edilmiştir, düşük DNA girdilerini barındırır, iyi karakterize edilmiş çok varyantlı kontroller içerir ve kantitatif pre-analitik kalite kontrol önlemleriyle bilgilendirilen yeni bir varyant arayan içerir.

Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

Gen ekspresyonu, mutasyonlar ve gen füzyonları için seçilen transkriptleri sorgulamak için indekslenmiş cDNA kütüphanelerinin hazırlanmasını, özel problarla hibridizasyon ve yakalama ve veri analizini içeren hedefli RNA dizileme tabanlı bir yöntemi tanımlıyoruz. Hedeflenen RNAseq, seçilen transkriptlerin bir masaüstü sıralayıcıda uygun maliyetli, hızlı bir şekilde değerlendirilmesine izin verir.

RNA Sıralama Deneyi Gen İfade ve Genomik değişiklikleri tanımlamak için hedeflenen

Bu el yazması mutasyonlar düşük frekans ctDNA, ER-Seq. algılamak için bir teknik anlatılmaktadır Bu yöntem iki yönlü hata düzeltmesi, özel arka plan filtre ve verimli moleküler acquirement eşsiz kullanımı tarafından ayrıştırılan.

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

Yüksek kaliteli genomik DNA tümör dokulardan alma genetik değişiklikler sonraki nesil sıralama kullanarak analiz etmek için önemli bir ilk adım olduğunu. Bu makalede, biz tümör hücreleri zenginleştirmek ve bozulmamış DNA touch Künye Sitoloji numune almak için basit ve hızlı bir yöntem mevcut.

Yüksek kaliteli tümör DNA klinik-patolojik numunelerin Touch Künye Sitoloji kullanarak elde etmek için basit ve hızlı yöntemi

Burada, hastanın biyolojik sıvılarında (biyoluidler) bulunan DNA 'Yı dolaşarak tümör somatik mutasyonları tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) tabanlı yöntem, tümör mutasyonu allelik frekansının (MAF) ölçülmesini sağlar ve tümör yanıtının tanı ve temporal izlenmesi için minimal invaziv bir tamamlayıcı kolaylaştırır.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Bu makalede, belirli bir hastadan farklı örnekler arasında klonal ve subklonal değişiklikleri tanımlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan deneyler belirli bir tümör tipine odaklansa da, yaklaşım diğer solid tümörler için genel olarak uygulanabilir.

Hedefe Yönelik Sıralama Yaklaşımı ile Karşılaştırmalı Lezyonlar Analizi

Skuamöz olmayan küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NS-NSCLC) bakım yönetimi için test edilecek moleküler biyobelirteçlerin artması, hızlı ve güvenilir moleküler tespit yöntemlerinin geliştirilmesine yol açmıştır. NS-KHDAK hastaları için genomik değişiklik değerlendirmesi için ultra hızlı yeni nesil dizileme (NGS) yaklaşımı kullanan bir iş akışı tanımlıyoruz.

Skuamöz Olmayan Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanserinde Ultra Hızlı Amplikon Tabanlı Yeni Nesil Dizileme

Bu protokol, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü (FFPE) doku örneklerinde gen amplifikasyonunu görselleştirmek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar.

Floresan In Situ Hibridizasyon ile Formalinle Sabitlenmiş Parafine Gömülü Numunelerde Gen Amplifikasyonunun Sağlam Tespiti

Bu protokol, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) formalinle sabitlenmiş parafine gömülü dokularda hedeflenebilir genomik değişiklikleri tespit etmek için otomatik, ISO15189 onaylı yeni nesil dizileme iş akışını açıklar.

Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanserinde Hedeflenebilir Değişikliklerin Yeni Nesil Dizileme Kullanılarak Saptanması

Öğrenin, bağlantılı Multiplex PCR ve yeni nesil sıralama ile klinik tümör örneklerinde onkojenik gen füzyonlarını tespit etme yöntemini. Bu protokol, kanser tanısı ve tedavi seçiminde kritik bilgiler sağlar.

Yeni nesil sıralamanın ardından bağlantılı Multiplex polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak Onkojenik gen füzyon tespiti

Daha fazla video keşfet