Zebrabalığında Situ Hibridizasyon Boyamada Genotibrasyon ve Nicelik
28 Ocak 2020
Gen düzenleme teknolojileri, araştırmacıların gen fonksiyonlarını göreceli kolaylıkla araştırmak için zebra balığı mutantları oluşturmalarını sağlamıştır. Burada, zebra balıklarında in situ hibridizasyon sinyallerinin paralel embriyo genotiplemesi ve nicelemesi için bir kılavuz sa¤l›k sa¤l›k sa¤l›¤ › sa¤l›yor. Bu tarafsız yaklaşım, in situ hibridizasyona dayalı fenotipik analizlerde daha fazla doğruluk sağlar.
Gen ekspresyonu üzerindeki mutasyonların sonuçları genellikle yerinde hibridizasyon tarafından nitel olarak değerlendirilir ve genellikle görsel olarak puanlandırılır, bu da araştırmacının beklentilerine göre öznel ve önyargılıdır. Bu yöntem, görüntü yoğunluklarını ölçerek yerinde deneyleri karşılaştırmak için daha tutarlı bir yol sağlar ve bu sapmayı kaldırır. Bu aynı zamanda kolayca bir gen ekspresyonu okuyucu olarak yerinde hibridizasyon kullanan diğer model sistemlerine adapte edilebilir.
In situ hibridizasyon-veya ISH-lekeli embriyolar görüntüleme ile başlayın. Bir gliserol çözeltisi hazırlamak ve homojenize etmek için karıştırın. Üç mililitrelik Pasteur pipet ile gliserol çözeltisine embriyolar transfer ve en az beş dakika yerleşmek için bırakın.
Hazırlamak ve görüntüleme den sonra ISH lekeli embriyolar aktarmak için yeterli PCR tüpleri etiket, sonra bir cam depresyon slayt kuyunun altına% 100 gliserol eklemek için üç mililitrelik Pasteur pipet kullanın. Tek bir ISH vitraylı embriyoyu cam kaydırağa aktarın ve dijital fotoğraf makinesi ve alt ve üst aydınlatma ile donatılmış stereo mikroskop altında yönlendirin. İlk embriyoyu kullanarak, aydınlatma ve maruz kalma süresini istenilen büyütmede ayarlayın.
Gerektiği kadar embriyo görüntüleyin ve her görüntüyü benzersiz bir sayıyla etiketleyin. Görüntülemeden sonra, her embriyo aynı sayıda etiketli bir PCR tüpüne transfer ve gerekirse PCR tüplerden aşırı gliserol aspire. DNA ayıklamak için, her tüpe HoTSHOT gibi bir alkali lysis tampon 40 ila 75 mikrolitre ekleyin.
Tüpleri 95 derecede yaklaşık 30 dakika kuluçkaya yatırın ve sonra 4 santigrat dereceye kadar soğutun. Nötralizasyon tamponeşit hacimli ekleyin ve ilgi mutasyonu için genotipleme ile devam edin. Görüntü analizi gerçekleştirmek için, Fiji'deki resmi seçin ve açın ve Edit'i tıklatarak görüntüyü ters çevirin ve ardından Resim sekmesini tıklatarak, Tür'ü seçerek ve 8 bit seçerek görüntü türünü 8-bit'e dönüştürün.
Çokgen aracını seçin ve ölçülecek ISH sinyalini içeren bölge çevresindeki görüntüye ilgi veya YG bölgesini el ile çizin. YG Yöneticisi'ni açmak ve ilgi çekici bölgeyi seçmek için T tuşuna basın ve ardından Ölçü'ye tıklayın. Sonuçlar penceresinden ortalama değeri elektronik tabloya kopyalayın.
Arka plan yoğunluğunu ölçmek için, yG'yi embriyodaki bir bölgeye boyama olmadan taşıyın ve YG Yöneticisi'ni ekle'yi tıklatın. Arka plan bölgesini seçin ve Ölçü'ye tıklayın, ardından ortalama yoğunluk değerini elektronik tabloya kaydedin. LEKEli bölgeden arka planın ortalama yoğunluğunu çıkararak NC2 hibridizasyon sinyalinin ortalama piksel yoğunluğunu elde edin.
Her numunenin ortalama piksel yoğunluğunu belirledikten sonra, her örneğe bir genotip atayın. Genotip belirlenemiyorsa, numuneyi sonraki analizden dışlar. Ortalama örneklem yoğunluğu değerlerini genotiplere göre sıralayın ve istatistiksel testlere devam edin.
Bu tekniğin yararı dnmt3bb için ISH gösterilmiştir. 1 bir runx1 heterozigot incross gelen embriyolarda. dnmt3bb bir azalma.
Runx1 homozigot mutantlarda 1 ekspresyon saptanırken heterozigot embriyolar dnmt3bb'de anlamlı bir farklılık göstermedi. 1 ifade. Lmo4 mutasyonunun runx1 ekspresyonu üzerindeki etkisini belirlemeye çalışırken, bu analiz yabani tip ve homozigot lmo4 mutantları arasında anlamlı ifade farklılıkları göstermedi.
Ancak tek embriyo qPCR ile runx1 ekspresyonunda küçük bir azalma saptanır. Runks1-probed embriyoların yaklaşık% 0.4, ISH sinyal çıkarılır zaman negatif bir sayı ile sonuçlanan yüksek bir arka plan vardı. Bu gibi durumlarda, embriyolar analiz dışı bırakıldı.
Embriyolar üzerinde dört farklı bölgelerde arka plan düzeltmeleri optimize etmek için test edilmiştir. Arka plan alanlarının herhangi birinde Yatırım Getirisi'nin yoğunluğunda nispeten kararlı bir fark olsa da, R3 her zaman Yatırım Getirisi'nden daha yüksek yoğunluk gösterdi ve arka plan düzeltmesi için kullanılmamalıdır. R1 ve R4 arka plan düzeltme için en uygun alanlar olduğunu kanıtladı.
Görüntüleme için en iyi koşulları bulmak ve deney boyunca değişmeden tutmak önemlidir. Ayrıca, her bir örneğe bir genotip atamadan önce piksel yoğunluğunun ölçülmesini öneririz.
Genel Bakış
Bu makale, zebrafishlerde paralel embriyo genotiplemesi ve in situ hibridizasyon sinyallerinin kantifikasyonu için bir yöntem sunmaktadır. Araştırmacılar, bu tarafsız yaklaşımı kullanarak fenotipik analizlerde daha yüksek doğruluk elde edebilirler.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Genetik
- Gelişimsel Biyoloji
Arka Plan
- Gen düzenleme teknolojileri, zebrafish mutantlarının oluşturulmasını kolaylaştırır.
- In situ hibridizasyon, gen ekspresyonunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir.
- Geleneksel skorlama yöntemleri yanlılığa ve sübjektifliğe yol açabilir.
- Bu çalışma, daha tutarlı ve kantitatif bir yaklaşım sunmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Zebrafish'lerdeki fenotipik analizlerin doğruluğunu artırmak.
- Embriyo genotipleme için standardize edilmiş bir yöntem sunmak.
- In situ hibridizasyon sinyallerini objektif bir şekilde nicelleştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Stereo mikroskop kullanarak ISH ile boyanmış embriyoların görüntülenmesi.
- Embriyo transferi için gliserol çözeltilerinin hazırlanması.
- DNA ekstraksiyonu için alkali lizis tamponunun kullanılması.
- Görüntü analizi ve nicelendirme için Fiji yazılımının kullanılması.
Ana Sonuçlar
- runx1 homozigot mutantlarında dnmt3bb.1 ekspresyonunda azalma gösterildi.
- Görüntü analizi için uygun arka plan düzeltme alanları belirlendi.
- Yabani tip ile lmo4 homozigot mutantları arasında ekspresyonda anlamlı bir fark görülmedi.
- Piksel yoğunluğuna dayalı olarak genotiplerin atanması için güvenilir bir yöntem sağlandı.
Sonuçlar
- Bu yöntem, gen ekspresyon analizinin güvenilirliğini artırır.
- Diğer model sistemlerde kullanıma uyarlanabilir.
- Doğru sonuçlar elde etmek için tutarlı görüntüleme koşullarının sürdürülmesi kritik öneme sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Alaka
Kantitatif in situ hibridizasyon analizi, gen ekspresyonu değerlendirmesindeki öznelliği azaltarak zebra balığı modellerinde hedef doğrulama için veri güvenilirliğini artırır. Bu yaklaşım, genotipin fenotipik ekspresyon paternleri ile tarafsız bir şekilde ilişkilendirilmesini sağlayarak mekanistik risk azaltmayı destekler. Yöntem, karma genotipli örnekler genelinde standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir ölçümler sunarak erken keşif aşamasındaki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Uzamsal olarak kısıtlanmış gen ekspresyon sinyallerinin tarafsız kantifikasyonu aracılığıyla terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Gözlemci yanlılığı olmadan mutant ve vahşi tip fenotiplerini karşılaştırmak için tutarlı bir iş akışı sağlar.
- Öngörücü Değer: Genetik modellerde anlamlı ekspresyon değişikliklerini arka plan gürültüsünden ayırt ederek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Temel ekspresyon profillerini oluşturarak, valide edilmiş biyolojik sistemleri sonraki bileşik tarama işlemleri için hazırlar.
- Tekrarlanabilirlik: Deneyler arası değişkenliği minimize etmek için görüntüleme ve analiz protokollerini standartlaştırır.
- Kantitatif Çıktı: Tedavi grupları arasında istatistiksel karşılaştırmaya uygun, ölçülebilir piksel yoğunluğu verileri üretir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Objektif fenotipik okumalar kullanarak, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar tutarlılığı sürdürür.
- Biyobelirteç Uyumu: Translasyonel biyobelirteç geliştirme için gen ekspresyon değişikliklerinin genotipik durumla korelasyonunu kolaylaştırır.
- Riskle Ayarlanmış Kararlar: Hedef doğrulama çalışmalarındaki yanlış pozitifleri azaltarak veri odaklı ilerleme kararlarına olanak tanır.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Yöntem, genotipik onaylamayı kantitatif fenotipik değerlendirme ile ilişkilendirerek erken keşif iş akışlarına entegre olur ve mekanistik risk azaltma yoluyla öncü bileşik tanımlamasını destekler.
- Keşif Biyolojisi: Gelişimsel yolaklardaki gen fonksiyonlarını açıklığa kavuşturmak için kantitatif mRNA dağılım verileri sağlayarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Güvenilir bileşik değerlendirmesi için tekrarlanabilir görüntüleme ve analiz koşulları aracılığıyla analiz standardizasyonuna olanak tanır.
- Analitik: Deneysel koşulların istatistiksel karşılaştırmasına imkan veren kantitatif yoğunluk ölçümleri ve arka planı çıkarılmış değerler sunar.
- Translasyonel Araştırma: Model sistemler genelinde tutarlı fenotipik skorlama sağlayarak keşif bulgularını preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla gene ve mutant hatta uygulanabilen, yeniden kullanılabilir bir genotipleme ve kantifikasyon platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Gen ekspresyon verilerindeki mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamasındaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış embriyo işleme ve görüntü analizi protokolleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Erken aşama programlarda sermaye tahsisi için objektif veriler sağlayarak devam/durdur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Gerçek biyolojik etkileri teknik değişkenlikten ayırarak riskle uyumlu önceliklendirme sağlar.
Uygulama Hususları
- Zebrafish embriyosu kullanımı, mikroskopi ve temel genotipleme tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Dijital görüntüleme özellikli stereo mikroskopiye ve analizler için Fiji yazılımına bağımlıdır.
- Görüntüleme koşullarının, pozlama sürelerinin ve arka plan düzeltme bölgelerinin ekipler arası standartlaştırılmasını gerektirir.
- Farklı zebrafish suşları ve gelişim aşamaları için adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Arka plan düzeltme optimizasyonu ile genotipleri belirsiz olan veya yüksek arka plan gürültüsüne sahip örneklerin hariç tutulması gibi pratik sınırlamaları kapsar.
