Name: İmal İmmünoterapi için İmkanerik Antijen Reseptör (CAR) T Hücreleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Öğrenin, fonksiyonel yetkinliği koruyan kimerik antijen reseptör T hücreleri üretme yöntemini. Bu teknik, immünoterapi için T hücre sağlığını koruyarak etkinliği artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen Novartis Pharmaceuticals tarafından Pennsylvania Üniversitesi (Michael C. Milone) ve St. Baldrick Vakfı Bursu (Saba Ghassemi) ile bir araştırma ittifakı aracılığıyla sağlanan finansman la desteklenmiştir.

Tüm hayvan çalışmaları Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. T Hücre Aktivasyonu, Transdüksiyon ve Genleşme
<ol><li>6-iyi hücre kültürü yemeklerinde T hücresi başına 3 boncuk oranında anti CD3/CD28 manyetik boncuklar (örneğin, dinamitler) ile karıştırarak taze veya kriyokorunmuş birincil insan T hücrelerini etkinleştirin. X-VIVO 15 orta kültür T hücreleri% 5 normal insan AB serum, 2 mM L-glutamin, 20 mM HEPES ve IL2 (100 adet / mL) ile desteklenmiştir. Genişleme sırasında T hücrelerini 106 T hücre/mL konsantrasyonda koruyun. Kültür T hücreleri 37 °C, %20 O2ve %95 nem %5 CO2.</li>
	<li>Gece stimülasyon sonra, aktif T hücrelerine lentiviral supernatant ekleyin. 3−5'lik bir enfeksiyon (MOI) çokluğu elde etmek için gerekli supernatant hacmini hesaplayın. NOT: CD19-Bţ CAR lentivirus plazmid bir CD8 menteşe, 4-1BB costimulatory etki alanı ve CD3ţ sinyal etki alanı21oluşur. CD19-Bţ lentiviral supernatant daha önce açıklandığı gibi oluşturuldu21.</li>
	<li>3. günde, kriyopreservation için hücrelerin temsili bir aliquot toplamak. Kriyopreservation önce, nazik pipetleme ve manyetik ayırma ile manyetik boncukkaldırın. %0,5 dimetil sülfoksit (DMSO) ile fosfat tamponlu salin (PBS) içeren dondurucu ortam hazırlayın ve kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.<ol>
<li>5 dk. 300 x g'daki Centrifuge T hücreleri supernatant'ı atın ve 5 mL PBS ekleyin. 5 dk için 300 x g'lık santrifüj hücreleri ve PBS atın.</li>
		<li>1 mL soğuk kriyopreservation ortamda hücre peletrerere resuspend. Soğutulmuş bir dondurucu kapta T hücrelerini dondurun ve -80 °C'de 48 saat boyunca saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Artık vektörü ortadan kaldırmak için geri kalan T hücrelerini 5 mL PBS'de bir kez yıkayın. 5 dk. PBS için 300 x g santrifüj ve 0.5 x 106 hücre/mL konsantrasyonda T hücre kültürü orta hücre pelet resuspend.</li>
	<li>T hücrelerini 5. Sayma boncukları(Malzeme Tablosu)ve monoklonal antikorlar kullanarak akış sitometrisi ile T hücre sayısını ve insan CD4 ve CD8'e karşı monoklonal antikorların yanı sıra canlılık boyası(Malzeme Tablosu)kullanılır.<ol>
<li>T hücre konsantrasyonu ölçmek için, 500 μL PBS, 5 μL sayma boncuk, 10 μL 7-Amino-aktinomisin D hücre canlılığı çözeltisi, 4 μL CD4-FITC ve 4 μL CD8-APC içeren bir ana karışım hazırlayın. Ana karışıma 40 μL'lik T hücresi ekleyin ve canlı T hücre/boncuk sayısısayısına göre akış sitometrisi ile hücre konsantrasyonu ölçün. Kültürleri her gün 0,5 x 106 hücre/mL konsantrasyonda korumak için yeniden besleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5. günde, 1.3 ve 1.5 adımlarında açıklandığı gibi 5.</li>
	<li>7. günde PBS'de 0.5 x 106 T hücreleri yıkayın ve 100 μL floresan aktif hücre sıralama (FACS) tamponunda yeniden askıya alın. Akış sitometrisi tarafından floresan konjuge anti-CAR19 idiyotipi ile immünoboyama tarafından CAR yüzey protein ekspresyonunu sapta.</li>
	<li>9. günde, 9.</li>
</ol>2. T Hücre Farklılaşmasının Henotipik Değerlendirilmesi
<ol><li>Anti-CD3-BV605 (klon OKT3), anti-CD14-Pacific Blue (PB) (clone HCD14), anti-CD19–PB (hib19), anti-CD4-BV510 (klon OKT4), anti-CD8-H7APC (klon SK1), anti-CCR7-FITC (klon 150503), anti-CD45RO-PE (klon UCHL1), anti-CD27-PE-Cy7 (klon 1A4CD27), anti-CD95-PerCP-Cy5.5 (Klon DX2) ve anti-CAR19-APC.</li>
	<li>Anti-CD45RO-PE, anti-CCR7-FITC, anti-CD27-PE-Cy7 ve anti-CD95-PerCP-Cy5.5 için arka plandan pozitif lekeli hücreleri ayırt etmek için tek tek floresan eksi (FMO) kontrolleri hazırlayın.</li>
	<li>PBS'de canlı/ölü stok reaktifini(Malzeme Tablosu)1:10.000'i seyrelterek ölü hücre boyama çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>Çözülme gün 3, gün 5, ve gün 9 T hücreleri daha önce cryopreserved edildi. 3 dk. 3 dk. Için 300 x g her gruptan santrifüj 1 x 106 T hücreleri atın. Hücreleri pbs ile bir kez yıkayın. 3 dk için 300 x g santrifüj ve PBS atın.</li>
	<li>T hücrelerini, ışıktan korunan oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca ölü boyama çözeltisi ile karıştırın.</li>
	<li>Ölü hücre boyama boyasını gidermek için 1 mL FACS tampon ekleyin. 3 dk için 300 x g santrifüj, supernatant atın ve adım 2.1 ve 2.2 açıklanan antikor kokteyliçeren FACS tampon 100 μL hücre pelet yeniden askıya. 4 °C'de 1 saat kuluçka.</li>
	<li>3 dk için 3 00 x g'de 1 mL FACS tampon ve santrifüj ekleyin ve bağlanmamış antikorları temizleyin. FACS arabelleği ile üç kez tekrarlayın.</li>
	<li>Hücreleri %1 paraformaldehitte (PFA) yeniden askıya alır ve 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Fiksasyon sonrası CD45RO ekspresyonu azaldıkça, immünoboyama sonrası akım sitometrisi ile örnekleri analiz edin. Farklılaşmayı değerlendirmek için, aşağıdaki sırayla kapı: singlets (FSC-H vs FSC-A), canlı CD3+ T hücreleri (Dökümü [canlı ölü mor, CD14-PB ve CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). CD4+ ve CD8+ alt kümelerde, NAif T hücrelerini tanımlamak için CD45RO-PE vs CCR7-FITC'de kapı (CD45RO-CCR7+ ),Tcm (CD45RO+CCR7+), Tem (CD45RO+CCR7-) ve Tte (CD45RO - CCR7 - ) ve Tte (CD45RO-CCR7- ). Tscm tanımlamak için, naif gibi T hücreleri popülasyonCD27+ T hücreleri üzerinde kapı. Bu bölmede, Tscm CD95+ ve Tn CD95 vardır-.</li>
</ol>3. In Vitro Fonksiyonel Analiz
<ol><li>CAR T hücre çoğalması ve sitokin salgısı
	<ol>
<li>Akış sitometrisi tarafından, 1.5 ve 1.7 adımlarında açıklandığı gibi CAR ifadesini ve hücre canlılığını doğrulayın.</li>
		<li>Her gruptan 5 x 106 T hücreleri PBS ile yıkayın (gün 3, gün 5 ve gün 9) ve rt 3,5 dakika pbs karboksifluorescein diasetat succinimidyl ester (CFSE) bir 1 μM çözeltisi resuspend.</li>
		<li>Reaksiyonu gidermek için hemen %10 fetal sığır serumu (FBS) içeren 10 mL PBS ekleyin.</li>
		<li>Çözeltiyi 3 dk.3 dk.'da santrifüj edin. Cfse boyama sonunda hücreleri bir Coulter sayacı(Malzeme Tablosu)kullanarak sayın.</li>
		<li>CfSE lekeli hücreleri hasat edin (uyarılmamış), %1 PFA'da yeniden askıya alın ve akış sitometrisi ile analiz için 4 °C'de saklayın.</li>
		<li>Isınıtır K562-CD19 (hedef) ve K562-yabani tip (kontrol) hücreleri ile istenilen sayıda CFSE lekeli CAR T hücrelerini, adım 1.1'de açıklandığı gibi sitokinsiz kültür ortamı ve kültür koşullarında 120 saat için 1:1 oranında kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>24 saat sonra kültür damarını 5 dk. 120 μL hücresel supernatant için 300 x g'da santrifüj edin. IL2, IFNγ, TNFα, GM-CSF ve diğer inflamatuar sitokinlerin (IL1β, IL4, IL5, IL6, IL8 ve IL10) aktivasyona bağlı üretimini üreticinin tavsiyelerine uygun olarak Luminex analizleri ile değerlendirin.</li>
		<li>Adım 3.1.7'de toplanan süpernatant hacmini eşdeğer hacim (120°L) taze ortamla değiştirin.</li>
		<li>Üçüncü günde (yani 96 saat sonra) daha önce 1.5 adımda olduğu gibi boncuk bazlı akış sitometrisini kullanarak 0,5 x 106 hücre/mL konsantrasyonla sayım ve yeniden besleme.</li>
		<li>5. gün, canlı CD3+ hücreleri sayın ve 0.</li>
		<li>Ardışık hücre bölünmesi turlarını vurgulamak için FlowJo yazılımını kullanarak CAR T hücrelerinin bölünmesinde CFSE seyreltme lerinin kapsamlı bir analizini yapın. NOT: Proliferasyon tahlilleri FlowJo kılavuzunda iyi tanımlanmıştır.</li>
	</ol></li>
	<li>Sitotoksisite töz NOT: CART19 hücrelerinin CD19'u ifade eden hedef hücreleri öldürme yeteneği 51Cr serbest bırakma-teşifi kullanılarak değerlendirilir.<ol>
<li>Hedef hücreleri 5 x 105 K562-CD19, K562-yabani tip kontrol hücreleri veya NALM6 lösemi hücrelerini 50 μL Na251CrO4 ve 0,5 mL RPMI ile karıştırarak etiketlendirin ve 37 °C'de 90 dk için %10 FBS ile desteklendi.</li>
		<li>300 x g'de 2,5 dk. Radyoaktif süpernatantı uygun bertaraf kutularına atın ve hedef hücreleri 5 mL PBS'de yıkayın. Yıkama adımlarını iki kez tekrarlayın.</li>
		<li>% 5 FBS içeren fenol kırmızı-free ortamda hedef hücreleri resuspend. Arka planı azaltmak için yordamın geri kalanı için bu ortamı kullanın.</li>
		<li>CAR ekspresyonunu ve hücre canlılığını akış sitometrisi ile değerlendirdikten sonra (bölüm 5.1'de açıklandığı gibi), CAR T hücrelerini 10:1, 3:1 ve 1:1 oranlarında etiketlenmiş hedef hücrelerle karıştırın. 96-iyi U alt plakasına aktarın.</li>
		<li>Buna paralel olarak, spontan (S) ve maksimum (M) 51Cr salınımı belirlemek için tek başına hedef hücreleri ve%1 sodyum dodeyl sülfat (SDS) içeren hedef hücreleri içerir.</li>
		<li>Santrifüj hücreleri 300 x g 5 dk ve inkübat için 4 saat veya 20 saat için bir 37 °C inkübatör% 5 CO2ile .</li>
		<li>Belirlenen süreden sonra kültür kabını 5 dk. 35 μL hücresel supernatant toplayın ve bir okuyucu plakasına aktarın. Kabarcıklar kaçının. Plakabir gecede kurusun.</li>
		<li>Plakayı standart bir plaka contası ile kapatın ve sıvı bir sintillation sayacı ile sayın. Supernatant krom bolluğu hedef hücre öldürme bir proxy sağlar. Aşağıdaki gibi belirli lysis yüzdesini hesaplayın: 100 x (dakika başına sayar [cpm] deneysel sürüm – cpm S serbest)/ (cpm M serbest – cpm S serbest).</li>
	</ol></li>
</ol>4. In Vivo Fonksiyonel Analiz
<ol><li>Adaptif bağışıklık sistemi olmayan 6−10 haftalık NOD-SCID γc–/– (NSG) fareleri edinin ve bunları rastgele tedavi/kontrol grubuna atayın.</li>
	<li>0,1 mL steril PBS 1 x 106 NALM6 hücreleri ile kuyruk damarı ile intravenöz hayvanlar enjekte.</li>
	<li>5−7 gün sonra, biyolüminesans görüntüleme (BLI) ile tümör engraftment doğrulayın. İzofluran ile anestezi yapılan farelere 150 mg/kg D-luciferin enjekte edin (hacim vücut kütlesine bağlıdır).</li>
	<li>Bir görüntüleme sistemi kullanarak biyolüminesans değerlerini ölçün. Farelerin etrafında aynı alanın dikdörtgenlerini çizerek, kuyruk uzunluğunun %50'sine ulaşarak ilgili yazılımı kullanarak toplam akı ölçün. Her görüntü için arka planı ayrı ayrı çıkarın.</li>
	<li>Lösemi kurduktan sonra, enjekte 3 x 106 gün 9 CART19 hücreleri, 0.5 x 106 gün 3 CAR T hücreleri, ya da karşılık gelen non-transduced (NTD) insan T hücreleri steril PBS / Ca2 +bir hacim kuyruk ven yoluyla . NOT: Kültür sürecinde çeşitli aralıklarla hasat edilen hücrelerin biyoaktivitesi farklı olduğundan, 3.</li>
	<li>Hastalığın ilerlemesini belirlemek için, yukarıda belirtilen 4.3 adımda biyolüminesans değerlerini haftada iki kez ölçün.</li>
	<li>CAR T hücre engraftment belirlemek için, bir EDTA kaplı tüp retro-orbital kanama yoluyla 75 μL kan toplamak. 50 μL'lik kanı mutlak sayma tüplerine aktarın.</li>
	<li>RT'de 30 dk boyunca CD45, CD4, CD8 ve CAR'a karşı antikorlarla kan lekeleyin. Boyama sonra, akış sitometri ile yüzey marker ifade analiz. NOT: Diğer yüzey belirteçleri kandaki T hücrelerinin farklılaşma ve bitkinlik durumunu değerlendirmek için kullanılabilir.</li>
	<li>Kandaki sitokin düzeylerini ölçmek için, 30 dakika 4 °C'de 1.200 x g'de santrifüj kanı serumu kan üst tabakasından ayırmak için ayırın.</li>
	<li>Serum toplayın ve üreticinin talimatlarına göre belirlenmiş bir okuyucu plakası ile sitokinleri ölçün.</li>
</ol>

<ol><li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138(2013).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+with+Chimeric+Antigen+Receptors+Have+Potent+Antitumor+Effects+and+Can+Establish+Memory+in+Patients+with+Advanced+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia.</a> Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73(2011).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).</li>
<li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+for+sustained+remissions+in+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139(2015).</li>
<li>Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoma+Remissions+Caused+by+Anti-CD19+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+Are+Associated+With+High+Serum+Interleukin-15+Levels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).</li>
<li>Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+therapy+in+the+treatment+of+post-transplant+lymphoproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).</li>
<li>Brestrich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+T-cell+therapy+of+a+lung+transplanted+patient+with+severe+CMV+disease+and+resistance+to+antiviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy.</a> American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).</li>
<li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+solid+organ+transplant+recipients+with+autologous+Epstein+Barr+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+%28CTLs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs).</a> Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).</li>
<li>Berger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+effector+CD8%2B+T+cells+derived+from+central+memory+cells+establishes+persistent+T+cell+memory+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates.</a> The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+memory+T+cell+subset+with+stem+cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A human memory T cell subset with stem cell-like properties.</a> Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).</li>
<li>Hinrichs, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptively+transferred+effector+cells+derived+from+naive+rather+than+central+memory+CD8%2B+T+cells+mediate+superior+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).</li>
<li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+memory+self%2Ftumor-reactive+CD8%2B+T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+human+central+memory-derived+effector+CD8%2B+T+cells+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice.</a> Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+naive+and+central+memory+derived+CD8%2B+effector+cell+engraftment+fitness+and+function+following+adoptive+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer.</a> Oncoimmunology. 5 (1), e1072671(2016).</li>
<li>Fraietta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determinants+of+response+and+resistance+to+CD19+chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cell+therapy+of+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia.</a> Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).</li>
<li>Ghassemi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+Ex+Vivo+Culture+Improves+the+Antileukemic+Activity+of+Chimeric+Antigen+Receptor+%28CAR%29+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.</a> Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).</li>
<li>Milone, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+receptors+containing+CD137+signal+transduction+domains+mediate+enhanced+survival+of+T+cells+and+increased+antileukemic+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).</li>
<li>Cieri, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7+and+IL-15+instruct+the+generation+of+human+memory+stem+T+cells+from+naive+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors.</a> Blood. 121 (4), 573-584 (2013).</li>
<li>Cui, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7-Induced+Glycerol+Transport+and+TAG+Synthesis+Promotes+Memory+CD8+T+Cell+Longevity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity.</a> Cell. 161 (4), 750-761 (2015).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+T-memory+stem+cells+correlate+with+in+vivo+expansion+of+CAR.CD19-T+cells+and+are+preserved+by+IL-7+and+IL-15%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15.</a> Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).</li>
<li>Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+memory+phenotypes+drive+T+cell+proliferation+in+patients+with+pediatric+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies.</a> Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323(2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada ex vivo kültürü boyunca çeşitli aralıklarla hasat edilen CAR T hücrelerinin işlevini ve etkinliğini ölçmek için yaklaşımları açıklıyoruz. Yöntemlerimiz, proliferatif kapasitenin yanı sıra efektör fonksiyonunu in vitro olarak değerlendirmek üzere tasarlanmış tahliller hakkında kapsamlı bir içgörü sağlar. Car ile stimülasyonu takiben CAR T hücre aktivitesinin nasıl ölçültüldüğü ve logaritmik genleşme fazının 3.
Ex vivo genleşme sırasında farklı zaman noktalarında hasat EDILEN CAR T hücrel...

Şimerik antijen reseptörleri (CAR) farklı tümör antijenlerine karşı T hücrelerini yönlendirmek için umut verici bir yaklaşım sağlar. CAR bir antijen hedef bağlamak sentetik reseptörleri vardır. Kesin kompozisyonları değişken olmakla birlikte, CAR'lar genellikle 3 farklı etki alanı içerir. Hücre dışı etki alanı bir hedef antijene bağlanır ve genellikle ekstrasellüler menteşe ile CAR'a bağlı tek bir zincirantikor parçasından oluşur. T hücre reseptörü (TCR) kompleksinin CD30 zincirinden elde edilen ikinci etki alanı, CAR etkileşiminden sonra T hücre aktivasyonunu teşvik eder. Üçüncü bir kostimulatör etki T hücre fonksiyonu geliştirmek için dahildir, engraftment, metabolizma, ve kalıcılık. B hücreli akut lenfoblastik lösemi (ALL), kronik lenfositik lösemi (KLL) ve multipl miyelom dahil olmak üzere çeşitli hematopoetik malignitelerde CAR T hücre tedavisinin başarısı bu yaklaşımın terapötik sözünü vurgular1,2,3,4,5,6. Son Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) iki CD19-spesifik CAR T hücre tedavileri için onaylar, pediatrik ve genç erişkin ALL ve diffüz büyük B hücreli lenfoma için aksicabtagene ciloleucel için tisagenlecleucel, CAR T hücre tedavisinin çevirili liyakatini güçlendirir.
CAR T tabanlı yaklaşımlar periferik kan, aktivasyon, genetik modifikasyon ve genişleme ex vivo T hücrelerinin izolasyon içerir. Farklılaşma CAR T hücre etkinliğini düzenleyen önemli bir parametredir. Buna göre, ex vivo kültür sırasında T hücre farklılaşmasını kısıtlayan engraft için aşılanmış ürünün yeteneğini artırır, genişletmek, ve devam, evlat edinme transferi aşağıdaki uzun vadeli immüngözetim sağlayan2,7,8,9. T hücreleri şunlardır: naif T hücreleri (Tn), merkezi bellek (Tcm), efektör bellek (Tem), efektör diferansiye (Tte) ve kök hücre belleği (Tscm). Efektör diferansiye T hücreleri güçlü sitolitik yeteneğe sahiptir; ancak, kısa ömürlü ve engraft kötü10,11,12. Buna karşılık, naif T hücreleri ve Tcm dahil olmak üzere daha az diferansiye fenotip ile T hücreleri üstün engraftment ve proliferatif yetenekleri adoptive hücre transferi aşağıdaki sergiler13,14,15,16,17,18. Önceden üretilen üründe toplanan T hücrelerinin bileşimi hastalar arasında değişebilir ve CAR T hücrelerinin terapötik potansiyeli ile ilişkilidir. Başlangıç aferez ürününde naif benzeri immünhefenotip olan T hücrelerinin oranı hem engreftment hem de klinik yanıt ile son derece ilişkilidir19.
Kültür süresi, evlat edinme transferi için hazırlanan CAR T hücrelerinde farklılaşmayı etkileyen önemli bir parametredir. Biz son zamanlarda kısaltılmış bir kültür paradigması20kullanarak üstün kaliteli CAR T hücreleri oluşturmak için bir yaklaşım geliştirdi. Yaklaşımımızı kullanarak, sınırlı kültürün löseminin ksenogreft modellerinde evlat edinici transferi sonrasında üstün efektör işlevi ve kalıcılığı olan CAR T hücrelerine yol açtığını gösterdik. Burada, CART19 hücrelerini (CD3ţ ve 4-1BB sinyal etki alanlarındaki anti-CD19 scFv'yi ifade etmek üzere tasarlanmış otolog T hücreleri) güvenilir bir şekilde üretmek için yaklaşımları savuruyoruz ve evlat edinmeden önce CAR T biyoaktivite ve etkinliği hakkında bilgi sağlayan tahlillerin ayrıntılı bir açıklamasını da ekleyebiliyoruz.

<table><tbody><tr><td>Anti CD3 / CD28 dynabeads</td><td>Thermo Fisher</td><td>40203D</td><td></td></tr><tr><td>APC Fare Anti-İnsan CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>555369</td><td>RRID: AB_398595</td></tr><tr><td>APC-H7 Fare anti-İnsan CD8 Antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>560179</td><td>RRID: AB_1645481</td></tr><tr><td>BD FACS Lysing Solution 10X Konsantre</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>BD Trucount Mutlak Sayma Tüpleri</td><td>BD Biosciences</td><td>340334</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 anti-insan CD4 Antikoru BioLegend</td><td></td><td>317444</td><td>RRID:AB_2561866</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-insan CD3 Antikoru</td><td>BioLegend</td><td>317322</td><td>RRID:AB_2561911</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Hücre Proliferasyon Kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Mutlak Sayma Boncukları,</td> <td>Invitrogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-İnsan CD197 (CCR7) Antikoru</td><td>BD Pharmingen</td><td>561271</td><td>RRID:AB_10561679</td></tr><tr><td>FITC Fare Anti-İnsan CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>555346</td><td>RRID:AB_395751</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>İnsan AB serumu</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>İnsan IL-2 IS, birinci sınıf</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-744</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Gibco</td><td>28030-081</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı sintilasyon sayacı, MicroBeta trilux</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Menekşe</td><td>Moleküler Problar</td><td>L34964</td><td></td></tr><tr><td>Multisizer Coulter Sayacı</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na251CrO4</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEZ030S001MC</td><td></td></tr><tr><td>Pasifik Mavi anti-insan CD14 Antikoru BioLegend</td><td></td><td>325616</td><td>RRID:AB_830689</td></tr><tr><td>Pasifik Mavisi anti-insan CD19 Antikoru</td><td>BioLegend</td><td>302223</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-insan CD45RO Antikoru</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td>RRID:AB_395884</td></tr><tr><td>PE / Cy5 anti-insan CD95 (Fas) Antikor</td><td>BioLegend</td><td>305610</td><td>RRID:AB_493652</td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-insan CD27 Antikoru</td><td>Beckman Coulter</td><td>A54823</td><td></td></tr><tr><td>Fenol kırmızı içermeyen orta</td><td>Gibco</td><td>10373-017</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure SDS Çözeltisi, %10</td> <td>İnvitrojen</td><td>15553027</td><td></td></tr><tr><td>Via-Probe</td><td>BD Biosciences</td><td>555815</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>Gibco</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferin - K+ Tuz</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr></tbody></table>

İmal İmmünoterapi için İmkanerik antijen reseptör (car) t hücreleri

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Benimseyen immünoterapi kanser ve bulaşıcı hastalıkların tedavisi için umut vaat ediyor. Biz şimerik antijen reseptörü ile birincil insan T hücreleri transduce basit bir yaklaşım tarif (CAR) ve onların singen ynuzlu ex vivo genişletmek. Car ekspresyonunun yanı sıra farklılaşma, proliferatif kapasite ve sitoklitik aktiviteyi ölçmek için tahliller de dahilyiz. CAR T hücrelerinde efektör sitokin üretimini ve inflamatuar sitokin salgısını ölçmek için tahlilleri tanımlıyoruz. Yaklaşımımız, evlat edinen immünoterapinin preklinik modelleri için CAR T hücrelerine güvenilir ve kapsamlı bir yöntem sunmaktadır.

Yukarıda açıklanan yöntemleri kullanarak, T hücrelerini 3 veya 9 gün boyunca uyardık ve genişlettik(Şekil 1A,B). Ayrıca, şekil 1C'deözetlenen gating stratejisinde belirtildiği gibi, hücre yüzeyinde ifade edilen farklı glikoproteinlerin bolluğunu ölçerek farklılaşma profillerini de analiz ettik. Ex vivo kültür sırasında zaman içinde efektör farklılaşmaya doğru ilerleyici bir kayma gösteririz (Şekil 1...

Biz güvenilir şemerik antijen reseptörü oluşturmak için bir yaklaşım tarif (CAR) T hücreleri ve in vitro ve in vivo onların farklılaşma ve fonksiyon test.

İmal İmmünoterapi için İmkanerik Antijen Reseptör (CAR) T Hücreleri

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

De-lib-er-engraft fonksiyonel yetkinlik ile bir CAR T Hücre ürün ating, çoğalır ve infüzyon sonrası sit-el-ürik aktiviteye sahip etkili bir benimseyen immünoterapi önemli bir bileşenidir. Örneğin, katı tümörlerde, CAR T hücreleri katı tümörlere nüfuz edebilir ve optimal antijen stimülasyonları alırlar;ancak, genel engraftment ve proliferasyon insanlarda engellenir. Bu yaklaşımın en önemli yararı, car T hücrelerinin kalitesini veya CAR T hücrelerinin farklılaşma durumunu ölümcül olarak farklılaşmış veya tükenmiş T hücreleri üretmeden koruyabilmesidir, bu da infüzyon sonrasında proliferatif kapasiteyi veya zayıf etkili işlevi azaltmış olacaktır.T hücreleri hücre konsantrasyonuna veya kültürlendikleri damarların yüzey alanına çok duyarlı olduğu için bu teknik zor olabilir. Metabolik ihtiyaçları kadar. Esasen T hücreleri süreç boyunca mutlu tutulması gerekir, aksi takdirde büyümek olmaz.Bu prosedüre başlamak için, 6-iyi kültür yemekleri yola. Kültür yemeklerinin kuyularında T hücresi başına üç boncuk oranında, anti-CD3 CD28 manyetik boncuklar ile karıştırarak taze veya kriyo korunmuş birincil insan T hücreleri etkinleştirin. Kültür X-Vivo 15 orta normal insan AB serum, L-glutamin, he-pees ve IL2 ile birlikte T hücreleri.Genişleme sırasında mililitre başına bir milyon T hücre konsantrasyonu t hücreleri etkinleştirin. Ve onları %20 oksijen, %5 karbondioksit ve %95 nem oranıyla 37 derecede kültürleyin. Gece stimülasyon sonra, aktif T hücrelerine lentiviral supernatants ekleyin.Üç ile beş arasında çok sayıda enfeksiyon elde etmek için gerekli supernatants hacmini hesaplayın. Aynı koşulları kullanarak hücreleri culturing devam edin. Üçüncü gün, kriyo-koruma hücrelerinin temsili bir aliquot toplamak.Kriyo-koruma dan önce, manyetik boncukları yavaşça pipetleme ve manyetik ayırma ile çıkarın. %0,5 DMSO ile PBS içeren dondurma ortamını hazırlayın. Ve kullanıma hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın.Daha sonra, T hücrelerini 5 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj edin. Supernatant atın ve PBS beş mililitre ekleyin. Hücreleri tekrar 300 kez G'de beş dakika santrifüj edin ve PBS'yi atın.Pellantı bir mililitre soğuk kriyo koruma aracıyla askıya alıyoruz. Soğutulmuş bir dondurucu kapta T hücrelerini dondurun. Ve eksi 80 derecede 48 saat saklayın.Bundan sonra, sıvı nitrojen dondurulmuş hücreleri aktarın. Kalan vektörü ortadan kaldırmak için t hücrelerinin geri kalanını beş mililitre PBS'de bir kez yıkayın. 5 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj.Daha sonra, PBS decant ve mililitre başına 500, 000 hücre konsantrasyonu t hücre kültürü orta hücre pellant yeniden askıya. T hücrelerini 45 ve 9'da tasarlanmış iki kültüre ayırın. İnsan CD4 ve CD8 sayma boncukları ve monoklonal antikorları kullanarak t hücrelerini akış sitometrisi ile sayın.Canlılık boyası gibi. Kültürleri her gün besleyin ve mililitrede 500,000 hücrenin konsantrasyonunda koruyun. Beşinci günde, daha önce açıklandığı gibi beş kültürün gününü sayve kısık bir şekilde koru.Yedinci günde, PBS'de 500.000 hücreyı yıkayın. Ve onları 100 mikrolitre floresan aktif hücre sıralama tamponuyla tekrar askıya alıyor. Daha sonra, akış sitometrisi tarafından floresan caiz anti-CAR 19 idio tipi ile immüno boyama ile CAR yüzey protein ekspresyonunu saplayın.Dokuzuncu günde, daha önce açıklandığı gibi dokuzuncu günü saymak ve kriyo-korumak. Bu çalışmada X-Vivo kültürü boyunca çeşitli aralıklarla hasat edilen CAR T hücrelerinin işlevi ve etkinliği ölçüldü. Bu videoda açıklanan yöntemler kullanılarak, T hücreleri uyarılır ve üç veya dokuz gün boyunca genişletilir.Burada gösterilen gating stratejisinde belirtildiği gibi hücre farklılaşma profili, hücre yüzeyinde ifade edilen farklı glikoproteinlerin bolluğu ölçülerek analiz edilir. X-Vivo kültürü sırasında zaman içinde efektör farklılaşmaya doğru ilerleyici bir kayma görülür. Daha sonra antijene yanıt olarak CAR T hücrelerinin efektör fonksiyonu ve proliferatif kapasitesi değerlendirilir.Daha az genişlemiş hücreler işlevsel olarak daha uzun bir süre boyunca yaygın olarak kültürlenmiş hücrelerden daha üstündür. Farklı zaman dilimlerinde hasat edilen CAR T hücrelerinin tüm gücü bir insan ksenogreft fare modelinde karşılaştırılır. Dokuz günlük hücreler, doza bağımlı anti-lukemik yanıtı, üç milyon luk yüksek dozdeğerinde tam bir yanıt ve 500,000'lik düşük doziçin etkinlik kaybı gösterir.Ancak, gün üç hücre hem yüksek hem de düşük dozlarda kalıcı tümör kontrolü gösterdi. Bu yanıt farelerin periferik kan CAR-T 19 mutlak sayısı ile ilişkilidir. Genel olarak, bu sonuçlar CAR T hücrelerinin daha önce hasat, daha sonra hasat daha iyi performans kanıt sağlar.Bu prosedürü takiben, oksijen tüketimi veya spir-it-ed kapasitesi gibi metabolik özelliklerini ölçmek için denizatı tahlil gibi ek fonksiyon denemeleri yapılabilir. CAR T hücrelerinin farklılaşması ve kalıcılığı hakkında bilgi sağlamak için birkaç tur yeniden stimülasyon da yapılabilir. Bu çalışmayı bir temel olarak kullanarak biz ve diğer araştırmacılar kültür sürecini daha da kısaltmak için çalışmalar yapıyoruz.Aynı zamanda diğer kanser antijenleri için çekirdek yaklaşımlar tasarım uzatılabilir. Eğer lentivirus ile çalışırken bakım her zaman alınması gerekir. Ama lentivirus çoğaltma yetersiz olacak şekilde tasarlanmış olsa bile.

manufacturing-chimeric-antigen-receptor-car-t-cells-for-adoptive

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu videoda, kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücrelerinin ex vivo üretilmesi için kullanılan bir teknik gösterilmektedir. İnsan T hücreleri, anti-CD3 ve anti-CD28 antikorları ile kaplanmış manyetik boncuklar ve interlökin-2 (IL-2) ile takviye edilmiş bir ortam ile inkübe edilir ve bu da T hücresi aktivasyonuna ve çoğalmasına yol açar. Transgenik RNA'nın konakçı genomuna entegre olmasına ve transgeni eksprese etmesine izin veren transgenik lentiviral vektörler tanıtılır. Bu, transdüksiyona...

Kimerik Antijen Reseptörü T Hücreleri Üretmek için Ex Vivo Bir Teknik

Bu videoda, tümör antijenine özgü kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücrelerinin ex vivo üretimi için bir teknik gösterilmektedir. Transgenik RNA taşıyan retroviral vektörler, T hücresi sağkalımını ve proliferasyonunu teşvik etmek için interlökin-2 ile takviye edilmiş bir ortamda dalak hücreleri ile karıştırılır. Karışım daha sonra rekombinant insan fibronektin fragmanları ile kaplanmış bir plakaya aktarılır ve virüsün hücre ile füzyonunu kolaylaştırmak için santrifüjlenir, bu da RNA'nın...

Tümöre özgü kimerik antijen reseptör T hücreleri oluşturmak için bir ex vivo teknik

Sıvı ve katı tümör hücrelerini hedefleyen kimerik antijen reseptör T hücrelerinin gücünü değerlendirmek için kantitatif gerçek zamanlı in vitro sitoz ispat sistemini tanımlıyoruz. Bu protokol diğer bağışıklık etki hücreleri değerlendirmek için uzatılabilir, yanı sıra kombinasyon tedavileri.

Katı ve Hematolojik Kanser Hücrelerini Hedefleyen İmhimik Antijen Reseptör T Hücreleri Için Gerçek Zamanlı Potens Tsay

Burada, CAR-T hücrelerini değiştirmek için CRISPR Cas Teknolojisini kullanarak birincil insan T hücrelerinde gen düzenleme protokolü sunuyoruz.

İnsan CRISPR-Engineered CAR-T Hücrelerinin Üretimi

Bu makale, klinik kullanım için kimerik antijen reseptörü T hücreleri için, özellikle viral transdüksiyon ve T hücrelerinin kültivasyonunu gerçekleştirebilen otomatik bir hücre işlemcisi kullanarak üretim sürecini detaylandırmaktadır. Erken aşama bir klinik araştırmanın süreç geliştirme ve uygulaması sırasında göz önünde bulundurulması gereken önerilerde bulunuyor ve tuzakları açıklıyoruz.

Otomatik Hücre İşlemcisinde Kimerik Antijen Reseptörü T Hücresi Üretimi

Bu protokol, retroviral vektör üretimini ve murin T hücresi transdüksiyonunu kolaylaştırarak fare CAR-T hücrelerinin verimli bir şekilde üretilmesini kolaylaştırır.

Murin kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerinin verimli üretimi

Bu protokol, insan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücreleri (CAR Treg'ler) oluşturmak ve test etmek için kolaylaştırılmış bir iş akışı sağlar.

İnsan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücrelerinin üretimi

Bu protokol, kanser immünoterapisi için entegre olmayan mRNA kullanarak geçici kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri oluşturmak için ayrıntılı bir prosedürü ana hatlarıyla belirtir ve CAR-T hücrelerini ve sitotoksik işlevlerini değerlendirmek için güvenilir yöntemler sağlar.

Kanser İmmünoterapisi için mRNA Kullanarak Geçici Kimerik Antijen Reseptörü T Hücreleri Oluşturmak İçin Viral Olmayan Bir Yaklaşım

Burada, tek hücre düzeyinde hücre öldürmeyi incelemek için bir T hücresini ve bir kanser hedef hücresini kapsülleyen çift emülsiyon damlacıkları oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, büyük bir T hücresi popülasyonu içinde hem sitotoksik moleküllerin hem de hedef hücre apoptozunun ikili miktar tayinine izin verir.

Kimerik Antijen Reseptörü T hücrelerini Tek Hücre Düzeyinde Değerlendirmek için Damlacık Bazlı Sitotoksisite Testi

Bu protokol, birincil T hücrelerinin yetiştirilmesi için temel adımları tanımlar; bunların izolasyonu, aktivasyonu, genişlemesi ve mRNA elektroporasyonu ile geçici transfeksiyonu dahildir. Ayrıca, fenotip, aktivasyon belirteçleri, canlılık ve kimerik antijen reseptörü (CAR) ekspresyonunun akış sitometrik analizi için bir iş akışı ve antikor paneli önerilmektedir.

Birincil insan T hücrelerinin izolasyonu, yetiştirilmesi ve geçici transfeksiyonu için kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücreleri üretmek

Öğrenin, fonksiyonel yetkinliği koruyan kimerik antijen reseptör T hücreleri üretme yöntemini. Bu teknik, immünoterapi için T hücre sağlığını koruyarak etkinliği artırır.

İmal İmmünoterapi için İmkanerik Antijen Reseptör (CAR) T Hücreleri

Daha fazla video keşfet