Olomotor sinir gelişimi için zaman aşımı görüntüleme için embriyonik GFP-Ifade fareler dan ex vivo okülomotor dilim kültürü

Bu protokol bize okülomotor sinir aktif akson rehberlik yolları belirlemek ve gerçek zamanlı olarak sinir yörüngesi boyunca farklı noktalarda rollerini değerlendirmek için izin verir. Bu teknik, aksonların seyahat ettiği yerel ortamları ve nihai hedeflerini korur. Büyüyen aksonlar kesilmez, bu nedenle rejenerasyon yerine ilk akson büyüme, değerlendirilebilir.

Bu yöntem oküler motor sisteminde akson rehberlik içine anlayışlar sağlar ama diğer sinirlerin akson rehberlik çalışmasına adapte edilebilir. Bu teknik usta pratik alır ve hızlı bir şekilde çalışmak son derece önemlidir. İlk kez denerken, bir bütün çöp yerine sadece birkaç embriyo kullanın.

İşleme başlamadan önce, ilk embriyonik gün 10.5 zamanında bir miyeslik ultrason ile gebelik onaylamak. Hasat embriyolar,% 70 etanol ile hamile farenin karın sprey, ve rahim ayıklamak için karın boşluğu açmak için makas kullanın. Taze buz gibi HBSS ikinci bir Petri çanak içinde organ yerleştirmeden önce buz gibi HBSS bir Petri kabında rahim yıkayın.

Bir diseksiyon kapsamında, rahim boynuzu ve bireysel amniyotik keseler gelen embriyolar kaldırmak, 12-iyi plaka kapağının alt kısmında her embriyo yerleştirerek, buz üzerinde, onlar hasat olarak. Her embriyoyu çevreleyen sıvıyı, embriyoların kendilerine dokunmadan çıkarmak için filtre kağıdını kullanın ve embriyoları %4'lük düşük eriyen agarose sıvıya batırın. Agarose katılaşmak için buz üzerine plaka kapağı yerleştirin.

Agarose sertleştiğinde, embriyoları ters çevirin ve her numunenin diğer tarafını ilave agarose ile kapatın. Agarose'un ikinci cildi katılaşmış ken, her embriyonun vibratom sahnesinde düzgün bir şekilde yönlendirilen şekilde her embriyonun etrafındaki agarose'u kesmek için floresan parçalayıcı mikroskop kullanın. Okülomotor çekirdekleri ve erken akson outgrowths floresan olmalıdır.

Her embriyoyu, çekirdek, büyüyen aksonlar ve göz bir çizgi oluşturacak şekilde hizala ve agarose'u bu çizgiye paralel olarak kesmek için jilet kullanın. Daha sonra, vibratom odasını buz gibi dilim tamponuyla doldurun ve ilk embriyoyu vibratom aşamasına yapıştırın, böylece bıçak okülomotor çekirdeği ve gözleri ile paralel olacak. Yapıştırıcı kuruduğunda, vibratom evresini, embriyonun bıçaktan uzağa bakacak şekilde yönlendirilen bir şekilde batırın ve 400 ila 450 mikrometrelik dilimler elde etmek için yeni bir vibratome bıçağı kullanın.

Elde edildikçe her dilimi soğuk dilimleme tamponuna aktarmak için steril bir transfer pipeti kullanın ve okülomotor çekirdekleri ve gözleri içeren dilimi seçmek için floresan diseksiyon mikroskobunu kullanın. Steril bir transfer pipeti kullanarak, dilimi her kuyuda 1,5 mililitre kültür ortamı içeren altı kuyulu bir plakaya bir hücre kültürü eklemeye aktarın ve plakayı 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Vibratom aşamasından kalan agarose çıkarın ve sahne üzerine bir sonraki embriyo superglue, tüm embriyolar kesitli ve kaplama kadar dilimleri toplamaya devam.

Daha sonra her kuyunun orta sına uygun bir çözücü de seyreltilmiş, inhibitör veya rekombinant molekülün uygun konsantrasyonekleyin. Bir doz-yanıt eğrisi oluşturun. Dilimleri faz kontrastı ve floresan mikroskobuile her 30 dakikada bir 72 saate kadar görüntüleyin.

Utero gelişiminde normal süre boyunca, ilk yeşil floresan protein-pozitif okülomotor aksonların son hedeflerine ulaşmadan önce embriyonik gün 11.5 ile yörüngeye ulaşırlar, bu temsili dilim kültüründe gözlendiği gibi. Dilimin vibratom aşamasındaki yönü çok önemlidir, çünkü dilimler doğru yönlendirilemediklerinde yorumlanabilir değildir. Örneğin, embriyo yan yatırılırsa, dilim içinde sadece bir okülomotor çekirdeği gözlemlenir.

Gömülü embriyo sırtına doğru çok fazla eğilmişise, gözler dilim içinde mevcut olmaz, ve bunun yerine üst ekstremite ve arka beyin veya omurilik dahil edilebilir. Dilimin kültür zarına yerleştirilmesi sırasında dokunun katlanmamasını da göz önünde bulundurabiliriz. Organik çözücülerde inhibitörleri ve büyüme faktörlerini çözerken dikkatli olalım.

Örneğin, bu deneyde, dilim ortama etanol ilavesinden sonra öldü. Her şeyi buzda tutmayı ve embriyoların çıkarılması ile dilimleri kuvöze yerleştirme arasındaki süreyi en aza indirmeyi unutmayın. Bu tekniği kullanarak, oküler motor sisteminde iş yerinde ek akson yönlendirme mekanizmaları belirlemeye başladık.

Jiletlerle çalışırken dikkatli olmayı ve bazı inhibitörlerin tehlikeli olabileceğini ve güvenlik profillerine göre dikkatli bir şekilde ele alınması gerektiğini unutmayın.