Probuelektrosprey Iyonizasyon Kütle Spektrometresi için Örnek Hazırlama
19 Şubat 2020
Bu makalede, ortam kütle spektrometresi dayalı benzersiz bir gerçek zamanlı analitik yöntem için örnek hazırlama yöntemleri tanıtılmaktadır. Bu yöntem, herhangi bir özel ön işlem olmadan in vivo biyolojik moleküllerin gerçek zamanlı analizini yapmamızı sağlar.
Yani, bu eşsiz ortam kütle spektrometresi, özellikle biyolojik numuneleri analiz etmek için uygundur, hem in vitro hem de in vivo. Bu, hücre ayrışdırma, fraksiyon ve konsantrasyon gibi numunelerin düzenli olarak özel bir ön muamelesigerektirmediği için, en az biyolojik bileşen kaybı olan bir numuneyi, özellikle de çok az miktarda bulunannumuneyi analiz edebilir. Bu teknik, kütle spektrometresi ile ham doku maddelerini doğrudan bir dakika içinde analiz etmenizi sağlar.
Bu tekniğin doğasında olan başlıca avantajları olan sistemin sağlamlığında hızlılık engeldeğildir. Yapmanız gereken tek şey sadece silika hazırlamak için, dokuların örnek 10 miligram, ve çoğalır 10 mikrolitre. Ve onları tek kullanımlık kartuşa koyun.
Bu PESI-MS makine ayarlanır ve birkaç dakika içinde sonuç alırsınız. Uygun kütle spektrometresini seçerek moleküler kimliğe açıklama ekleyebilirsiniz. Başlamak için, dondurucudan karaciğer veya böbrek dokusunu alın.
Bir mantar plakası üzerinde, bir neşter veya bıçak kullanarak doku örneğini yaklaşık ikişer ikişer ikimilimetre ye kesin. Alternatif olarak, Trepan ile örnek dışarı yumruk ve iki milimetre sütunun uzunluğu kırpma. Doku kan ile kontamine ise, buz gibi fosfat tamponlu tuzlu ile kısa bir süre yıkayın.
Plastik bir mikrotüp içine kesilmiş veya delinmiş örnek yaklaşık 10 miligram yerleştirin ve% 50 etanol 100 mikrolitre ekleyin. Numuneyi homojenize etmek için bir mikroteksle kullanın. Sonra pipetman ile, kütle spektrometre kartuş kuyusuna homojen 10 mikrolitre yerleştirin.
Kartuşun doğrudan prob iyonizasyon kütle spektrometresinin iyonizasyon odasına yerleştirin ve numune iyonizasyonu için kullanılacak paslanmaz çalma iğne sondasını tökezle. Güvenlik cihazını otomatik olarak etkinleştirmek için oda kapağını sıkıca kapatın. Analiz etmek için start simgesine tıklayarak yerleşik bilgisayarı başlatın, ekrandaki panelleri kullanarak, elektrospreyi oluşturmak ve iğnenin frekansının üç hertz olduğundan emin olmak için iğneye 2,3 kilovoltluk bir voltaj uygulayın.
Ölçümün tamamlanması için 30 saniye bekleyin. Her numuneyi ölçtükten sonra, kartuş ve iğneyi biyolojik tehlike bertaraf layıcıya atın. Kütle spektrumlarını analiz etmek için, kütle spektrometresi ile ilişkili yazılımı açın.
Yazılımın veri dosyası tarayıcı penceresindeki L-C-D dosyasına tıklayın. Kitle spektrum penceresinin tek bir tepe noktasına tıklayın ve otomatik olarak bir E-I-C tasvir etmek için. T-I-C ve E-I-C'yi kontrol edin ve kütle spektrumu oluşturmak için zaman aralığını seçmek için ortalama spektrum simgesine tıklayın.
Kütle spektral metin verilerini dışa aktarın. Vücut sıvılarını analiz etmek için, serum örneğinden 10 mikrolitreye kadar çekin ve 1,5 mililitrelik bir mikrotüp içine verin. Tüpe 190 mikrolitre %50 etanol ekleyin, sonra oda sıcaklığında iki dakika girdap.
Tüm kırmızı kan hücrelerini ortadan kaldırmak için, sıvıyı 15,000 kez G'de santrifüj edin ve 4 santigrat derecede 1-5 dakika bekleyin. Süpernatantın 10 mikrolitresini kartuşun kuyuya aktarın ve daha önce olduğu gibi kütle spektrometresini ölçmeye devam edin. Bu protokol, katı numune, sıvı numune ve canlı hayvan üzerinde PESI-MS için numune hazırlama gösterir.
İnsan renal hücreli karsinom nötr lipidlerin karakteristik zirvelerini gösterir. Spektrumlarda, insan renal hücreli karsinom dokusundan 900'ün kütle-şarj oranında nispeten güçlü zirveler vardı ve bu oran çevredeki kanserli olmayan dokuda tanımlanamadı. Bu zirveler esas triasil gliserol temsil eder.
Normal karaciğer dokularında elde edilen verilere örnek olarak kronik hepatit ve karaciğer sirozu olan bir hastadan alınan neoplastik lezyon gösterilmiştir. Üç kişiden alınan insan serumu PESI-MS kullanılarak incelendi, bireyler arasında spektral desenlerde belirgin farklılıklar vardı. Bir farenin kuyruk damarına intravenöz olarak enjekte edilen 5-FdU'daki metabolik değişiklikler için, 5-FdU'nun sodyum addüktüile çok hızlı ve hassas tespiti karaciğerde yerinde sağlandı.
Doku bölgesinden iğne ucu derinliği olarak, başarılı veri toplama okur iyonizasyon en önemli rol oynar, talimatları takip emin olun. Ticari veritabanına bakarak moleküler türleri tanımlayabilirsiniz. Bu hastalığın moleküler mekanizması nitelemek için bir yoldur.
Birçok araştırmacı hastalığın refah tahmin etmek için bu tekniğin uygulanması ilgi haline gelmiştir ve prognoz' s. Özellikle raşitizm biyopsisi kullanarak. Sonda iğnesi tarafından iğnelenmediğinden emin ol.
Bu sadece makineden iğne kaldırmak için belirli bir alet ile önlenebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, biyolojik örneklerin in vivo gerçek zamanlı analizi için özgün bir ortam kütle spektrometrisi yöntemini tanıtmaktadır. Bu teknik, biyolojik bileşenlerin kaybını minimize ederek, ham doku materyallerinin özel ön işlemlere gerek kalmadan analiz edilmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kütle Spektrometrisi
- Biyolojik Analiz
- Analitik Kimya
Arka Plan
- Ortam kütle spektrometrisi hem in vitro hem de in vivo analizler için uygundur.
- Yöntem, kapsamlı numune ön işlemine ihtiyaç duymaz.
- Minimum biyolojik bileşen kaybıyla numunelerin analiz edilmesini sağlar.
- Hızlı analiz, bu tekniğin temel bir avantajıdır.
Çalışmanın Amacı
- Biyolojik moleküllerin gerçek zamanlı analizi için bir yöntem sunmak.
- Ham doku materyallerini analiz etmenin etkinliğini göstermek.
- Ortamsal kütle spektrometrisi kullanmanın avantajlarını vurgulamak.
Kullanılan Yöntemler
- Silika ve doku örneklerinin hazırlanması.
- Numune analizi için tek kullanımlık kartuşların kullanımı.
- Biyolojik numunelerin kütle spektrometrisi ile doğrudan analizi.
- Numunelerin bir dakika içinde hızlı bir şekildele işlenmesi.
Temel Sonuçlar
- Yöntem, bileşenlerde önemli bir kayıp olmadan hızlı analiz yapılmasına olanak tanır.
- Çok küçük miktarlarda biyolojik materyal içeren örneklerin analizi için etkilidir.
- Gerçek zamanlı analizlerde dayanıklılık ve güvenilirlik sergiler.
- Biyolojik moleküllerin doğal durumlarında incelenmesini kolaylaştırır.
Sonuçlar
- Ortamsal kütle spektrometrisi, biyolojik analizler için değerli bir araçtır.
- Bu teknik, biyolojik süreçlerin anlaşılmasını geliştirmektedir.
- Gerçek zamanlı analizler için hızlı ve verimli bir yöntem sunar.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Uygunluğu
Prob elektrospray iyonizasyon kütle spektrometrisi (PESI-MS), biyolojik örneklerin minimum ön işlemle gerçek zamanlı moleküler analizini sağlayarak, erken aşama keşiflerde hızlı hedef doğrulamayı ve mekanistik risk azaltmayı destekler. Teknik, yalnızca 10 mg doku veya 10 µL serum gerektirdiğinden, düşük hacimli preklinik örnekler için uygundur ve biyolojik bileşen kaybını azaltır. Bu yetenek, canlı sistemlerden doğrudan, in situ metabolit ve ilaç dinamiği verileri sağlayarak öncü bileşik tanımlamasında öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Renal hücreli karsinom gibi katı dokulardan nötral lipidlerin ve metabolitlerin doğrudan tespit edilmesini sağlayarak terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Yalnızca %50 etanol içinde doku homojenizasyonu şeklinde minimal numune hazırlığı gerektirir; bu da iş akışı karmaşıklığını ve değişkenliği azaltır.
- Tahmin Değeri: Ticari veri tabanı eşleştirmesi yoluyla moleküler mekanizma kalifikasyonunu destekleyerek hedef güvenilirlik değerlendirmesine yardımcı olur.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Basit etanol çöktürme ve santrifüjasyon sonrası insan kan serumunun doğrudan analizine olanak tanıyarak sıvı tabanlı biyobelirteç taramasını mümkün kılar.
- Operasyonel Değer: Tek kullanımlık kartuşlar ve paslanmaz çelik problar kullanarak standardizasyon sağlar ve çapraz kontaminasyon riskini azaltır.
- Ölçeklenebilirlik: Sonuçların birkaç dakika içinde alınmasını sağlayarak hızlı numune devir daimini kolaylaştırır ve yüksek kapasiteli tarama hazırlığını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Fare karaciğerinde 5-FdU saptanması gibi, canlı hayvanların belirli organlarındaki metabolitlerin veya ilaçların gerçek zamanlı dinamiklerinin izlenmesine olanak tanır.
- Mekanistik Risk Azaltma: Doku yıkımı olmadan in situ moleküler veriler sağlayarak, preklinikten kliniğe geçişin daha iyi gerçekleşmesi için fizyolojik bağlamı korur.
- Risk Ayarlı İlerleme: Karar verme süreçlerini bilgilendirmek için hastalıkla ilişkili spektral paternleri (örneğin, sirotik karaciğerdeki neoplastik lezyonlar) tespit eder.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
PESI-MS, erken biyolojiden öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürecine uyum sağlayarak, hipotez testlerini ve assay hazırlığını destekleyen hızlı ve kantitatif moleküler okumalar sunar.
- Keşif Biyolojisi: Fraksiyonlama yapmadan dokuya özgü moleküler imzaların (örneğin karsinomda triasilgliserol) tespit edilmesiyle hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Standartlaştırılmış kartuş tabanlı örnek giriş yoluyla analize hazır sıvı ve doku analizine olanak tanır.
- Analitik: Koşullar ve bireyler arasında kantitatif karşılaştırma yapmak için kütle spektral verileri (m/z pikleri, EIC, TIC) üretir.
- Translasyonel Araştırma: Fare kuyruk venine intravenöz 5-FdU uygulanması gibi, ilaç metabolitlerinin in vivo izlenmesi yoluyla preklinik doğrulamaya bağlanır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Tek kullanımlık sarf malzemeleriyle birlikte yeniden kullanılabilir donanımlar (prob, hazne) kullanarak projeler arası standartlaştırma sağlar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Bozulmamış biyolojik sistemlerden doğrudan moleküler veriler sağlayarak mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış numune hazırlama (10 mg doku, 10 µL serum, %50 etanol) ve sabit voltaj/frekans ayarları (2.3 kV, 3 Hz) ile tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Hastalık modellerinde hızlı metabolit/ilaç tespitine imkan tanıyarak devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Kontrol gruplarında bulunmayan hastalığa özgü piklerin (örneğin, karsinomda m/z 900) tespiti yoluyla riske göre ayarlanmış önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Çözelti hazırlama (%50 etanol) ve serum işleme için santrifüj kullanımı dahil olmak üzere kütle spektrometresi işletimi konusunda uzmanlık gerektirir.
- Uyumlu kartuş sistemine ve paslanmaz çelik iğne probuna sahip bir Doğrudan Prob İyonizasyon Kütle Spektrometresi gereklidir.
- Veri tutarlılığını sağlamak için numune hazırlama süreçlerinin (doku kesimi, homojenizasyon ve süpernatan transferi) ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- İğne ucu derinliği, in vivo uygulamalarda iyonizasyon verimliliğini ve veri kalitesini etkileyen kritik bir değişken olarak dikkate alınmalıdır.
- Ortam iyonizasyonu ile uyumlu numunelerle sınırlıdır; karmaşık biyosıvılar için matris etkileri optimizasyon gerektirebilir.
