Name: Farelerin Nöral Kök Hücreleri ve Beyinlerinde 5-Hidroksimetilsitozozin Insaptama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Öğrenin fare nöral kök hücreleri ve beyin dokularında 5-hidroksimetilsitozin tespiti için immünofloresan boyama ve DNA nokta leke yöntemlerini. Bu protokol epigenetik düzenleme ve nörolojik hastalıklarda gen ifadesi rolünü araştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

XL kısmen Çin Ulusal Temel Ar-Ge Programı (2017YFE0196600) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 31771395, 31571518) tarafından desteklenmiştir. S.S. Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2017YFC1001703) ve Zhejiang Eyaleti Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2017C03009) tarafından desteklenmiştir. W.X. Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (LY18H020002) ve Zhejiang Eyaleti Bilim Teknolojisi Bölümü (2017C37057) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan prosedürleri Zhejiang Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Yetişkin Nöral Kök Hücre ve Nöronların Kültürü
<ol><li>Daha önce açıklandığı gibi bir yetişkin (8-10 haftalık) C57/BL6 erkek fare ön beyin yetişkin nöral kök hücreleri izole31,32.</li>
	<li>DMEM/F-12 ortamlarında 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, %2 B27 takviyesi, %1 antibiyotik antimikotik ve %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de 2 mM L-Glutamin içeren yetişkin nöral kök hücreler. Daha önce açıklandığı gibi 1 μM retinoik asit ve 5 μM forskolin ile yetişkin nöral kök hücrelerin farklılaşması nı neden 48 h,32.</li>
	<li>Embriyonik gün 17 nöronlar izole (E17) fare ve kültür hipokampi nörobazal orta içeren 0.25% L-Glutamin, 0.125% GlutaMax ve% 2 B27 ek 5% CO2 kuvöz 37 ° C daha önce açıklandığı gibi33.</li>
</ol>2. Farenin Transkardiyal Perfüzyonu
<ol><li>Deneyden bir gün önce %10 kloral hidrat, %4 paraformaldehit (PFA) ve fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Yetişkin bir erkek veya dişi C57 BL/6J fareyi %10 kloral hidrat (50 mg/kg, i.p.) ile anesteize edin ve hayvanın vücut reaksiyonu kontrol edilerek derinden anestezi altında olduğundan emin olun. Plastik bir tahta üzerinde yapışkan bant ile her uzuv düzeltin (bir yüz-up pozisyonda).</li>
	<li>Ameliyat makası ile deri ve sonra kas kesin. Göğüs boşluğunu cerrahi bir makasla açın. Kalbi ortaya çıkar ve sağ atriyumun küçük bir kısmını ince bir cerrahi makasla kes.</li>
	<li>Fareyi sol ventrikülden 10 mL tek kullanımlık sterilize şırınga ile soğuk PBS (yetişkin fare başına yaklaşık 30 mL) ile perfüzyon.</li>
	<li>Fareyi sert olana kadar %4 PFA (yetişkin fare başına 10 dakikada yaklaşık 30 mL) ile perfüzyon edin.</li>
	<li>Farenin kafatasını kemik çerteleriyle açın. Beyni çıkarın ve 4 °C'de fiksasyon sonrası için 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde %4 PFA'nın 5 mL'sine yerleştirin. NOT: Ameliyat bittikten sonra cerrahi alanı temizleyin.</li>
	<li>En az 24 saat sonra, beyin örneklerini 4 °C'de tam dehidratasyon için %30 sakaroz çözeltisine aktarın.</li>
</ol>3. Beyin Kesiti
<ol><li>Beyin örneklerini en uygun kesme sıcaklık bileşimesini (OCT) küçük bir kapta yerleştirin ve -20 °C'de en az 1 saat soğutun.</li>
	<li>Bir kriyostat mikrotom ile 20-40 μm kalınlığında kesit beyin örnekleri.</li>
	<li>Bölümleri PBS'ye toplayın ve 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>4. İmmünofluoresan Boyama
<ol><li>Hedeflenen beyin bölgeleri ile bölümleri almak ve PBS ile 24-iyi plaka içine koyun. Bir kapak üzerinde kültürlü hücreler için, doğrudan adım 4.2 gidin.</li>
	<li>10 dakika oda sıcaklığında çalkalayıcı üzerinde PBS ile yıkayın.</li>
	<li>PBS'yi çıkarın ve önceden ısıtılmış 1 M HCl ile 37 °C'de 30 dakika tedavi edin. NOT: 1 mL hidroklorik asit (%36-38) ekleyerek 1 M HCl hazırlayın kimyasal bir başlık içinde su 10 mL içine. 37 °C'de kuvözde 1 M HCl önceden ısıtın.</li>
	<li>Örnekleri PBS ile 5 dk boyunca yıkayın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında shaker üzerinde % 3 normal keçi serumu ve %0.1 Triton X-100 içeren PBS içeren blok numuneler.</li>
	<li>Shaker üzerinde 4 °C'de bir gecede belirli primer antikorlar içeren kuluçka bölümleri. NOT: Aşağıdaki primer antikorları kullanın: poliklonal tavşan antikorları anti-5-hidroksimetilsitozin (1:5,000), fare monoklonal antikor anti-NeuN (1:500).</li>
	<li>Örnekleri alın ve 1 saat oda sıcaklığında daha fazla kuluçka.</li>
	<li>Numuneleri PBS ile 10 dakika yıkayın.</li>
	<li>Çalkalama da oda sıcaklığında primer antikorlara karşılık gelen ikincil antikorlarla kuluçkaya yatırın. Alüminyum ile plaka kapağı. NOT: Aşağıdaki ikincil antikorları kullanın: Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG (1:500), Alexa Fluor 568 keçi anti-fare IgG (1:500). 4′-6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) ile karşı leke çekirdekleri.</li>
	<li>Numuneleri 10 dakika boyunca PBS ile çalkalayıcıüzerinde yıkayın. Bunu iki kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Slaytların üzerine beyin bölümlerini monte edin, uygun miktarda antifade montaj ortamı (yaklaşık 100-150 μL) ekleyin ve birinci sınıf camla kaplayın. Ojeli fok.</li>
	<li>Düzenli veya konfokal floresan mikroskobu ile fotoğraf çek.</li>
</ol>5. Genomik DNA İzolasyon
<ol><li>Servikal çıkış tarafından yetişkin bir C57 BL/6J fare (erkek veya kadın) ötenazi ve beyin kaldırın.</li>
	<li>Buz soğutmalı bir çanak üzerinde hipokampus, korteks ve beyincik dokuları incelemek. 1 mL DNA lisis tamponunda doku öğütücü ile dokuları öğütün ve temiz mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 600 μL lysis tampon başına 250 μg proteinaz K ekleyin. Hücre peletleri için, doğrudan lysis tampon ekleyin, proteinaz K, ve iyice karıştırın. NOT: DNA lysis tamponu hazırlayın: 5 mM EDTA, %0.2 SDS, 100 mM Tris-HCl'de 200 mM NaCl, pH 8.5. Deneyden önce doku öğütücüse otoklavı.</li>
	<li>İkinci gün, 37 °C'de en az 12 saat boyunca numune başına yaklaşık 50 μg RNase A ekleyin.</li>
	<li>Fenol eşit hacimli ekleyin:kloroform:isoamyl alkol (25:24:1) ve tamamen karıştırın.</li>
	<li>15 dakika boyunca 20.817 x g santrifüj ve yeni bir mikrosantrifüj tüp içine supernatant çıkarın.</li>
	<li>DNA'yı çökeltmek için süpernatant'a 600 μL kloroform ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
	<li>15 dakika boyunca 20.817 x g santrifüj ve başka bir yeni tüp içine supernatant çıkarın.</li>
	<li>Supernatant'a 500 μL isopropanol ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
	<li>15 dakika boyunca 20.817 x g santrifüj ve supernatant tamamen çıkarın.</li>
	<li>1 mL%70 etanol, santrifüj 20.817 x g 1 dk ile yıkayın ve supernatant tamamen çıkarın. Bir kez tekrarlayın.</li>
	<li>DNA peletini tamamen kurutun.</li>
	<li>Tris-HCl tamponu (pH 8.5) ile DNA peletini uygun konsantrasyona kadar çözün.</li>
</ol>6. DNA Nokta Blot
<ol><li>Çözeltileri hazırlayın: 2 M NaOH, Tris-HCl tampon (pH 8.5), 6x tuzlu sodyum sitrat (SSC).</li>
	<li>Örnek karışımı Tablo 1olarak yapın.</li>
	<li>10 0 0 00 dakika boyunca 100 °C'de DNA örneklerini denatüre edin ve buzüzerinde soğutun.</li>
	<li>Naylon membranın uygun boyutunu kesin (örn. Hybond-N+) ve 6x SSC ile durula.</li>
	<li>Membranı nokta-leke aparatına koyun ve vakum pompasına bağlayın. Membran üzerine nokta başına karışım Nokta 6 μL.</li>
	<li>80 °C'de 30 dakika hibritleştirin ve tris-tamponlu tuzlu (TBS) içinde yağsız süt ile örnek membran blok 1 saat.</li>
	<li>Bir gecede 4 °C'de birincil antikor ile inkübat. NOT: Aşağıdaki primer antikor: poliklonal tavşan anti-5-hidroksimetilsitozin (1:5,000).</li>
	<li>İkinci gün, numune membranlarını oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca anti-tavşan ikincil antikor (1:5,000) ile membran kuluçka.</li>
	<li>10 dk. TBS ile yıkayın.</li>
	<li>Kemilüminesans sinyallerini görselleştirin ve sinyal yoğunluklarını ölçün.</li>
</ol>

<ol><li>Tan, L., Shi, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet+family+proteins+and+5-hydroxymethylcytosine+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tet family proteins and 5-hydroxymethylcytosine in development and disease.</a> Development. 139 (11), 1895-1902 (2012).</li>
<li>Yao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+mechanisms+in+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Epigenetic mechanisms in neurogenesis.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (9), 537-549 (2016).</li>
<li>Day, J. J., Sweatt, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+and+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">DNA methylation and memory formation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1319-1323 (2010).</li>
<li>Wu, X. J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-mediated+active+DNA+demethylation%3A+mechanism%2C+function+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">TET-mediated active DNA demethylation: mechanism, function and beyond.</a> Nature Reviews Genetics. 18 (9), 517-534 (2017).</li>
<li>Sun, W. J., Guan, M. X., Li, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine-Mediated+DNA+Demethylation+in+Stem+Cells+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine-Mediated DNA Demethylation in Stem Cells and Development.</a> Stem Cells and Development. 23 (9), 923-930 (2014).</li>
<li>Li, S., Mason, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pivotal+regulatory+landscape+of+RNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">The pivotal regulatory landscape of RNA modifications.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 15, 127-150 (2014).</li>
<li>Hwang, J. Y., Aromolaran, K. A., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+field+of+epigenetics+in+neurodegeneration+and+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The emerging field of epigenetics in neurodegeneration and neuroprotection.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (6), 347-361 (2017).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324 (5929), 929-930 (2009).</li>
<li>Tahiliani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-Methylcytosine+to+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mammalian+DNA+by+MLL+Partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in Mammalian DNA by MLL Partner TET1.</a> Science. 324 (5929), 930-935 (2009).</li>
<li>Guo, J. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+modifies+the+DNA+methylation+landscape+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity modifies the DNA methylation landscape in the adult brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (10), 1345-1351 (2011).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dnmt1+and+Dnmt3a+maintain+DNA+methylation+and+regulate+synaptic+function+in+adult+forebrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dnmt1 and Dnmt3a maintain DNA methylation and regulate synaptic function in adult forebrain neurons.</a> Nature Neuroscience. 13 (4), 423-430 (2010).</li>
<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Geneticset%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nature Geneticset. , Suppl 33. 245-254 (2003).</li>
<li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), (2011).</li>
<li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li>
<li>Shu, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+alteration+of+5-hydroxymenthylcytosine+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide alteration of 5-hydroxymenthylcytosine in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> BMC Genomics. 17, (2016).</li>
<li>Cruvinel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+maternal+SNORD116+cluster+via+SETDB1+knockdown+in+Prader-Willi+syndrome+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Reactivation of maternal SNORD116 cluster via SETDB1 knockdown in Prader-Willi syndrome iPSCs.</a> Human molecular genetics. 23 (17), 4674-4685 (2014).</li>
<li>Bernstein, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylation-associated+epigenetic+modifiers+of+Alzheimer%27s+disease+modulate+Tau-induced+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylation-associated epigenetic modifiers of Alzheimer's disease modulate Tau-induced neurotoxicity.</a> Human Molecular Genetics. 25 (12), 2437-2450 (2016).</li>
<li>Wang, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+loss+of+5-hmC+is+a+novel+epigenetic+feature+of+Huntingtons+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide loss of 5-hmC is a novel epigenetic feature of Huntingtons disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (18), 3641-3653 (2013).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet3+regulates+synaptic+transmission+and+homeostatic+plasticity+via+DNA+oxidation+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tet3 regulates synaptic transmission and homeostatic plasticity via DNA oxidation and repair.</a> Nature Neuroscience. 18 (6), 836-843 (2015).</li>
<li>Wu, H., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+DNA+methylation%3A+mechanisms%2C+genomics%2C+and+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reversing DNA methylation: mechanisms, genomics, and biological functions.</a> Cell. 156 (1-2), 45-68 (2014).</li>
<li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenomic+reconfiguration+during+mammalian+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development.</a> Science. 341 (6146), 1237905(2013).</li>
<li>Inoue, A., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-Dependent+Loss+of+5-Hydroxymethylcytosine+in+Mouse+Preimplantation+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication-Dependent Loss of 5-Hydroxymethylcytosine in Mouse Preimplantation Embryos.</a> Science. 334 (6053), 194(2011).</li>
<li>Pastor, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473 (7347), 394-397 (2011).</li>
<li>Ito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion%2C+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466 (7310), (2010).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+DNA+hydroxymethylation+changes+are+associated+with+neurodevelopmental+genes+in+the+developing+human+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide DNA hydroxymethylation changes are associated with neurodevelopmental genes in the developing human cerebellum.</a> Human Molecular Genetics. 21 (26), 5500-5510 (2012).</li>
<li>Song, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 68-72 (2011).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtelomeric+hotspots+of+aberrant+5-hydroxymethylcytosine-mediated+epigenetic+modifications+during+reprogramming+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Subtelomeric hotspots of aberrant 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic modifications during reprogramming to pluripotency.</a> Nature Cell Biology. 15 (6), 700-711 (2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, 15903(2017).</li>
<li>Szulwach, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nature Neuroscience. 14 (12), 1607-1616 (2011).</li>
<li>Tao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Dynamic+DNA+Demethylation+during+Postnatal+Neuronal+Development+and+Neural+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">The Dynamic DNA Demethylation during Postnatal Neuronal Development and Neural Stem Cell Differentiation.</a> Stem Cells International. 2018, 2186301(2018).</li>
<li>Li, X. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-eleven+translocation+2+interacts+with+forkhead+box+O3+and+regulates+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Ten-eleven translocation 2 interacts with forkhead box O3 and regulates adult neurogenesis.</a> Nature Communications. 8, (2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+the+stem+cell+mitogen+Fgf-2+by+Mbd1+in+adult+neural+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of the stem cell mitogen Fgf-2 by Mbd1 in adult neural stem/progenitor cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (41), 27644-27652 (2008).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
</ol>

Rakip finansal çıkarlar yok.

Epigenetik modifikasyonlar beyin gelişimi, olgunlaşma ve fonksiyon sırasında önemli roller oynar. DNA modifikasyonu için kararlı bir belirteç olarak, dinamik 5-hmC davranışsal adaptasyon, nöronal aktivite yanıt verir ve pozitif gen ekspresyonu ile ilişkilidir; böylece, beyin ve nörolojik bozukluk4normal fonksiyonu nda yer almaktadır. Hücre ve dokularda işlevini keşfetmek için, 5-hmC varlığını tespit etmek ve tedavi öncesi ve sonrası düzeyini karşılaştırmak için gereklidir. Burada, laboratuvarda or...

DNA modifikasyonu, histon modifikasyonu ve RNA modifikasyonu da dahil olmak üzere epigenetik modifikasyonlar, çeşitli biyolojik süreçler vehastalıklardatemel işlevleri oynamak için gösterilmiştir 1,2,3, 4.2.2 , 5.000 , 6.000 , 7. Uzun bir süre için, DNA metilasyon (yani, 5-metisitozin (5-mC)) son derece istikrarlı bir epigenetik belirteç olarak görülüyor ve daha fazla genom değiştirilemez. Son zamanlarda, 5-mC TET1, TET2 ve TET38,9dahil olmak üzere TET (Ten-onbir translokasyonlar) aile proteinleri tarafından 5-hidroksimetilsitozin (5-hmC) oksitlenmiş olabilir bulunmuştur. Daha ileri çalışmalar 5-hmC istikrarlı bir belirteç olarak hizmet verebilir ve gen ekspresyonudüzenleyen4,10,11,12ile biyolojik roller oynayabilir göstermektedir.
Mevcut kanıtlar 5-hmC yüksek memelilerde dokuların diğer türlerine göre nöronal dokularda / hücrelerde zenginleştirilmiş olduğunu göstermektedir, ve nöronal gelişim sırasında dinamik özellikler sergiler13,14. Nöronal sistemde, 5-hmC aracılı epigenetik değişiklikler nöral kök hücrelerin düzenlenmesinde önemli bir rol oynar, nöronal aktivite, öğrenme ve bellek, ve Rett sendromu dahil olmak üzere birden fazla nörolojik bozukluklar yer almaktadır, otizm, Alzheimer hastalık, Huntington hastalığı, vb2,13,15,16,17,18,19,20.
Hücre ve dokularda 5-hmC tespit etmek için çeşitli yaklaşımlar vardır14,21,22,23,24. Burada, 5-hmC varlığını tespit etmek ve 5-hmC küresel düzeyini ölçmek için iki yöntem açıklar: immünoresans boyama ve DNA nokta-blot. Bu iki yöntem uygun ve duyarlı, ve başarıyla önceki çalışmalarda kullanılmıştır25,26,27,28,29,30. Bu iki yöntemin temel adımları DNA denatürasyonuvardır. 5-hmC immünoresans boyama için 1 M HCl'li numunelerin ön tedavisi gereklidir. 5-hmC nokta-blot için DNA denatürasyonu NaOH çözeltisi ile yapılır. Yeni nesil sıralama ile birlikte bu iki yöntem 5-hmC işlevini araştırmak için çok yararlı araçlardır.

<table><tbody><tr><td>4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop yazılımı</td><td>Adobe Inc.</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 keçi anti-fare IgG</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>anti-5-hidroksimetilsitozin</td><td>Aktif Motif</td><td>39769</td><td></td></tr><tr><td>anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>12580-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat mikrotomu</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 orta</td><td>OmegaScientific</td><td>DM25</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal büyüme faktörü</td><td>PeproTech</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast büyüme faktörü-temel</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Termo</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Normal keçi serumu</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>Z0325</td><td></td></tr><tr><td>Naylon membran (Hybond ve ticaret; -N +)</td> <td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td>RPN303B</tr><tr><td>EKİM</td><td>Leica</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>Kalem Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1 )</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>516726</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizin</td><td>Sigma</td><td>P0899-10</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>VVR</td><td>39450-01-6</td><td></td></tr><tr><td>Retinoik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio</td><td>T8210</td><td></td></tr></tbody></table>

farelerin nöral kök hücreleri ve beyinlerinde 5-hidroksimetilsitozozin insaptama

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Memeli genomunda birden fazla DNA modifikasyonu tespit edilmiştir. Bunun 5-metilsitozin ve 5-hidroksimetilsitozin aracılı epigenetik mekanizmaları yoğun olarak çalışılmıştır. 5-hidroksimetilsitozin beynin embriyonik ve doğum sonrası gelişimi sırasında dinamik özellikler gösterir, gen ekspresyonunda düzenleyici bir işlev oynar ve birden fazla nörolojik bozukluklar yer almaktadır. Burada, kültürlü hücrelerde ve farenin beyin dokularında 5-hidroksimetilitozini saptamak için immünoresans boyama ve DNA nokta-leke dahil olmak üzere ayrıntılı yöntemleri açıklıyoruz.

Erişkin farelerin hipokampusundaki 5-hmC dağılımını ortaya çıkarmak için nöronal hücrelere (NeuN) ve 5-hmC'ye karşı antikorlarla immünorfloresans uyguladık. Hipokampus, 5-hmC nöronal hücre belirteci NeuN ile iyi lokalize (Şekil 1A-H), nöronlarda 5-hmC bir zenginleştirme düşündüren.
Nöronal gelişim sırasında 5-hmC'nin dinamiklerini belirlemek için ilk olarak çoğalan ve farklılaşmış erişkin nöral kök hücrelerden (NSC) izole edilmiş DNA örnekleri ile...

Burada, immünororesans boyama ve DNA nokta-leke yöntemleri kullanarak, hücre ve beyin dokularında 5-hidroksimetilitozin tespit etmek için bir protokol salıyoruz.

Farelerin Nöral Kök Hücreleri ve Beyinlerinde 5-Hidroksimetilsitozozin Insaptama

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Burada, immünoresans, yeni yöntem ve DNA nokta-blot kullanarak hücrelerde ve beyin dokularında 5-hidroksimetilitetozin tespit etmek için bir protokol sıyoruz. 5-hidroksimetilsitozin, yani 5hmC, azaltılmış epigenetik modifikasyon, gen ekspresyonunu düzenleyen önemli bir işlev oynar ve birden fazla nörolojik bozukluklar dahil.Aslında, yöntemlerimiz birden fazla hücre ve dokularda 5hmC tespit etmek için kullanılabilir. Bu kullanışlı ve laboratuvarda ortak ekipmanları ile yapılabilir. Fareyüz plastik bir tahta üzerinde konumlandırma ve yapışkan bant ile her uzuv sabitleme ile başlayın.Deri ve kas kesmek için cerrahi makas kullanın ve göğüs boşluğu açın. Kalbi ortaya çıkarmak ve ince cerrahi makas ile sağ atriyumun küçük bir kısmını kesti. 10 mililitrelik tek kullanımlık, sterilize şırınga kullanarak fareyi sol ventrikülden soğuk PBS ile geçirin.Daha sonra fareyi sert olana kadar %4 PFA ile perfüzyonlayın. Sonra, kemik forceps ile kafatası açın ve beyin çıkarın. Beyni %4'lük beş mililitrelik bir santigrat ile dolu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve dört santigrat derecede saklayın.24 saat sonra, bir 30% sakaroz çözeltisi içine beyin transferi ve tam dehidratasyon için dört derece santigrat bırakın. Kesitönce, en iyi kesme sıcaklığı bileşik beyin imbed ve eksi 20 derece santigrat en az bir saat boyunca serin. Kesit beyin örnekleri 20 ila 40 mikrometre kalınlığında bir kriyostat mikrotom kullanarak.PBS içine bölümleri toplamak ve dört derece santigrat de saklamak. İlgi beyin bölümlerini toplayın ve PBS ile 24 kuyulu bir tabağa koyun. PBS ile bölümleri 10 dakika çalkalayıcıda yıkayın.PBS çıkarın ve 30 dakika boyunca 37 santigrat derece önceden ısıtılmış tek molar hidroklorik asit ile tedavi. Hidroklorik asit aşındırıcıdır ve lütfen kimyasal ambarda hazırlayın. Daha sonra numuneleri beş dakika PBS ile üç kez yıkayın ve %3 normal keçi serumu ve %0.1 Triton X-100 içeren PBS ile engelleyin.Bir saat oda sıcaklığında bir shaker üzerinde örnekleri bırakın. Bölümlere spesifik primer antikorlar ekleyin ve bir shaker üzerinde dört santigrat derece gecede kuluçka. Ertesi gün, örnekleri dışarı alın ve bir saat oda sıcaklığında bırakın.Örnekleri PBS ile üç kez yıkayın ve ikincil antikorlar ekleyin. Alüminyum ile plaka kapağı ve sallayarak bir saat oda sıcaklığında bırakın. Kuluçkadan sonra numuneleri PBS ile üç kez yıkayın ve slaytlara monte edin.Anti-fade montaj orta 100 ila 150 mikrolitre ekleyin, bir prim kapak cam ile kapak, ve oje ile mühür. Beyin bölümlerini düzenli veya konfokal mikroskopla görüntüleyin. Genomik DNA izole etmek için, bir buz soğutmalı çanak üzerinde hipokampus, korteks ve beyincik dokuları inceleyerek başlar.BIR mililitre DNA lisis tamponu ekleyin ve dokuları öğütün. Numuneyi temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve her 600 mikrolitre lysis tamponu için 250 mikrogram proteinaz-K ekleyin. Daha sonra, numune başına yaklaşık 50 mikrogram RNase A ekleyin ve 37 santigrat derecede en az 12 saat kuluçkaya yatırın.Kuluçka sonra, fenol kloroform izoamyl alkol eşit hacimli ekleyin ve iyice karıştırın. Karışımı el yazması yönlere göre santrifüj edin ve süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Supernatant kloroform 600 mikrolitre ekleyin, iyice karıştırın ve el yazması talimatlara göre santrifüj.Yeni bir tüp için supernatant aktarın ve izopropanol 500 mikrolitre ekleyin. Iyice karıştırın ve DNA çökelti tekrar santrifüj. Santrifüjden sonra, supernatant atın ve el yazması yönlere göre% 70 etanol ile DNA pelet yıkayın.Hava DNA peletini tamamen kurutun ve tris-HCl tamponunda eritin. Başlamadan önce, el yazması talimatlara göre gerekli çözümleri ve örnek karışımı hazırlayın. DNA örneğini 10 dakika 100 santigrat dereceye ısıtarak denatüre edin ve sonra buzun üzerine koyun.Bir naylon membranuygun boyutu kesin ve 6X SSC ile durun. Membranı nokta-leke li bir aparata yerleştirin ve vakum pompasını bağlayın. Altı mikrolitrelik noktaları membrana tespit edin ve 80 santigrat derecede 30 dakika melezleyin.Daha sonra, yağsız süt ve Tris tamponlu salin veya TBS ile örnek membran blok, bir saat. Membrana poliklonal tavşan anti-5-hidroksimetilitetistosin antikor ekleyin ve dört santigrat derece gecede kuluçka. Ertesi gün, bir saat oda sıcaklığında örnek membran bırakın, sonra TBS ile membran üç kez yıkayın.Membranı 30 dakika boyunca anti-tavşan ikincil antikorile kuluçkaya yatırın ve ardından TBS ile üç kez yıkayın. Bu protokol yetişkin farelerin hipokampus5-hidroksimetilsitozin, ya da 5hmC, görselleştirmek için kullanılabilir.Nöronal hücrelere karşı antikorlar ile immünororesans, 5hmC nöronlarda 5hmC bir zenginleştirme olduğunu ortaya koymaktadır. Nöronal gelişim sırasında 5hmC dinamikleri çoğalan ve farklılaşmış erişkin nöral kök hücrelerden izole DNA örneklerinin nokta-leke testi ile belirlenebilir. 5hmC küresel düzeyleri önemli ölçüde farklılaşma sırasında artış ve nöronlarda 5hmC düzeyi nöral kök hücrelere göre daha yüksektir.Bu yöntemin temel adımı DNA örneklerinin tam denatürasyonu emin olmaktır.

the-detection-5-hydroxymethylcytosine-neural-stem-cells-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

EpiMark 5-HMC ve 5-mC Analiz Kiti, analiz etmek ve SPE larındaki lokus içinde 5-methylcytosine ve 5-hydroxymethylcytosine ölçmek için kullanılabilir. Kiti, 5-HMC hidroksil grubu β-glukoziltransferaz (T4-BGT) kullanan bir enzimatik reaksiyon ile glikoz eklenmesiyle 5-5-HMC mC ayırır. 5-HMC CCGG bağlamında oluştuğunda, bu değişikliği olmayan bir cleavable sitesine cleavable MspI sitesi dönüştürür.

Balb / C Beyin Dokusu Yüksek Hassasiyet 5-hydroxymethylcytosine Algılama

Açıklanan kolay ve yoğunluk bağımsız zenginleştirme için bir biyotin bağlayıcının aktarmak tıkırtı kimya ve ardından, 5-HMC için bir azit-glikoz aktarmak için β-glukoziltransferaz (β-GT) ile iki aşamalı bir etiketleme bir işlemdir. Bu etkili ve spesifik bir etiketleme yöntemi nesil dizileme ile son derece düşük arka plan ve yüksek verimlilik epigenomic haritalama ile 5-HMC zenginleşmesine olanak sağlar.

Genomik DNA 5-hydroxymethylcytosine seçici Yakalama

Burada LacI transgenik fare modeli kullanılarak arıtılmış, hematopoietik hücrelerin az sayıda için bir in vivo deneyini tarif mutagenez. LacI gen DNA mutantlarının sıklığı, yer ve tip kendiliğinden ortaya çıkan veya Genotoksinlerin maruz kaldıktan sonra belirlemek için izole edilebilir.

Saf Hematopoetik kök / progenitör hücrelerin DNA mutasyonları belirlenmesi

Timidin iki analoglarının Yönetimi, edu ve BrdU, hamile farelerde embriyonik fare beyninde sinir ve progenitör hücrelerde hücre döngüsü ilerlemesinin analizine izin verir. Bu yöntem, beyin gelişimi sırasında iyonizan radyasyon içeren genotoksik stres, etkilerini belirlemek için yararlıdır.

Genotoksik Stres sonrası nöral kök ve Fare Gelişmekte Beyin Progenitör Hücrelerinin Değerlendirilmesi Hücre Döngüsü İlerlemesi

Burada, peroksidaz konjuge ikincil antikorların ve tiramid sinyal amplifikasyonunun kullanımına dayalı olarak 5mC oksidasyon türevlerinin uzamsal dağılımını haritalamak için hassas bir immünokimyasal yöntemi açıklıyoruz.

Hassas immünohistokimyasal sitozin Modifiye Formlar Algılama

Yeni 5-metilsitozin (oksi-mCs), 5-arasında bakterilerde görülen (5hmC), 5-formylcytosine (5 fC) oksitlenmiş formları bulunan ve 5-carboxylcytosine (5caC) farklı DNA değişiklikleri benzersiz işlevsel roller ile temsil edebilir. Yarı nicel bir iş akışı görselleştirme oksi-mCs kayma dağıtım, sinyal şiddeti profil oluşturma ve colocalization için burada kullanılmıştır.

DNA değişiklikler için Immunostaining: Confocal görüntülerin sayısal analiz

Biz yalıtmak ve nöral progenitör hücreler embriyonik ve postnatal beyin dokusundan Kromatin immunoprecipitation (ChIP) Histon 3 lizin 79 dimethylation (H3K79me2) - içinde yer alan bir Histon işareti için kültür için etkili ve tekrarlanabilir bir yöntem mevcut Histon 3 küresel etki alanı.

Yalıtım ve sinirsel ataları Kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lizin 79 Dimethylation Mark tarafından takip tarımı

Bu rapor amacı sağlam immunohistokimyasal algılama epigenetik işaretleri için iletişim kuralı tanımlamak için fare retina 5-metilsitozin (5mC) ve 5 arasında bakterilerde görülen (5hmC) gelişmekte olan ve postmitotic.

5-metilsitozin ve gelişmekte olan 5-arasında bakterilerde görülen immunohistokimyasal tespiti ve Postmitotic fare Retina

Metillenmiş RNA immün önksepitasyon testi, metillenmiş RNA parçaları için zenginleştirmek için kullanılan antikor bazlı bir yöntemdir. Derin sıralama ile birleştiğinde, m5C modifikasyonlarını taşıyan transkriptlerin tanımlanmasına yol açar.

Arabidopsis'te m5C Modifikasyonu Çalışmak için Metillenmiş RNA İmmün Prempripitasyon Tahlil

İndüklenebilir bir transgenik soy izleme fare çizgisi kullanarak kök hücreleri ve soylarını bir florofor ile kalıcı olarak işaretleme yeteneği, in vivo aktivasyon, proliferasyon, göç ve / veya farklılaşmanın mekansal ve zamansal analizine izin verir. Soy izleme, soy bağlılığı, müdahaleye yanıt ve çok potansiyelli hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarabilir.

Yetişkin Fare Beynindeki İndüklenebilir Floresan Etiketli Kök Hücrelerin Soy İzi

Bu yazıda, bozulmamış zebra balığı embriyolarında normal ve anormal sitozin metilasyonunun hızlı ve verimli spatiotemporal izlenmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Bozulmamış Zebra Balığı Embriyolarında Normal ve Anormal Sitozin Metilasyonunun Hızlı ve Verimli Mekansal Zamansal İzlenmesi

Öğrenin fare nöral kök hücreleri ve beyin dokularında 5-hidroksimetilsitozin tespiti için immünofloresan boyama ve DNA nokta leke yöntemlerini. Bu protokol epigenetik düzenleme ve nörolojik hastalıklarda gen ifadesi rolünü araştırır.

Farelerin Nöral Kök Hücreleri ve Beyinlerinde 5-Hidroksimetilsitozozin Insaptama

Daha fazla video keşfet