Name: Olomotor sinir gelişimi için zaman aşımı görüntüleme için embriyonik GFP-Ifade fareler dan ex vivo okülomotor dilim kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Öğrenin oküomotor sinir gelişiminde akson yönlendirme yollarını gerçek zamanlı görüntülemek için ekz vivo dilim kültürü yöntemini. GFP ifadeli fare embriyoları kullanılarak sinir büyümesi incelenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansman Ulusal göz Enstitüsü tarafından sağlanan [5K08EY027850], çocuk sağlığı ve gelişimi Ulusal Enstitüsü [U54HD090255], Harvard-Vision klinik bilim adamı geliştirme programı [5K12EY016335], şövalyeler göz Vakfı [kariyer Starter Grant] ve Çocuk Hastanesi Oftalmoloji Vakfı [Fakülte keşif Ödülü]. ECE, Howard Hughes Tıp Enstitüsü müfettişi.

Burada anlatılan tüm hayvan çalışmaları Boston Çocuk Hastanesi kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıanuc) protokollerine uygun olarak onaylandı ve gerçekleştirildi.
1. zamanlanmış matings
<ol><li>Yer ISLMN: Gfp (Islet motor neuron yeşil floresan protein; MGı: J:132726; Jax TG (ISL-EGFP *) 1Slp/J stok No: 017952) erkek ve kadın fareler birlikte bir gecede. Kadın ve kayıt ağırlıkları çiftleşme önce tartmak. Not: ISLMN: Gfp özellikle bir farnesylated Gfp ile motor nöronları Etiketler sitotoksisik değil, motor nöronlar ve akons hücre membranı yerelleştirir, ve sinirler geliştirme sırasında görselleştirilmesini sağlar25. Diğer Floresan etiketli çizgiler de kullanılabilir.</li>
	<li>Sabah erken saatlerde vajinal fişleri kontrol edin. Bir fiş tanımlandığında Tarih E 0.5 olarak belirlenir.</li>
	<li>Gebelik kilo artışı ve/veya ultrason E 10.5 kullanarak onaylayın. Hamile barajlar en az 1 g elde edilmelidir. embriyolar E 10.5 ultrasonda görülebilir.</li>
</ol>2. dilim kültürü için reaktiflerin ve vibratomun hazırlanması
<ol><li>Hazırlamak 500 mL Dilimleme tampon: 5 ml HEPES ve 5 mL penisilin/streptomisin-500 mL Hank 'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) olmadan CA2 + ve mg2 +ekleyin.  Chill 4 °C ' ye kadar. Not: ekstra Dilimleme tamponu 4 °C ' de depolanmalı ve gelecekteki dilim kültürü deneyleri için kullanılabilir.</li>
	<li>Hazırlamak 50 mL Kültür Medya: steril bir kaput, eklemek 12,5 mL HBSS, 12,5 mL fetal sığır serumu, 250 μL glikoz, 250 μL-glutamin, 125 μL HEPES için 24,4 mL Fluorobright DMEM. (Final konsantrasyonları:% 25 HBSS,% 25 FBS, 0,5% glikoz, 1 mM glutamin ve 2,5 mM HEPES ile FlouroBright DMEM.).  Steril su banyosunda 37 °C ' ye kadar kültür medyasını ısıtın. Not: kültür ortamı 3 haftaya kadar 4 °C ' de depolanabilir.<ol>
<li>Steril bir kaput, eklemek 1,5 mL Kültür medya her iyi bir 6-kuyu plaka.  Her iyi bir hücre kültürü eklemek (malzeme tablosu) ekleyin.  Steril 37 °C ve% 5 CO2 inküvatör yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hazırlamak 4% düşük erime sıcaklık agaroz: çözünür 2 g düşük erime sıcaklık agaroz 50 ml steril PBS. Tam olarak çözülene kadar 30-60 s aralıklarla mikrodalga. Sıvı tutmak için 40 °C ' lik su banyosuna yerleştirin. Not: ekstra agaroz oda sıcaklığında (RT) saklanabilir ve gelecekteki dilim kültürü deneyleri için eritilebilir.</li>
	<li>Vibratome ayarlayın: vibratome üzerinde yeni bir bıçak yerleştirin. Kontrol ayarları: kalınlık 400-450 μm. vibratome aşamasını ön Chill. Dış odaya biraz buz koyun. Canlı dilimlere adanmış bir oda ve sahne kullanın. Kalan fiktatif dilimlere zarar verebilir gibi sabit doku için aynı vibratome odası kullanmayın.</li>
	<li>Mikroskop sahne üst kuluçta 37 °C ve 5% CO2hazırlayın.</li>
	<li>Diseksiyon için hazırlanın:% 70 etanol ile temiz cerrahi aletler ve sprey. HBSS ile iki Petri yemekleri doldurun, buzun üzerine yerleştirin. 12 iyi doku kültürü plakası açın ve alt tarafı yukarı bakacak şekilde buzun üzerine kapağı yerleştirin. Açık bir 6 iyi doku kültürü plaka ve yer hücre kültürü membran ekler ve 1,5 mL hücre kültürü medya her iyi. 37 °C ve% 5 CO2 kuluçte plakayı önceden ısıtın.</li>
</ol>3. E 10.5 embriyo toplama ve dilim hazırlama
Not: Bu noktadan gelen tüm adımlar mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. Embriyoları her zaman buzda tutun.
<ol><li>Bir CO2 odasında hamile Barajı (e 10.5) ötenize. Servikal dislocation gerçekleştirin.</li>
	<li>% 70 etanol ile karın sprey. Makas ile karın açık kes, rahim kaldırmak ve hızlı bir şekilde kan yıkamak için buz soğuk HBSS ile bir petri çanak yerleştirin. Yıkanabilir rahim, çanak buz soğuk HBSS ile dolu ikinci bir petri taşıyın.</li>
	<li>Bir diseksiyon kapsamı altında, uterus boynuz ve bireysel amonoz saclar embriyoları çıkarın. Embriyoları 12 kuyu plakasının kapağının alt tarafına yerleştirin. Buzdan devam et.</li>
	<li>Bir diseksiyon kapsamı altında, her embriyo çevreleyen herhangi bir sıvı kaldırmak için filtre kağıdı kullanın. Not: embriyolar dokunulduğunda filtre kağıdına yapışacaktır.</li>
	<li>Agarose 'de embriyo ekleyin. Onu kapsayacak şekilde her embriyo üzerinde eritilmiş agaroz dökün. Buzdan devam et. Agaroz sertleşmiş olarak, her embriyo çevirmek ve diğer tarafta ek agaroz dökün. Buzdan devam et.</li>
	<li>Floresan diseksiyon kapsamı kullanarak, her bir embriyo etrafında agaroz trim böylece düzgün vibratome aşamaya yapıştırılmış olarak yönlendirilmiş olacak. Okülomotor çekirdeği ve erken Aksiyon büyüme floresan vardır. Embriyo, çekirdek, büyüyen akons ve göz bir çizgi şeklinde hizalayın ve bu satıra paralel bir jilet kesme ile agaroz Trim (embriyo için dorsal, bkz: Şekil 1a). Not: Bu, vibratome aşamasına yapıştırılan yan olacaktır (embriyo sırtına yerleştirilecektir, vibratome bıçağına en yakın kafa). Okülomotor çekirdeği ile göz arasındaki bir çizgi, vibratom bıçağının paralel olması gerekir.</li>
	<li>Vibratome odasını buz soğuk dilim tampon ile doldurun. Vibratome aşamaya embriyo superglue böylece bıçak okülomotor çekirdeği ve gözleri ile paralel olacaktır. Süper Tutkal kuru olduktan sonra, vibratome aşamasını daldırın, böylece embriyo bıçağdan uzağa dönük olarak yönlendirilir.</li>
	<li>Dilim 400-450 μm dilim.  Her dilimi steril bir transfer pipet ile toplayın. Soğuk Dilimleme tamponunun içine yerleştirin.</li>
	<li>Diseksiyon kapsamı altında, okülomotor çekirdekleri ve gözleri içeren dilim seçin. Steril bir transfer pipet kullanarak, 6 kuyu plakası hücre kültürü eklemek üzerine yerleştirin. Plakayı 37 °C ' lik kuluçağa geri dönün. Alternatif olarak, bir kişi Dilimleme ve başka bir dilim yerleştirerek var. Dilimleme ve kuluçt içine yerleştirme arasındaki süreyi minimize. Not: dilimler, çekirdekten ve akonlardan yayılan maksimum floresan görüntü mikroskop hedefe en yakın şekilde yönlendirilmelidir. Ters bir mikroskop üzerinde, dilim plakanın altındaki amaca en yakın çekirdekler ve akonlar ile membran üzerine yerleştirilmelidir.</li>
	<li>Vibratome aşamasından kalan agaroz çıkarın, sonraki embriyo sahneye yapıştırıcı ve tüm embriyolar dilimlenmiş ve kaplama kadar 3.7-3.9 adımları tekrarlayın.</li>
	<li>Her iyi bir doz-yanıt eğrisi oluşturmak için medya tercih inhibitörü veya rekombinant molekül ekleyin.  Uygun solvent içinde seyreltmeli. Not: DMSO kullanıyorsanız, yalnızca doku kültürü Grade DMSO kullanın. Alternatif olarak, protein-eluting boncuklar dilim üzerinde belirli yerlerde yerleştirilebilir.</li>
	<li>37 °C ve% 5 CO2 odasına mikroskop üzerine yerleştirin.  Her dilim her dilimin faz kontrast ve floresan fotoğraf almak için mikroskop ayarlayın her 30 dakika (veya daha sık istenirse). Dilim 48-72 h için muhafaza edilebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Whitman, M. C., Engle, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+congenital+cranial+dysinnervation+disorders+%28CCDDs%29%3A+insights+into+axon+growth+and+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance.</a> Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).</li>
<li>Giger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-2+is+required+in+vivo+for+selective+axon+guidance+responses+to+secreted+semaphorins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins.</a> Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-2+regulates+the+development+of+selective+cranial+and+sensory+nerves+and+hippocampal+mossy+fiber+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections.</a> Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).</li>
<li>Lerner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-derived+factor-1+and+hepatocyte+growth+factor+guide+axon+projections+to+the+extraocular+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles.</a> Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).</li>
<li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CFEOM1+mutations+attenuate+KIF21A+autoinhibition+and+cause+oculomotor+axon+stalling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling.</a> Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).</li>
<li>Tischfield, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+TUBB3+mutations+perturb+microtubule+dynamics%2C+kinesin+interactions%2C+and+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance.</a> Cell. 140 (1), 74-87 (2010).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+cell+bodies+are+actively+positioned+by+Slit%2FRobo+repulsion+and+Netrin%2FDCC+attraction%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction.</a> Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).</li>
<li>Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+and+In+Vitro+Knockdown+Approaches+in+the+Avian+Embryo+as+a+Means+to+Study+Semaphorin+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling.</a> Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).</li>
<li>Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha2-Chimaerin+regulates+a+key+axon+guidance+transition+during+development+of+the+oculomotor+projection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).</li>
<li>Ferrario, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+guidance+in+the+developing+ocular+motor+system+and+Duane+retraction+syndrome+depends+on+Semaphorin+signaling+via+alpha2-chimaerin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).</li>
<li>Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+axonal+guidance+with+microdevice-based+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).</li>
<li>Ebendal, T., Jacobson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+explants+affecting+extension+and+orientation+of+axons+in+cultured+chick+embryo+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia.</a> Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).</li>
<li>Dazert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+delivery+of+fibroblast+growth+factor-1+by+transfected+cells+induces+spiral+ganglion+neurite+targeting+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro.</a> Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).</li>
<li>Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoidance+of+posterior+tectal+membranes+by+temporal+retinal+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons.</a> Development. 101 (4), 909-913 (1987).</li>
<li>Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assay+to+test+differential+substrate+affinities+of+growing+axons+and+migratory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells.</a> Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).</li>
<li>Joanne Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+turning+assay+reveals+complex+growth+cone+responses+to+integrated+gradients+of+substrate-bound+ECM+molecules+and+diffusible+guidance+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues.</a> Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).</li>
<li>Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reusable+microfluidic+plate+with+alternate-choice+architecture+for+assessing+growth+preference+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture.</a> Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).</li>
<li>Keenan, T. M., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+gradients+in+cell+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Biomolecular gradients in cell culture systems.</a> Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).</li>
<li>Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tangential+migration+in+neocortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tangential migration in neocortical development.</a> Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).</li>
<li>Miquelajauregui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIM-homeobox+gene+Lhx5+is+required+for+normal+development+of+Cajal-Retzius+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).</li>
<li>Garcia-Pena, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurophilic+Descending+Migration+of+Dorsal+Midbrain+Neurons+Into+the+Hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroanatomy%22%5BJournal%5D)">Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96(2018).</li>
<li>Ngo-Muller, V., Muneoka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+exo+utero+surgery+on+rodent+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">In utero and exo utero surgery on rodent embryos.</a> Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).</li>
<li>Whitman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CXCR4%2FCXCL12+Signaling+Causes+Oculomotor+Nerve+Misrouting+and+Development+of+Motor+Trigeminal+to+Oculomotor+Synkinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).</li>
<li>Brachmann, I., Tucker, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+of+GFP-expressing+mouse+embryos+for+real-time+imaging+of+peripheral+nerve+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309(2011).</li>
<li>Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin+ligase+Phr1+regulates+axon+outgrowth+through+modulation+of+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics.</a> Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).</li>
<li>Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+tract+formation+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Initial tract formation in the mouse brain.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).</li>
<li>Michalak, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+Motor+Nerve+Development+in+the+Presence+and+Absence+of+Extraocular+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).</li>
<li>Lewellis, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+SDF1-mediated+cell+guidance+is+achieved+through+ligand+clearance+and+microRNA-mediated+decay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay.</a> The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).</li>
<li>Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+axon+guidance%3A+are+we+nearly+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Understanding axon guidance: are we nearly there yet.</a> Development. 145 (10), (2018).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Bu ex vivo dilim kültür Protokolü geleneksel Akon rehberlik üzerinde önemli avantajlar sağlar23diyor. Her kranial motor çekirdeğin büyüklüğü sınırlayıcı bir faktör değildir ve zor bir diseksiyon gereklidir. Akons seyahat korunur endojen mikroçevre, diğer sinyalizasyon yolları korurken bir sinyal yolu modifikasyonu sağlar. Ayrıca, efektler Akon yörünge boyunca farklı noktalarda değerlendirilebilir. Axon rehberlik birden fazla ipuçları ve ipuçları kombinasyonları, yol29boyunc...

Oküler motor sistemi, Akon rehberlik mekanizmalarını araştırmak için zarif bir sistem sağlar. Bu nispeten karmaşık değildir, üç kraniyal sinirler altı olağanüstü kasları innerve oluşan (eoms) hangi göz hareket, ve levator palpebrae Superioris (LPS) hangi göz kapağı kaldırır. Okülomotor sinir LPS ve dört EOMs innervates-inferior eğik ve medial, inferior, ve üstün rekus kasları. Diğer iki sinirler, trochleer ve kaçırır, her biri sadece bir kas, üstün eğik ve lateral rekus kası, sırasıyla inler. Göz hareketleri, innervasyon uygun, eksik veya aberrant olup olmadığını gösteren, kolay bir okuma sağlar. Ayrıca, nöronal gelişim veya Akon rehberliğinde eksiklikleri sonucu insan gözü hareket bozuklukları vardır, topluca konjenital kranial disinnervasyon bozuklukları (CCDDs)1olarak adlandırılır.
Bu avantajları rağmen, oküler motor sistemi nadiren Axon rehberlik çalışmaları kullanılır2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10, teknik dezavantajları nedeniyle. In vitro Axon rehberlik birçok dezavantajları11olduğunu gösteriyor. Co-kültür, hangi nöronal Method birlikte hedef doku (12 veya transfekte hücreler13, eksplant hem simetri ve eksplant ve hedef doku arasında kesin konumlandırma bağlı olarak kültürsüz olduğunu gösteriyor. Stripe,14,15, hangi iki ipuçlarını değişen çizgili ve akons bir şerit üzerinde Tercihli büyüme için değerlendirilir, sadece bir substrat diğer için tercih edilir, ya da çekici olduğunu gösterir veya fizyolojik olarak ilgilidir. Microfluidics Chambers kesin kimyasal degradeler oluşturabilir, ama konu büyüyen akons kesme stres16,17,18, hangi büyümesini etkileyebilir. Dahası, bu yaklaşımların her birinde, Method veya ayrışmış hücrelerin toplanması, büyüyen akbitlerin axotomize edilmesi ve bu nedenle, ilk Aksiyon büyümesi yerine Axon rejenerasyonunu incelemenizi gerektirir. Son olarak, bu in vitro yaklaşımlar akons ve onların ders farklı noktalar boyunca ipuçlarına tepkiler etkiler mikroçevre kaldırmak ve geleneksel olarak sadece yalıtım bir işaret test. Bu dezavantajları compounding, oküler motor sisteminde her çekirdeğin küçük boyutu diseksiyon teknik ya Method veya Disosiye kültürler için zorlu yapar. Ayrıca, oküler motor nöronların primer kültürler genellikle heterojen, önemli hücre ölümü var, ve yoğunluk bağımlıdır, birden fazla embriyodan hücrelerin havuzu gerektiren (Ryosuki Fujiki, kişisel iletişim). In vivo yöntemleri, ancak, nakavt fare modelleri de dahil olmak üzere, tarama için kullanmak için uygunsuz, zaman ve masraf gerekli verilen.
Tüm embriyolar kültür için geliştirilen yöntemleri19 göç hücrelerin etiketleme izin20 veya belirli moleküllerin blokajı21, ancak tüm embriyo kültürler etiketli gerçek zamanlı görüntüleme engelleyen silindir şişeleri kuluçlan gerektirir Yapı. Embriyonun manipülasyonuna izin veren cerrahi teknikler ve sonra da uterusa veya annenin karında (plasental bağlantının korunması)22 de mümkündür, ancak bu da zaman atlamalı izin vermez Görüntüleme.
İn vitro asdların engelleri aşmak ve sinyalizasyon yollarının hızlı taramasına izin vermek için, bir ex vivo Embriyonik dilim kültürü tekniği geliştirilen23, periferik sinir gelişimi için daha önce yayımlanan bir protokol adapte24. Bu protokolü kullanarak, gelişmekte olan okülomotor siniri, EOM hedefleri de dahil olmak üzere yörüngesi boyunca çevreleyen yapıların çoğunun varlığında zamanla görüntülenmiş olabilir. Kültür ortamına küçük molekül inhibitörleri, büyüme faktörleri veya rehberlik ipuçları ekleyerek, Aksiyon yörünge boyunca birden fazla noktadan rehberlik perturbations değerlendirebiliriz, potansiyel büyüme ve rehberlik faktörleri daha hızlı değerlendirilmesi sağlar.

<table><tbody><tr><td>24 Kuyulu Doku Kültürü Plakası</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>6 Kuyulu Doku Kültürü Plakası</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Pastör Pipeti (Çakmaktaşı Cam)</td><td>VWR</td><td>14672-200</td><td></td></tr><tr><td>İnce Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11412-11</td><td></td></tr><tr><td>Florobrit DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz (200 g/L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (1X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Isıyla İnaktive Fetal Sığır</td><td>Serumu Atlanta Biologicals</td><td>S11550H</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Tampon Çözeltisi (1M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (250 nM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Loctite Süper Yapıştırıcı</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Düşük Erime Noktalı Agaroz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Milicell Hücre Kültürü Eki (30mm, hidrofilik PTFE, 0.4 um)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Moria Mini Delikli Kaşık</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10370-19</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin (10.000 U / mL)</td> <td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>15140122&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petri Kabı (100 x 15mm)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-107G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (1X, pH 7.4)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş Bıçağı</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Makas - Künt</td><td>İnce Bilim Araçları</td><td>14000-12</td><td></td></tr><tr><td>Ti Eclipse TIRF</td><td>Nikon</td><td></td><td></td> ile Mükemmel Odak</tr><tr><td>Vibratom (VT 1200S)</td><td>Leica</td><td>1491200S001</td><td></td></tr><tr><td>Vibratom Bıçakları (Çift Kenarlı, Paslanmaz Çelik)</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>121-6</td><td></td></tr></tbody></table>

olomotor sinir gelişimi için zaman aşımı görüntüleme için embriyonik gfp-ifade fareler dan ex vivo okülomotor dilim kültürü

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Doğru göz hareketleri görme için çok önemlidir, ancak özellikle Akon rehberliğini kontrol eden moleküler yollar olan oküler motor sisteminin gelişimi tamamen elükidated değildir. Bu kısmen geleneksel Akon rehberlik özellikleri teknik sınırlamaları kaynaklanmaktadır. Okülomotor sinirini etkileyen ek Akon rehberlik ipuçlarını belirlemek için, bir ex vivo dilim tahlil gerçek zamanlı olarak okülomotor sinir görüntü için göz doğru büyüdükçe gelişti. E 10.5 ISLMN-Gfp embriyoları agarose içine katıştırarak ex vivo dilimleri oluşturmak için kullanılır, bir vibratome üzerinde dilimleme, daha sonra 24-72 h için zaman atlamalı photomikroskopisi ile bir mikroskop sahne-üst inküdosu onları büyüyen. kontrol dilimleri yeniden apitüle çekirdeğden yörüngeye kadar akonların gelişiminin in vivo zamanlaması. Farklı Akon rehberlik yollarının rolünü değerlendirmek için kültür medyasında küçük molekül inhibitörleri veya rekombinant proteinler eklenebilir. Bu yöntem, akons geçiş, büyüyen akons axotomizing değil, ve onların yörünge boyunca birden fazla puan içinde akons değerlendirmek yerel mikroçevre daha fazla bakımını avantajları vardır. Ayrıca, akons belirli alt kümeleri üzerindeki efektleri belirleyebilir. Örneğin, CXCR4 inhibisyonu orta beyin içinde hala dorsal yerine ventriketten büyümek için aksonlar neden olur, ama zaten ventriketden çıkıldı akons etkilenmez.

Normal sonuçlar: Şekil 1 denemenin şematiği sağlar. Fare E 9.5 kadar erken başlayarak, ilk akons okülomotor çekirdeği26ortaya çıkmaya başlar. E 10.5, erken öncü nöronlar içeren bir fascikulated okülomotor sinir, mezenyme görülebilir. Orada E 10.5 embriyolar arasında önemli değişkenlik vardır (hatta aynı çöp içinde) ne kadar sinir yörüngeye doğru ilerlemiştir, birkaç saat gelişimsel farklılıklar nedeniyle büyük olasılıkla. Utero gelişiminde normal sırasında, I...

Bir ex vivo dilim tahlil gerçek zamanlı olarak görüntülenmiş olmak okülomotor sinir büyüme sağlar. Dilim E 10.5 ISLMN katıştırarak oluşturulur: agarose 'de Gfp embriyolar, bir vibratom üzerinde dilimleme, ve bir aşama-üst kuluçç büyüyen. Axon rehberlik yollarının rolü, kültür ortamına inhibitörler ekleyerek değerlendirilir.

Olomotor sinir gelişimi için zaman aşımı görüntüleme için embriyonik GFP-Ifade fareler dan ex vivo okülomotor dilim kültürü

Accurate eye movements are crucial for vision, but the development of the ocular motor system, especially the molecular pathways controlling axon ...

Bu protokol bize okülomotor sinir aktif akson rehberlik yolları belirlemek ve gerçek zamanlı olarak sinir yörüngesi boyunca farklı noktalarda rollerini değerlendirmek için izin verir. Bu teknik, aksonların seyahat ettiği yerel ortamları ve nihai hedeflerini korur. Büyüyen aksonlar kesilmez, bu nedenle rejenerasyon yerine ilk akson büyüme, değerlendirilebilir.Bu yöntem oküler motor sisteminde akson rehberlik içine anlayışlar sağlar ama diğer sinirlerin akson rehberlik çalışmasına adapte edilebilir. Bu teknik usta pratik alır ve hızlı bir şekilde çalışmak son derece önemlidir. İlk kez denerken, bir bütün çöp yerine sadece birkaç embriyo kullanın.İşleme başlamadan önce, ilk embriyonik gün 10.5 zamanında bir miyeslik ultrason ile gebelik onaylamak. Hasat embriyolar,% 70 etanol ile hamile farenin karın sprey, ve rahim ayıklamak için karın boşluğu açmak için makas kullanın. Taze buz gibi HBSS ikinci bir Petri çanak içinde organ yerleştirmeden önce buz gibi HBSS bir Petri kabında rahim yıkayın.Bir diseksiyon kapsamında, rahim boynuzu ve bireysel amniyotik keseler gelen embriyolar kaldırmak, 12-iyi plaka kapağının alt kısmında her embriyo yerleştirerek, buz üzerinde, onlar hasat olarak. He

ex-vivo-oculomotor-slice-culture-from-embryonic-gfp-expressing-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz periferik sinir akıbet ekimi ve zaman atlamalı görüntüleme için gebeliğin orta fare embriyo Organotipik dilim hazırlamak için bir yöntem mevcut.

Organotipik Dilim Kültür GFP-Periferik Sinir akıbet Gerçek zamanlı Görüntüleme Fare Embriyolar ifade

Bu protokol, postnatal beyin ve rostral göçmen akışı neuroblast göç yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı görüntüleme için optimize edilmiş bir Organotipik dilim tahlil açıklamaktadır.

Doğum Sonrası Beyin Nöronal Göç Yüksek Çözünürlüklü Zaman Aşımı Görüntüleme için bir Organotipik Dilim Testi

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

Video, transgenik bir fare embriyosundan okülomotor, troklear ve spinal motor nöronların izolasyonunu göstermektedir. Embriyo, kolay görselleştirme ve tanımlama için yeşil bir floresan proteini (GFP) ile etiketlenmiş motor nöronları eksprese eder. Motor nöronlar bir floresan mikroskobu altında cerrahi olarak izole edilir ve bir kültür ortamında tutulur.

Bir Fare Embriyosundan Okülomotor, Troklear ve Spinal Motor Nöronların İzolasyonu ve Kültürü

Bu video, transgenik fare embriyolarından alınan okülomotor dilimlerin ex vivo kültürünü ve görüntülemesini göstermektedir. Embriyolar izole edilir ve agaroza gömülür. Bir vibratom kullanılarak, okülomotor çekirdekleri ve gözleri içeren dilimler elde edilir. Dilimler kültürde tutulur ve bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntülenir.

Transgenik Fare Embriyolarından Okülomotor Kesitlerin Ex Vivo Kültürü ve Görüntülenmesi

Kaynak: Wiegreffe, C., et. al.,  {{}}In Utero Elektroporasyon. J. Vis. Uzm. {{TAG_ 44}} (2017) Bu video, transdüksiyonlu fare embriyonik beyin dilimlerinde radyal glial iskeleler yoluyla subventriküler bölgeden kortikal plakaya kortikal nöron radyal göçünü gözlemlemek için hızlandırılmış konfokal mikroskopiyi göstermektedir.

Transdüksiyonlu Fare Embriyonik Beyin Dilimlerinde Kortikal Nöron Radyal Migrasyonunun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Ön beyin ve beyincik dilim kültür sistemini kullanarak NG2 hücrelerini ve oligodendrositleri incelemek için bir teknik açıklanmıştır.  Bu yöntem, doku sitomimarisini korurken hücre dışı ortamın kolayca manipüle edilebildiği oligodendrosit soyu içindeki hücrelerin çoğalma ve farklılaşma dinamiklerinin incelenmesine izin verir.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

Bu protokol, radyal olarak göç eden kortikal nöronların doğrudan gözlenmesi için talimatlar sağlar. N utero elektroporasyonda, organotipik dilim kültürü ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme, göç eden nöronlardaki ilgi genlerinin aşırı ekspresyonunun veya downregülasyonunun etkilerini doğrudan ve dinamik olarak incelemek ve gelişme sırasındaki farklılaşmalarını analiz etmek için birleştirilir.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

Burada, electroporated beyin organotypic dilim kültürler fare embriyo confocal mikroskobu ve canlı görüntüleme teknikleri için uygun oluşturmak için düşük maliyetli ve güvenilir bir yöntem sağlamak.

Eski Utero Elektroporasyon ve embriyonik fare beyni canlı görüntüleme, GABAergic Interneurons geçiş için Organotypic dilim kültürleri

Bu protokol, in situ akson büyümesi ve büyüme konisi dinamiklerini incelemek için basit ve sağlam bir yöntem göstermektedir. Fizyolojik olarak ilgili akut beyin dilimlerinin ex vivo olarak nasıl hazırlanacağını açıklar ve kullanıcı dostu bir analiz boru hattı sağlar.

Yerinde Akut Ex Vivo Embriyonik Beyin Dilimi Kültürlerinde Akson Büyümesi ve Büyüme Koni Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Serebral korteksin gelişimi sırasında, nöronlar ve glial hücreler ventrikülü kaplayan ventriküler bölgeden kaynaklanır ve beyin yüzeyine doğru göç eder. Bu süreçte birçok gen yer alır. Bu protokol, göç eden nöronların ve glial progenitörlerin hızlandırılmış görüntüleme tekniğini tanıtır.

Embriyonik Fare Beyin Dilimlerinde Göç Eden Nöronların ve Glial Progenitörlerin Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Öğrenin oküomotor sinir gelişiminde akson yönlendirme yollarını gerçek zamanlı görüntülemek için ekz vivo dilim kültürü yöntemini. GFP ifadeli fare embriyoları kullanılarak sinir büyümesi incelenir.

Olomotor sinir gelişimi için zaman aşımı görüntüleme için embriyonik GFP-Ifade fareler dan ex vivo okülomotor dilim kültürü

Daha fazla video keşfet