Name: In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Keşfedin, tümör hücrelerinin makrofaj çekimini değerlendiren bu in vitro analiz yöntemiyle kanser immünoterapisindeki etkileşimleri. Kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri geliştirmek için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Grant destek: Z. Alex 'in limonata stand Vakfı, Amerikan beyin tümörü Derneği, NıH T32CA108462 ve program çığır açan Biyomedikal araştırma, kısmen Sandler Vakfı tarafından finanse edilen bir destek aldı. W. Weiss NıH hibe R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103 tarafından destekleniyordu; Samuel G. Waxman Kanser Araştırma Vakfı; ve Evelyn ve Mattie Anderson koltuğu.

1. orta hazırlık
<ol><li>
Serum içermeyen kök hücre ortamının hazırlanması
	<ol>
<li>50 x B27 takviyesi, epidermal büyüme faktörü (EGF, 20 μg/mL 10 mM asetik asit 0,1% BSA ile) ve fibroblast büyüme faktörü (FGF, 20 μg/mL 10 mM asetik asit 0,1% BSA ile) çözüyor.</li>
		<li>Ekle 500 μL EGF (son konsantrasyon 20 ng/mL), 500 μL FGF (son konsantrasyon 20 ng/mL), 10 mL 50x B27 için 500 mL Dulbecco 'nun modifiye kartal orta/besin karışımı F-12 (DMEM/F12) ve 5 mL 100x penisilin/streptomisin (pen/strep). Karıştırmak için şişe 4-6 kez ters çevirin, 500 mL 0,1 μm filtrasyon bardak ile filtre sterilize. Şişe ve mağaza 4 °C olarak işaretleyin. Not: Orta, 4 °C ' de bir aya kadar kullanımı iyidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MV-4-11 kültür ortamını hazırlayın: Iscove 'un modifiye Dulbecco 'nun Orta (ıMDM) ' inin 500 mL 'ine 50 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin. Karıştırmak için şişe 4-6 kez ters çevirin, 500 mL 0,1 μm filtrasyon bardak ile filtre sterilize. Şişe ve mağaza 4 °C olarak işaretleyin. Not: Orta, 4 °C ' de bir aya kadar kullanımı iyidir.</li>
	<li>Tümör hücre bakım ortamını hazırlayın: 50 mL, Dulbecco 'nun modifiye kartal Orta (DMEM) 500 mL FBS ekleyin. Karıştırmak için şişe 4-6 kez ters çevirin, 500 mL 0,1 μm filtrasyon bardak ile filtre sterilize. Şişe ve mağaza 4 °C olarak işaretleyin. Not: Orta, 4 °C ' de bir aya kadar kullanımı iyidir.</li>
</ol>2. hücre hazırlama
1. gün:
<ol><li>Çözülme tümörü hücreleri</li>
	<li>Tümörün hücre bakım ortamını (1,3 adımda açıklandığı gibi) 37 °C ' lik su banyosunda 20 dakika ısıtın.</li>
	<li>Sıvı nitrojen tankından dondurulmuş U87, U87: EGFR, U87: Egfrvııı ve U87: EGFR + Egfrvııı hücrelerini alın. 37 °C su banyosundan 2 dakika boyunca hücreleri çözün. DIKKAT: hücreleri sıvı nitrojen tankından alırken dikkatli olun. Gerektiğinde termal koruma ve güvenlik gözlükleri ile eldiven giyin.</li>
	<li>% 70 etanol ile doku kültürü kaput yüzeyi sprey ve kağıt havlular ile yüzeyde% 70 etanol silin.</li>
	<li>Sprey kriyojenik şişeler içeren hücreler ve orta şişe 70% etanol ile, temizle 70% etanol kağıt havlu ile yüzeyde, ve doku kültürü kaputu içine getirmek.</li>
	<li>15 mL steril Santrifüjlü tüp içine 5 mL tümör hücresi bakım ortamı pipet. Tümör hücrelerini içeren tüpü 4-6 kez karıştırarak tersine çevirin. Tüm hücreleri 15 mL santrifüj tüpüne pipet. Karışım santrifüj tüp 4-6 kez tersine çevirin.</li>
	<li>200 x g 'de hücreleri 4 °c ' de 5 dakika santrifüjler. Süpernatant aspirate.</li>
	<li>Hücreleri 10 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın. 200 x g 'de hücreleri 4 °c ' de 5 dakika santrifüjler. Süpernatant aspirate.</li>
	<li>Hücreler 12 mL tümör hücre bakım ortamı (adım 1,3 ' de açıklandığı gibi) yeniden resuspend. Pipet yukarı ve aşağı 3-5 kez karıştırın. Hücreleri bir T75 hücre kültürü Flask içine aktarın.</li>
	<li>% 5 CO2Ile 37 °c ' lik kuluçte hücreleri büyütün. Tümör hücre bakım ortamını 4 °C ' ye geri koyun.</li>
</ol>2. gün:
<ol start="2"><li>Mikroskobun altındaki hücreleri kontrol edin. Gerekirse ortamı değiştirin. Hücreler kültürde bir tek tabakalı içinde büyüymelidir.</li>
</ol>3. gün:
<ol start="3"><li>Çözülme MV-4-11 hücreleri
	<ol>
<li>MV-4-11 kültür ortamını (1,2 adımda açıklandığı gibi), 37 °C su banyosunda 20 dakika ısıtın. Not: MV-4-11, belirli bir çalışmanın ihtiyacının bağlı olduğu birincil makrofajlar veya diğer makrophaj hücre çizgilere değiştirilebilir.</li>
		<li>Dondurulmuş MV-4-11 hücreleri sıvı nitrojen tankından alın. 37 °C su banyosundan 2 dakika boyunca hücreleri çözün. Dikkat: Sıvı nitrojen tankından hücreleri alırken dikkatli olun. Gerektiğinde termal koruma ve güvenlik gözlükleri ile eldiven giyin.</li>
		<li>% 70 etanol ile doku kültürü kaput yüzeyi sprey ve kağıt havlular ile yüzeyde% 70 etanol silin.</li>
		<li>Sprey kriyojenik şişeler içeren hücreler ve orta şişe 70% etanol ile, temizle 70% etanol kağıt havlu ile yüzeyde, ve doku kültürü kaputu içine getirmek.</li>
		<li>5 mL MV-4-11 kültür ortamının pipet (1,2 adımda açıklandığı gibi) 15 mL steril santrifüj tüpüne yerleştirin. Tümör hücrelerini içeren tüpü 4-6 kez karıştırarak tersine çevirin. Tüm hücreleri 15 mL santrifüj tüpüne pipet. Karışım santrifüj tüp 4-6 kez tersine çevirin.</li>
		<li>200 x g 'de hücreleri 4 °c ' de 5 dakika santrifüjler. Süpernatant aspirate.</li>
		<li>Hücreleri 10 mL PBS 'de yıkayın ve 200 x g 'de 4 °c ' de 5 dakika boyunca hücreleri santrifüjün. Süpernatant aspirate.</li>
		<li>12 mL MV-4-11 kültür ortamı (adım 1,2 ' de açıklandığı gibi) hücreleri resuspend. Yavaşça yukarı ve aşağı 3-5 kez karıştırmak için pipet. Hücreleri bir T75 hücre kültürü Flask içine aktarın.</li>
		<li>% 5 CO2Ile 37 °c ' lik kuluçte hücreleri büyütün.</li>
	</ol></li>
	<li>Tümör hücrelerini bölme
	<ol>
<li>Serum içermeyen kök hücre ortamını (1,1 adımda açıklandığı gibi) 37 °C ' lik su banyosunda 20 dakika ısıtın.</li>
		<li>% 70 etanol ile doku kültürü kaput yüzeyi sprey ve kağıt havlular ile yüzeyde% 70 etanol silin. Buzdolabından hücre dekolmanı çözümünü alın. % 70 etanol ile orta ve hücre dekolmanı solüsyonu şişeleri sprey, kağıt havlu ile yüzeyde% 70 etanol silin ve doku kültürü kaputu içine getirmek. Not: Accutase hücre dekolmanı çözümünü önceden ısıtmayın.</li>
		<li>Tümör hücre kültürünü kuluçoradan doku kültürü kaputu içine aktarın. Orta aspirate, Flask içine hücre dekolmanı çözüm 2 mL ekleyin. Not: Accutase eklemeden önce PBS ile durulama burada isteğe bağlıdır.</li>
		<li>Kaput içinde Flask ayarlayın. Tümör hücrelerinin her dakika yuvarlamak olup olmadığını kontrol edin. Tümör hücrelerinin yuvarlandıktan sonra, hafifçe Flask tarafına dokunun hücreleri Flask ayırmak yardımcı olmak için.</li>
		<li>Pipet 8 mL serum-ücretsiz kök hücre orta Flask içine, pipet yukarı ve aşağı 3 kez karıştırın, ve bir 15 mL steril santrifüj tüp içine hücreleri aktarmak. 200 x g 'de hücreleri 4 °c ' de 5 dakika santrifüjler. Süpernatant aspirate.</li>
		<li>Hücreleri 10 mL PBS 'de yıkayın. Pipet yukarı ve aşağı 3-5 kez karıştırın. 200 x g 'de hücreleri 4 °c ' de 5 dakika santrifüjler. Süpernatant aspirate. Not: Bu adım isteğe bağlıdır.</li>
		<li>Hücreleri 10 mL serum-ücretsiz kök hücre Orta (adım 1,1 ' de açıklandığı gibi) resuspend. Pipet yukarı ve aşağı 3-5 kez karıştırın. 10 μL hücre alın ve 10 μL tripan mavi çözeltisi ile karıştırın. Sayım kaydırağı içine karışımı 10 μL pipet, otomatik bir hücre sayacı kullanarak yaşam hücresi numarasını ölçmek.</li>
		<li>Hücre yoğunluğunu 2,5 x 105 hücre/ml 'ye serum içermeyen kök hücreli Orta (adım 1,1 ' de açıklandığı gibi) ve 2 ml hücrelerinin her bir 6-well hücre kültürü plakasının her bir kuyusu içine ayarlayın. Her hücre türü için, tohum 3 kuyular (triplicate örnek). Aynı zamanda, 2 mL serum içermeyen kök hücre orta ile 6 kuyu hazırlayın (hücre yok). Not: Bu numuneler kullanılacaktır: 1) negatif kontroller olarak ve 2) hücre numaralarını temel alan orta hacmi ayarlamak için.</li>
		<li>5% CO2Ile 37 °c ' lik kuluçte 6-kuyu plakaları koyun. Hücrelerin 24 saat boyunca büyümesine izin verin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. In vitro Makrophaj cazibe assay
<ol><li>Şartlama medyanın hazırlanması
	<ol>
<li>Tümörün hücre bakım ortamını (1,3 adımda açıklandığı gibi) 37 °C ' lik su banyosunda 20 dakika ısıtın.</li>
		<li>% 70 etanol ile doku kültürü kaput yüzeyi sprey ve kağıt havlular ile yüzeyde% 70 etanol silin. Buzdolabından hücre dekolmanı çözümünü alın. % 70 etanol ile orta ve hücre dekolmanı çözeltisi şişeleri sprey, kağıt havlu ile yüzeyde% 70 etanol silin ve doku kültürü kaputu içine getirmek.</li>
		<li>Altı-kuyu plakasını kuluçvandan çıkar. Klima ortamını 15 mL steril santrifüjün tüplerine dikkatlice takın. Tüpleri buz üzerine koy. Medyayı "sadece medyada" iyi bir şekilde ayrı bir 15 mL steril santrifüj tüpüne pipet. Not: Bu adımdan önce, hücrelerin iliştirilmeli olup olmadığını görmek için mikroskop altında kontrol ettiğinizden emin olun. Değilse, bir daha iyi ek izin vermek veya sayma adımda yüzen hücreleri dahil etmek için adım 2.4.8 kaplı plakaları kullanabilirsiniz.</li>
		<li>6-well plaka her iyi içine hücre dekolmanı çözeltisi 0,5 mL ekleyin. Tümör hücrelerinin her dakika yuvarlamak olup olmadığını kontrol edin. Tümör hücreleri yuvarlandıktan sonra, hücrelerin ayrılmasına yardımcı olmak için plakanın tarafına hafifçe dokunun.</li>
		<li>Pipet 2,5 mL tümör hücre bakım orta içine kuyu, pipet yukarı ve aşağı 3 kez karıştırın ve 15 mL steril santrifüj tüp içine hücreleri aktarmak için. 10 μL hücre alın ve 10 μL tripan mavi çözeltisi ile karıştırın. Sayım kaydırağı içine karışımı 10 μL pipet ve otomatik hücre sayacı kullanarak yaşam hücrelerinin sayısını ölçmek.</li>
		<li>Serum serbest kök hücre ortamını kullanarak (37 °C inkübasyon), hücre numarasına göre, şartlı medyanın hacmini ayarlayın. Örneğin, Eğer Iyi A en az sayıda hücre ile iyi olarak 3x birçok canlı hücre varsa, onun şartlık medya 1:3 seyreltmeli. Bu adım, hücre proliferasyon oranı nedeniyle fark kontrol etmek için kullanılır. Not: Serum ücretsiz kök hücre orta 37 °C inkübasyon bir gecede kullanmak için neden uzun süreli 37 °C pozlama ile medyada olası değişikliği kontrol etmektir.</li>
		<li>0,45 μm filtrelerle, şartların bulunduğu medyayı filtreleyin. Klima ortamını buz üzerine koyun. Not: Bu adım, hücreleri ve hücre enkaz şartında ortam kaldırır.</li>
	</ol></li>
	<li>MV-4-11 hücrelerinin hazırlanması
	<ol>
<li>37 °C su banyosundan 20 dakika boyunca ıMDM ortamını (FBS olmadan) ısıtın.</li>
		<li>% 70 etanol ile doku kültürü kaput yüzeyi sprey ve kağıt havlular ile yüzeyde% 70 etanol silin. % 70 etanol ile orta şişe sprey, kağıt havlu ile yüzeyde% 70 etanol silin ve doku kültürü kaputu içine getirmek.</li>
		<li>MV-4-11 hücrelerinin dokusunu doku kültürü kaputu içine alın. 15 mL steril santrifüj tüpüne 10 mL hücreli pipet takın. 10 μL hücre alın ve 10 μL tripan mavi çözeltisi ile karıştırın. Sayım kaydırağı içine karışımı 10 μL pipet ve otomatik hücre sayacı kullanarak yaşam hücrelerinin sayısını ölçmek. 4 °C ' de 5dk için 200 x g 'de hücreleri santrifüjler. Süpernatant aspirate.</li>
		<li>Hücreleri 10 mL PBS ile yıkayın ve 200 x g 'de 4 °c ' de 5 dakika boyunca hücreleri santrifüjün. Süpernatant aspirate.</li>
		<li>1x106 hücrelerin/ml son hücre yoğunluğu için imdm Orta (FBS olmadan) hücreleri resuspend. Not: Burada kullanılan makrofajlar hücre sayısı ayarlanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Transwell tahlil Not: Bu adım için, bir hücre geçiş tahlil kiti kullanın veya reaktifler satın almak ve ayrı olarak ekleyin. MV-4-11 hücreleri için 5 μm gözenek boyutuna sahip Transwell ekler 'i seçin. Makrophaj göçü algılamak için, alt odada makrofajların sayısını doğrudan ölçmek veya kolorimetrik/Fluorimetrik yöntemleri kullanın. Burada, biz kolorimetrik yöntemi kullanarak tahlil göstermektedir.<ol>
<li>24 kuyu plakasını, kesici uç ve Reaktifleri oda sıcaklığına getirin.</li>
		<li>Her bir eklemin üzerine hazırlanan MV-4-11 hücreleri 250 μL ekleyin.</li>
		<li>400 μL 'ye sadece (37 °C ' de gece kuluçla), 24 kuyu plakasının alt odalarına negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. Her tümör hattı veya kontrolü için, triplicate örnekleri kullanın. Ekleme ve şartlık orta arasında kabarcıklar kaçının. Kabarcıklar alt kuyuları göç makrofajlar inhibe edecektir.</li>
		<li>4 h için 5% CO2 Ile 37 °c ' lik kuluçte plakalarını inkük. Not: İnkübasyon süresi ayarlanabilir. Alt odalarına göç eden hücreler mikroskop altında görülebilir.</li>
		<li>Hafifçe aynı kuyu iç duvarındaki ekle dokunun ve kesici uç atın. MV-4-11 hücreleri süspansiyon içinde büyüyünce, hücre dekolmanı çözeltisi veya tripsin tedavisi burada gerekli değildir.</li>
		<li>Yavaşça yukarı ve aşağı kuyuların hücreleri 3 kez karıştırın pipet. 225 μL hücre süspansiyonunu floresan ölçümü için uygun siyah duvarlı 96-kuyu plakasına aktarın.</li>
		<li>4X liziz tampon ile CyQuant boya 1:75 seyreltin. Vortex kısaca ve çözelti aşağı spin. 96-kuyu plakasının her bir kuyusu için 75 μL çözüm ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dk. inkulat.</li>
		<li>Flüoresan plaka okuyucu ile 480/520 nm filtre seti kullanılarak floresan okuyun.</li>
		<li>Boş ve normalleştirme kontrol tümörü hücre hattına çıkararak verileri analiz edin.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Liu, Y., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+function+of+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">The origin and function of tumor-associated macrophages.</a> Cellular & Molecular Immunology. 12 (1), 1-4 (2015).</li>
<li>Riabov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+tumor+associated+macrophages+in+tumor+angiogenesis+and+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Role of tumor associated macrophages in tumor angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Frontiers in Physiology. 5, (2014).</li>
<li>Coussens, L. M., Zitvogel, L., Palucka, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+tumor-promoting+chronic+inflammation%3A+a+magic+bullet%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutralizing tumor-promoting chronic inflammation: a magic bullet.</a> Science. 339 (6117), 286-291 (2013).</li>
<li>Tsukamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Blockade+of+IL6+and+PD-1%2FPD-L1+Signaling+Abrogates+Mutual+Regulation+of+Their+Immunosuppressive+Effects+in+the+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combined Blockade of IL6 and PD-1/PD-L1 Signaling Abrogates Mutual Regulation of Their Immunosuppressive Effects in the Tumor Microenvironment.</a> Cancer Research. 78 (17), 5011-5022 (2018).</li>
<li>Borgoni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+tumor-associated+macrophages+switches+the+epigenetic+profile+of+pancreatic+cancer+infiltrating+T+cells+and+restores+their+anti-tumor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Depletion of tumor-associated macrophages switches the epigenetic profile of pancreatic cancer infiltrating T cells and restores their anti-tumor phenotype.</a> Oncoimmunology. 7 (2), e1393596(2018).</li>
<li>Argyle, D., Kitamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Macrophage-Recruiting+Chemokines+as+a+Novel+Therapeutic+Strategy+to+Prevent+the+Progression+of+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting Macrophage-Recruiting Chemokines as a Novel Therapeutic Strategy to Prevent the Progression of Solid Tumors.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2629(2018).</li>
<li>An, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+cooperates+with+EGFRvIII+to+recruit+macrophages+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">EGFR cooperates with EGFRvIII to recruit macrophages in glioblastoma.</a> Cancer Research. , (2018).</li>
<li>Fan, Q. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+phosphorylates+tumor-derived+EGFRvIII+driving+STAT3%2F5+and+progression+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">EGFR phosphorylates tumor-derived EGFRvIII driving STAT3/5 and progression in glioblastoma.</a> Cancer Cell. 24 (4), 438-449 (2013).</li>
<li>Jacquelot, N., Duong, C. P. M., Belz, G. T., Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Chemokines+and+Chemokine+Receptors+in+Melanoma+and+Other+Cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting Chemokines and Chemokine Receptors in Melanoma and Other Cancers.</a> Frontiers in Immunology. 9, 2480(2018).</li>
<li>Arimont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Analysis+of+Chemokine+Receptor-Ligand+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural Analysis of Chemokine Receptor-Ligand Interactions.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 60 (12), 4735-4779 (2017).</li>
<li>Turner, M. D., Nedjai, B., Hurst, T., Pennington, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+chemokines%3A+At+the+crossroads+of+cell+signalling+and+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytokines and chemokines: At the crossroads of cell signalling and inflammatory disease.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (11), 2563-2582 (2014).</li>
<li>Sokol, C. L., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemokine+system+in+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The chemokine system in innate immunity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (5), (2015).</li>
<li>Pathria, P., Louis, T. L., Varner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Tumor-Associated+Macrophages+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting Tumor-Associated Macrophages in Cancer.</a> Trends in Immunology. 40 (4), 310-327 (2019).</li>
<li>Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-associated+macrophages+as+treatment+targets+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (7), 399-416 (2017).</li>
</ol>

William A. Weiss, StemSynergy Therapeutics 'in kurucu ortaklarından biridir. Zhenyi an 'ın ifşa etmesi gereken bir şey yok.

Bu protokolde, birkaç anahtar adım vardır: 1) Transwell ekleme seçimi. MV-4-11 hücre hattı için 5 μm Transwell ekler iyi çalışır. Ancak, sık kullanılan monoksit hücre çizgisi THP-1 gibi diğer hücre çizgileri için farklı bir gözenek boyutu daha iyi çalışabilir. 2) farklı hücre hatları farklı hızlarda büyüyünce, hücre numaralarına göre şartlı medyanın hacmini ayarlamak önemlidir. Bu amaçla, aynı deneysel koşullar altında kuluzlanmış hücre içermeyen medya, şartlı medyayı seyreltebilmek için kullanılabilir. 3) FBS sitokinler...

Macrofajlar yüksek fenotürik ve fonksiyonel heterojenite ile bağışıklık hücrelerdir1. Onlar ana savunma sistemleri, doku tamiri, geliştirme ve tümör ilerlemesi1önemli roller oynar. TAMs, Solid tümörlerin mikroortamında macrofajlar. Bazı Tams T hücre aracılı sitotoksisik aktivite inhibe ederek tümör büyümesini teşvik edebilir, tümör mikroçevre modülasyon (TME), anjiyojenezi teşvik, invazyon ve metasfik2,3,4, 5. Tams en bol hücre TÜRLERI arasında TME ve Tams yüksek sayıda genellikle katı tümörlerin birçok türde kötü hasta hayatta kalma ile ilişkilidir6. Tümör hücrelerinin farklı genetik imzaları makrofajlar işe yeteneklerini etkiler. GBM 'de hiçbir çare olmayan agresif bir beyin tümörü olan makrofajlar, tümör kitlesi7' nin yarısını gösterebilir. Epidermal büyüme faktörü reseptörünün (EGFR) ve kesilmesi mutant egfrvııı 'in eş amplifikasyonu, tümör büyüme avantajlarını8' e getiren GBM 'de sıklıkla görülür. EGFR ve Egfrvııı 'e eş ifade eden hücreler, EGFR veya Egfrvııı 'i ifade eden hücrelere kıyasla daha fazla makrofajları çeker7.
Kemokinler, TME6,9' da bağışıklık bileşiminin düzenleniminde önemli roller oynayan küçük sitokinlerin bir ailesdir. İnsan hücreleri 50 ' den fazla sitokinler10ifade eder. Tümörlerde bağışıklık infiltrasyonu büyük ölçüde sitokinler ve sitokin reseptörleri arasındaki etkileşim tarafından gerçekleştirilir11. Bağışıklık hücrelerinin her türü farklı kemokin reseptörleri ifade/kemokinler ve belirli chemokines salgılar hücreler tarafından işe alınabilir/kemokin reseptörleri12. Kanser hücreleri, TAMs, düzenleyici T hücreleri ve myeloid türeyen bastırıcı hücreler (MDSCs)6gibi bağışıklık hücrelerini işe almak için belirli kemokinler ifadesini artırabilir. Tümörler tarafından salgılanan spesifik kemokinin blokajı, bağışıklık hücrelerinin tümör kitlesine infiltrasyonunun inhibe edilmesi konusunda umut verici bir yol olabilir.
Burada, tümör-makrophaj etkileşiminin in vitro olarak değerlendirilmesine izin veren bir protokol tanımlamakta, kemokinler ve makrophaj hücre hatları içeren tümör hücrelerinden şartların kullanıldığı medyayı kullanarak.

<table><tbody><tr><td>0.1 ve mu; m filtrasyon kabı</td><td>Thermo fisher</td><td>566-0010</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m filtre ünitesi</td><td>Millipore</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>10 mL serolojik pipetler</td><td>Olympus plastikler</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>15 mL steril santrifüj tüpleri</td><td>Olympus plastikler</td><td>28-103</td><td></td></tr><tr><td>1 mL pipet ucu</td><td>ART moleküler biyoürünler</td><td>2779-RI</td><td></td></tr><tr><td>2 mL aspirasyonlu pipet</td><td>Falcon</td><td>357558</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu plaka</td><td>Kırlangıç</td><td>ECM507</td><td>ECM507'nin bir parçası veya ayrı olarak satın alınabilir</td></tr><tr><td>4x lizis tamponu</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>ECM507'nin bir parçası veya ayrı olarak satın alınabilir</td></tr><tr><td>5 & mu; m Transwell insert</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>ECM507'nin bir parçası veya ayrı olarak satın alınabilir</td></tr><tr><td>75 cm2 şişe</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Yenilikçi hücre teknolojileri</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>CyQuant Boya</td><td>Millipore</td><td>ECM507</td><td>ECM507'nin bir parçasıdır veya ayrıca satın alınabilir</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM: F12</td><td>Gibco</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>FGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Kalem Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Biorad</td><td>1450021</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

Tümör ilişkili makrofajlar (TAMs) kanserlerin farklı türleri için tümör kitlesinde hücrelerin büyük bir yüzdesi için hesap. Glioblastoma (GBM), hiçbir tedavi ile malign bir beyin tümörü, bir buçuk tümör kitle TAMs vardır. TAMs hücrelerde belirli genlerin aktivasyonuna bağlı olarak, tümör yanlısı veya anti-tümör olabilir. Tümörlerde genetik mutasyonlar, sitokin ifadesinin düzenlenmesi yoluyla, TAMs 'in tümör mikroortamına alınmasını etkileyebilmektedir. Burada, biz tümör hücrelerinden şartlandıran orta makrophaj işe değerlendirmek için bir nicel hücre tabanlı tahlil tarif. Bu tahlil, yüksek yeniden üretilebilirlik ve düşük değişkenlik için izin glioblastoma tarafından şartlanabilir medyası tarafından makrophaj cazibe çalışması için MV-4-11 insan makrophage hücre hattı kullanır. Bu tahlil ile oluşturulan veriler, tümör ve tümör mikroçevre arasındaki etkileşimin daha iyi anlaşılması için katkıda bulunabilir. Benzer tahlil tümör hücreleri ve diğer bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimi değerlendirmek için kullanılabilir, T hücreleri ve doğal katil (NK) hücreleri de dahil olmak üzere.

Sonuçlar genellikle çubuk grafiklerle gösterilecektir (örnek Şekil 1' de gösterilir). Yüksek 480/520 değerlere sahip numuneler, şartların makrofajları işe almak için yüksek kapasiteye sahip olduğunu gösterir. Deneysel ihtiyaca bağlı olarak, ek kontroller dahil edilebilir. Örneğin, bir nötralize antikorlar makrofaj chemotaxis kaldırılması için şartlı medya tedavi ve aynı tahlil gerçekleştirmek için kullanabilirsiniz. Ayrıca, pozitif bir kontrol olarak hizmet v...

Bu makalede, makrofajlar çekmek için tümör hücrelerinden şartlık orta yeteneğini değerlendirmek için yararlı bir in vitro tahlil temsil eder.

In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...

Tümör ilişkili makrofajlar tümör mikroortamında önemli rol oynar. Tümör hücrelerindeki farklı genetik mutasyonların makrofaj alımını nasıl etkilediğini anlamak kanser hastaları için kişiselleştirilmiş tedavi nin tasarlanması için çok önemlidir. Bu tetki, tümör hücreleri ve makrofajlar in vitro arasındaki etkileşimi değerlendirmek için kolay ve sağlam bir yol sağlar.Bu tsay in vitro tümör hücreleri ve diğer bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri değerlendirmek için değiştirilebilir. Bu işlem başlamak için, 20 dakika boyunca 37 santigrat derece bir su banyosu içine yerleştirerek serum içermeyen kök hücre orta ısınmak. Sprey doku kültürü başlık yüzeyi ile 70% etanol ve kağıt havlu ile püskürtülür yüzey aşağı silin.Sonraki sprey% 70 etanol ile orta ve hücre ayırma çözeltisi şişeleri ve kağıt havlu ile silin. Temizlenen şişeleri doku kültürüne aktarın. Tümör hücresini alın ve doku kültürü başlığına aktarın.Orta aspire ve PBS 10 mililitre ile hücreleri yıkayın. Sonra şişeye iki mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin. Şişeyi kaputa indirin, tümör hücrelerinin toplayıp yuvarlanmamasını kontrol edin.Tümör hücreleri toplandıktan sonra, hücrelerin ayrılmasına yardımcı olmak için şişenin yan tarafına hafifçe dokunun. Bundan sonra, pipet sekiz mililitre serumsuz hücreli orta şişeiçine ve pipet yukarı ve aşağı üç kez karıştırmak için. Bu hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne ve santrifüje 200 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika aktarın.Süpernatant aspire. Daha sonra hücreleri 10 mililitre PBS'de yıkayın ve karıştırmak için 3-5 kez pipetle inip çıkarın. Hücreleri 200 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.Supernatant aspire, ve serum içermeyen orta 10 mililitre hücreleri resuspend. Pipet yukarı ve aşağı 3-5 kez karıştırmak için. Bu hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini 10 mikrolitre Trypan Blue çözeltisi ile karıştırın.Sonraki pipet Trypan Mavi ve hücre karışımı bir sayma slayt içine 10 mikrolitre ve canlı hücre numarasını ölçmek için otomatik bir hücre sayacı kullanın. Hücre yoğunluğunu mililitrebaşına beşinci hücrelere 2,5 kat 10'a ayarlamak için serumsuz hücre ortamını kullanın. Sonra altı kuyulu bir kültür plakasının her kuyunun içine iki mililitre hücre tohumu.Aynı zamanda, serumiçermeyen kök hücre li orta sadece iki mililitre ile altı kuyu hazırlayın. Bundan sonra, 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derece altı kuyu plakaları kuluçka. İlk sprey doku kültürü başlık yüzeyi ile 70% etanol ve kağıt havlu ile püskürtülür yüzey aşağı silin.Sonraki sprey% 70 etanol ile orta ve hücre ayırma çözeltisi şişeleri ve kağıt havlu ile silin. Temizlenen şişeleri doku kültürüne aktarın. Bundan sonra, kuvözden altı kuyulu tabakları alın.Şartlı ortamı 15 mililitrelik steril santrifüj tüplerine dikkatlice pipetlendirin ve tüpleri buza yerleştirin. Altı kuyulu plakaların her bir kuyuya 0,5 mililitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve tümör hücrelerinin yuvarlanıp yuvarlanmadın her dakikakontrol edin. Tümör hücreleri toplandıktan sonra, hücreleri ayırmak için yavaşça plakanın kenarına dokunun.Sonraki pipet 2.5 tümör hücresi bakım aracı kuyu içine mililitre ve pipet yukarı ve aşağı üç kez karıştırmak için. Hücreleri 15 mililitrelik steril santrifüj tüpüne aktarın. 10 mikrolitre hücreyi 10 mikrolitre Trypan Blue çözeltisi ile karıştırın ve bu karışımın 10 mikrolitresini sayma slaytına aktarın.Canlı hücre sayısını ölçmek için otomatik hücre sayacı kullanın ve şartlandırılmış ortamın hacmini hücre sayısına göre ayarlamak için bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatan serumsuz kök hücre ortamını kullanın. Koşullu ortamı 0,45 mikrometre filtrelerden geçirin ve koşullu ortamı buzüzerine yerleştirin. Başlamak için, 20 dakika boyunca 37 santigrat derece bir su banyosunda IMDM orta ısınmak.% 70 etanol ile doku kültürü başlık temizleyin ve orta şişe temiz ve daha önce açıklandığı gibi kaput içine taşıyın. Daha sonra MV-4-11 hücrelerinin şişesini kaputa aktarın. Pipet 10 mililitre hücre15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne.Daha önce açıklandığı gibi canlı hücrelerin sayısını ölçmek için Trypan Blue ve otomatik hücre sayacı kullanın. Sonra hücreleri 200 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant aspire ve PBS 10 mililitre ile hücreleri yıkayın.Santrifüj tekrar 200 kez g ve dört derece santigrat beş dakika için. Süpernatant aspire, ve mililitre başına bir milyon hücrenin son hücre yoğunluğu nda IMDM orta hücreleri resuspend. Önce gerekli malzemeleri oda sıcaklığına getirin.Her kesici uça hazırlanan MV-4-11 hücrelerinin 250 mikrolitresini ekleyin. Daha sonra sadece 24 kuyulu plakanın alt odalarına şartlı orta veya orta 400 mikrolitre ekleyin ve numunelerin üç kat daha eklenmesini sağlar. 4 saat boyunca %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yat.Daha sonra aynı kuyunun iç duvarındaki kesici ucu hafifçe dokunun ve kesici ucu atın. Yavaşça kuyularda hücreleri pipet yukarı ve aşağı üç kez karıştırmak için. Bu hücre süspansiyonunun 225 mikrolitresini floresan ölçümü için uygun olan siyah duvarlı 96 kuyulu plakanın kuyularına aktarın.Bundan sonra, CyQUANT boyayı 1'den 75'e kadar olan bir oranda 4x lizis tamponu ile seyreltin. Girdap kısaca ve çözüm aşağı spin. Bu çözeltinin 75 mikrolitresini 96 kuyulu plakanın her kuyusuna aktarın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.Floresan levha okuyucu kullanarak, floresan okuyun ve metin protokolünde özetlenen verileri analiz. Bu çalışmada tümör makrofaj etkileşimini incelemek için in vitro bir tetki kullanılmıştır. Floresan değerleri yüksek olan örnekler, koşullu ortamın makrofajları işe alma kapasitesinin yüksek olduğunu gösterir.Deneysel ihtiyaca bağlı olarak ek kontroller eklenebilir. Örneğin, makrofaj kemotaksisi ortadan kaldırmak ve aynı şekilde gerçekleştirmek için koşullu medya tedavi etmek için nötralize antikorlar kullanabilirsiniz. Bir de şartlı ortama ekstra kemokinler ekleyebilirsiniz, hangi olumlu bir kontrol olarak hizmet vermektedir.Farklı hücre türleri farklı hızlarda büyüyebilir, çünkü bu tsuriçin hücre numarası farklılıklarını kontrol etmek önemlidir. In vitro sonuçların in vivo onayı çok önemlidir. Bir fareler içine tümör hücreleri enjekte edebilir ve akış sitometri ile tümörleri analiz, immünboyama, ve CyTOF sonuçları onaylamak için.

in-vitro-assay-to-study-tumor-macrophage-interaction

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu videoda, floresan tabanlı transwell makrofaj etkileşim testi kullanarak tümör-makrofaj etkileşimini inceliyoruz. Tahlil, makrofajların kimyasal kaynaklı kemotaksis yoluyla göçünün analizini içerir.

Floresan Bazlı Transwell Makrofaj Çekim Testi: Kimyasal Kaynaklı Kemotaksis Yoluyla Tümör-Makrofaj Etkileşimini İncelemek İçin İn Vitro Bir Yöntem

Kanserin kötü huylu davranışını anlamak, tümör hücrelerinin makrofajlar gibi tümör mikro çevresinin bileşenleriyle nasıl etkileşime girdiğine dair doğru modeller oluşturmayı gerektirir. Burada, tümörle ilişkili makrofajlar ve mikroglia ile glioblastoma hücre etkileşimini incelemek için iki yöntem tanımlanmıştır ve burada glioblastoma invazyonu üzerindeki etki değerlendirilmektedir.

Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

Bu çalışmada kanser hücrelerine karşı makrofaj fagositik aktivite, özellikle 4T1 fare meme karsinom hücreleri görüntülendi. Canlı hücre kokültür modeli floresan ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu kombinasyonu kullanılarak oluşturulmuş ve gözlenmiştir. Bu değerlendirme, çok noktalı hızlandırılmış video geliştirmek için görüntüleme yazılımı kullanılarak görüntülendi.

Eş-Kültürlerde M1 Makrofaj-4T1 Fare Mammary Karsinom Hücrelerinde Fagositik Aktivitenin Zaman Atlamalı 2D Görüntülemesi

Burada, bağışıklık yanıtını bastırmak için tümör hücreleri tarafından kullanılan temassız parakrin sinyalçalışmasını kolaylaştırmak için geçirgen membran destekleri kullanan bir yöntem salıyoruz. Sistem makrofaj aktivasyonu sönümleme tümör salgılanan faktörlerin rolünü incelemek için münasip olduğunu.

Permeable Membran Destekleri ile Co-Culture kullanarak Tümör Salgılanan Parakrin Ligandların Makrofaj Aktivasyonu Üzerine Etkilerinin İnceleştirilmesi

Burada, birincil insan monositinden türetilmiş makrofajların üç boyutlu (3D) bir kollajen I matrisinde bir tümör sferoidi ile etkileşimini araştırmak için bir protokol sunuyoruz ve mikroçevrenin çözünür ve fiziksel özelliklerinin hücre istilası üzerindeki etkisini karşılaştırma imkanı sunuyoruz.

Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

İnsan CART ve miyeloid hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek için mevcut olan sınırlı ksenogreft modelleri göz önüne alındığında, insan makrofajlarının CART hücreleri üzerindeki etkilerini anlamak için in vitro ve in vivo modeller oluşturduk. Bulgular, tümör mikroçevresindeki makrofaj rollerini değerlendirmek ve makrofaj hedefli immünoterapileri test etmek için potansiyel olarak genelleştirilebilir.

Miyeloid Hücreler ve CAR T Hücreleri Arasındaki Etkileşimlerin İn Vitro ve İn Vivo Olarak İncelenmesi

Burada mitokondri zar potansiyel (MMP) belirlemek ve CLIC4 nakavt kaynaklı HN4 hücre apoptosis içinde vitroçalışma rodamine 123 uygulanması için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Ortak floresan mikroskop altında ve confocal lazer tarama floresan mikroskop MMP gerçek zamanlı değişiklik kaydedildi.

Mitokondri zar potansiyeli CLIC4 nakavt kaynaklı HN4 hücre Apoptosis Vitro çalışma tespiti

Kuyruklu yıldız tahlil tek ve çift iplikçikli DNA içeren DNA hasarı tatili algılamak için verimli bir yöntemdir. Kemoterapi tedavi edici etkisini değerlendirmek için kanser hücrelerinin DNA hasarı ölçmek için alkali ve tarafsız kuyruklu yıldız deneyleri tarif.

Vitro DNA hasarı kuyruklu yıldız tahlil kullanarak değerlendirmek

Bu iletişim kuralı hücreleri hücre microenvironment koruma sırasında bir üç boyutlu ortamda göç ve işgal yeteneklerini ölçmek için kullanılabilir bir ters dikey işgali tahlil açıklar. Bu tahlil nadir ve/veya hassas hücreler için uygundur.

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Bu kağıt vitro hemangioblastomas (HBs) ve HBs rolü klasik tümör angiogenez bulunmaktadır olup olmadığını değerlendirmek için kapsamlı bir yordam sunar. Sonuçları HB-neovaskülarizasyon karmaşıklığı vurgulamak ve bu sık görülen angiogenez HB neovaskülarizasyon sadece tamamlayıcı bir mekanizma olduğunu göstermektedir.

Sözde Hemangioblastoma tahlil çimlenme küresel kullanarak neovaskülarizasyon Vitro performansını değerlendirmek için kapsamlı bir yordam

Keşfedin, tümör hücrelerinin makrofaj çekimini değerlendiren bu in vitro analiz yöntemiyle kanser immünoterapisindeki etkileşimleri. Kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri geliştirmek için güçlü bir araç sunar.

In vitro assay tümör çalışma-macrophage etkileşim

Daha fazla video keşfet