Olomotor sinir gelişimi için zaman aşımı görüntüleme için embriyonik GFP-Ifade fareler dan ex vivo okülomotor dilim kültürü
16 Temmuz 2019
Bir ex vivo dilim tahlil gerçek zamanlı olarak görüntülenmiş olmak okülomotor sinir büyüme sağlar. Dilim E 10.5 ISLMN katıştırarak oluşturulur: agarose 'de Gfp embriyolar, bir vibratom üzerinde dilimleme, ve bir aşama-üst kuluçç büyüyen. Axon rehberlik yollarının rolü, kültür ortamına inhibitörler ekleyerek değerlendirilir.
Bu protokol bize okülomotor sinir aktif akson rehberlik yolları belirlemek ve gerçek zamanlı olarak sinir yörüngesi boyunca farklı noktalarda rollerini değerlendirmek için izin verir. Bu teknik, aksonların seyahat ettiği yerel ortamları ve nihai hedeflerini korur. Büyüyen aksonlar kesilmez, bu nedenle rejenerasyon yerine ilk akson büyüme, değerlendirilebilir.
Bu yöntem oküler motor sisteminde akson rehberlik içine anlayışlar sağlar ama diğer sinirlerin akson rehberlik çalışmasına adapte edilebilir. Bu teknik usta pratik alır ve hızlı bir şekilde çalışmak son derece önemlidir. İlk kez denerken, bir bütün çöp yerine sadece birkaç embriyo kullanın.
İşleme başlamadan önce, ilk embriyonik gün 10.5 zamanında bir miyeslik ultrason ile gebelik onaylamak. Hasat embriyolar,% 70 etanol ile hamile farenin karın sprey, ve rahim ayıklamak için karın boşluğu açmak için makas kullanın. Taze buz gibi HBSS ikinci bir Petri çanak içinde organ yerleştirmeden önce buz gibi HBSS bir Petri kabında rahim yıkayın.
Bir diseksiyon kapsamında, rahim boynuzu ve bireysel amniyotik keseler gelen embriyolar kaldırmak, 12-iyi plaka kapağının alt kısmında her embriyo yerleştirerek, buz üzerinde, onlar hasat olarak. Her embriyoyu çevreleyen sıvıyı, embriyoların kendilerine dokunmadan çıkarmak için filtre kağıdını kullanın ve embriyoları %4'lük düşük eriyen agarose sıvıya batırın. Agarose katılaşmak için buz üzerine plaka kapağı yerleştirin.
Agarose sertleştiğinde, embriyoları ters çevirin ve her numunenin diğer tarafını ilave agarose ile kapatın. Agarose'un ikinci cildi katılaşmış ken, her embriyonun vibratom sahnesinde düzgün bir şekilde yönlendirilen şekilde her embriyonun etrafındaki agarose'u kesmek için floresan parçalayıcı mikroskop kullanın. Okülomotor çekirdekleri ve erken akson outgrowths floresan olmalıdır.
Her embriyoyu, çekirdek, büyüyen aksonlar ve göz bir çizgi oluşturacak şekilde hizala ve agarose'u bu çizgiye paralel olarak kesmek için jilet kullanın. Daha sonra, vibratom odasını buz gibi dilim tamponuyla doldurun ve ilk embriyoyu vibratom aşamasına yapıştırın, böylece bıçak okülomotor çekirdeği ve gözleri ile paralel olacak. Yapıştırıcı kuruduğunda, vibratom evresini, embriyonun bıçaktan uzağa bakacak şekilde yönlendirilen bir şekilde batırın ve 400 ila 450 mikrometrelik dilimler elde etmek için yeni bir vibratome bıçağı kullanın.
Elde edildikçe her dilimi soğuk dilimleme tamponuna aktarmak için steril bir transfer pipeti kullanın ve okülomotor çekirdekleri ve gözleri içeren dilimi seçmek için floresan diseksiyon mikroskobunu kullanın. Steril bir transfer pipeti kullanarak, dilimi her kuyuda 1,5 mililitre kültür ortamı içeren altı kuyulu bir plakaya bir hücre kültürü eklemeye aktarın ve plakayı 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Vibratom aşamasından kalan agarose çıkarın ve sahne üzerine bir sonraki embriyo superglue, tüm embriyolar kesitli ve kaplama kadar dilimleri toplamaya devam.
Daha sonra her kuyunun orta sına uygun bir çözücü de seyreltilmiş, inhibitör veya rekombinant molekülün uygun konsantrasyonekleyin. Bir doz-yanıt eğrisi oluşturun. Dilimleri faz kontrastı ve floresan mikroskobuile her 30 dakikada bir 72 saate kadar görüntüleyin.
Utero gelişiminde normal süre boyunca, ilk yeşil floresan protein-pozitif okülomotor aksonların son hedeflerine ulaşmadan önce embriyonik gün 11.5 ile yörüngeye ulaşırlar, bu temsili dilim kültüründe gözlendiği gibi. Dilimin vibratom aşamasındaki yönü çok önemlidir, çünkü dilimler doğru yönlendirilemediklerinde yorumlanabilir değildir. Örneğin, embriyo yan yatırılırsa, dilim içinde sadece bir okülomotor çekirdeği gözlemlenir.
Gömülü embriyo sırtına doğru çok fazla eğilmişise, gözler dilim içinde mevcut olmaz, ve bunun yerine üst ekstremite ve arka beyin veya omurilik dahil edilebilir. Dilimin kültür zarına yerleştirilmesi sırasında dokunun katlanmamasını da göz önünde bulundurabiliriz. Organik çözücülerde inhibitörleri ve büyüme faktörlerini çözerken dikkatli olalım.
Örneğin, bu deneyde, dilim ortama etanol ilavesinden sonra öldü. Her şeyi buzda tutmayı ve embriyoların çıkarılması ile dilimleri kuvöze yerleştirme arasındaki süreyi en aza indirmeyi unutmayın. Bu tekniği kullanarak, oküler motor sisteminde iş yerinde ek akson yönlendirme mekanizmaları belirlemeye başladık.
Jiletlerle çalışırken dikkatli olmayı ve bazı inhibitörlerin tehlikeli olabileceğini ve güvenlik profillerine göre dikkatli bir şekilde ele alınması gerektiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, okülomotor sinir çıkışının gerçek zamanlı görüntülemesini sağlayan bir ex vivo dilim incelemesi sunmaktadır. Agaroz içine gömülü embriyolar kullanılarak, araştırma bu gelişim süreci sırasında akson yönlendirme yollarının rolünü araştırmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Akson Yönlendirme
Arka Plan
- Okülomotor sinir, göz hareketi ve görsel izleme için kritik öneme sahiptir.
- Akson yönlendirme yollarını anlamak, gelişimsel nörobiyoloji hakkında bilgiler için hayati öneme sahiptir.
- Bu teknik, yerel mikroçevreleri koruyarak gerçek zamanlı değerlendirmeye izin verir.
- Rejenerasyon yerine ilk akson çıkışı değerlendirilir.
Çalışmanın Amacı
- Okülomotor sinirdeki akson yönlendirme yollarını belirlemek.
- Sinir yolu boyunca farklı noktalarda rollerini değerlendirmek.
- Diğer sinir türlerine uygulanabilir bilgiler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Görüntüleme için agaroz içine gömülü embriyolar kullanan ex vivo dilim kültürü yöntemi.
- Biyolojik model, gelişmekte olan aksonların floresan etiketlemesini sağlayan E10.5 Isl MN:GFP embriyolarından oluşur.
- Metinde multiomics iş akışlarından bahsedilmemiştir.
- Ana adımlar, embriyoların dikkatli bir şekilde çıkarılmasını, agarozun katılaştırılmasını ve vibratom üzerinde hassas dilimlemeyi içerir.
- Kültür sonrası her 30 dakikada bir görüntüler, 72 saate kadar çekilir.
Ana Sonuçlar
- Gerçek zamanlı görüntüleme, akson yönlendirme mekanizmalarına ilişkin kritik bilgiler ortaya çıkarmaktadır.
- Akson çıkışı zaman dilimleri, ilk GFP-pozitif aksonların E11.5'e kadar hedeflerine ulaştığını göstermektedir.
- Dilimlerin yönlendirilmesi, sonuçların yorumlanabilirliğini doğrudan etkiler.
- Ek yönlendirme mekanizmalarının tanımlanması, oküler motor sistemi hakkındaki anlayışımızı geliştirir.
Sonuçlar
- Bu yöntem, okülomotor sinir gelişimi sırasında akson yönlendirmesinin detaylı bir şekilde keşfedilmesini sağlar.
- Sonuçlar, geçerli yorumlamalar için metodolojik hassasiyetin önemini vurgulamaktadır.
- Elde edilen bilgiler, sinir yönlendirmesi ve rejenerasyonu üzerine daha geniş çalışmalara bilgi verebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding axon guidance mechanisms is critical for target validation in neurodevelopmental disorders and neural repair strategies. This ex vivo slice culture method enables real-time assessment of axon outgrowth, supporting mechanistic de-risking of guidance pathway targets. By preserving the native microenvironment and allowing dynamic intervention testing, it improves predictive confidence in early target engagement studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on axon guidance pathways like CXCR4 signaling in ocular motor development.
- Operational Value: Enables functional target validation by assessing axon trajectory changes at defined developmental stages.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying guidance cues that affect specific axon subsets along their trajectory.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for dose-response screening of guidance molecules.
- Operational Value: Standardizes slice preparation and imaging for reproducible quantitative axon outgrowth measurements.
- Scalability: Supports platform reuse across nerve types with adaptable culture and inhibition protocols.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase axon guidance insights to preclinical models of neural development.
- Mechanistic De-risking: Clarifies pathway-specific effects on axon subsets, reducing ambiguity in target mechanism.
- Disease-Relevant System: Uses embryonic GFP-expressing neurons to model early neurodevelopmental processes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for neurodevelopmental targets requiring axon trajectory validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of guidance cues through real-time imaging of axon outgrowth in intact tissue.
- Screening: Enables assay readiness via standardized slice culture and time-lapse imaging for compound or protein screening.
- Analytics: Generates quantitative imaging readouts to compare axon trajectory under different guidance cue conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling developmental axon guidance relevant to neural repair.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying axon guidance across multiple neural systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target mechanism by visualizing axon guidance in real time without axotomy.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized embryo handling, slicing, and culture conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying stage-specific effects of guidance inhibitors on axon subsets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their influence on axon trajectory in native microenvironments.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection, agarose embedding, and vibratome sectioning.
- Dependent on fluorescence microscopy and stage-top incubator infrastructure for time-lapse imaging.
- Necessitates cross-team standardization for embryo handling, slice orientation, and culture timing.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different nerve types or developmental stages.
- Includes practical limitations such as slice orientation sensitivity and embryo viability constraints.
