Zebrabalığında Situ Hibridizasyon Boyamada Genotibrasyon ve Nicelik
January 28th, 2020
Gen düzenleme teknolojileri, araştırmacıların gen fonksiyonlarını göreceli kolaylıkla araştırmak için zebra balığı mutantları oluşturmalarını sağlamıştır. Burada, zebra balıklarında in situ hibridizasyon sinyallerinin paralel embriyo genotiplemesi ve nicelemesi için bir kılavuz sa¤l›k sa¤l›k sa¤l›¤ › sa¤l›yor. Bu tarafsız yaklaşım, in situ hibridizasyona dayalı fenotipik analizlerde daha fazla doğruluk sağlar.
Gen ekspresyonu üzerindeki mutasyonların sonuçları genellikle yerinde hibridizasyon tarafından nitel olarak değerlendirilir ve genellikle görsel olarak puanlandırılır, bu da araştırmacının beklentilerine göre öznel ve önyargılıdır. Bu yöntem, görüntü yoğunluklarını ölçerek yerinde deneyleri karşılaştırmak için daha tutarlı bir yol sağlar ve bu sapmayı kaldırır. Bu aynı zamanda kolayca bir gen ekspresyonu okuyucu olarak yerinde hibridizasyon kullanan diğer model sistemlerine adapte edilebilir.
In situ hibridizasyon-veya ISH-lekeli embriyolar görüntüleme ile başlayın. Bir gliserol çözeltisi hazırlamak ve homojenize etmek için karıştırın. Üç mililitrelik Pasteur pipet ile gliserol çözeltisine embriyolar transfer ve en az beş dakika yerleşmek için bırakın.
Hazırlamak ve görüntüleme den sonra ISH lekeli embriyolar aktarmak için yeterli PCR tüpleri etiket, sonra bir cam depresyon slayt kuyunun altına% 100 gliserol eklemek için üç mililitrelik Pasteur pipet kullanın. Tek bir ISH vitraylı embriyoyu cam kaydırağa aktarın ve dijital fotoğraf makinesi ve alt ve üst aydınlatma ile donatılmış stereo mikroskop altında yönlendirin. İlk embriyoyu kullanarak, aydınlatma ve maruz kalma süresini istenilen büyütmede ayarlayın.
Gerektiği kadar embriyo görüntüleyin ve her görüntüyü benzersiz bir sayıyla etiketleyin. Görüntülemeden sonra, her embriyo aynı sayıda etiketli bir PCR tüpüne transfer ve gerekirse PCR tüplerden aşırı gliserol aspire. DNA ayıklamak için, her tüpe HoTSHOT gibi bir alkali lysis tampon 40 ila 75 mikrolitre ekleyin.
Tüpleri 95 derecede yaklaşık 30 dakika kuluçkaya yatırın ve sonra 4 santigrat dereceye kadar soğutun. Nötralizasyon tamponeşit hacimli ekleyin ve ilgi mutasyonu için genotipleme ile devam edin. Görüntü analizi gerçekleştirmek için, Fiji'deki resmi seçin ve açın ve Edit'i tıklatarak görüntüyü ters çevirin ve ardından Resim sekmesini tıklatarak, Tür'ü seçerek ve 8 bit seçerek görüntü türünü 8-bit'e dönüştürün.
Çokgen aracını seçin ve ölçülecek ISH sinyalini içeren bölge çevresindeki görüntüye ilgi veya YG bölgesini el ile çizin. YG Yöneticisi'ni açmak ve ilgi çekici bölgeyi seçmek için T tuşuna basın ve ardından Ölçü'ye tıklayın. Sonuçlar penceresinden ortalama değeri elektronik tabloya kopyalayın.
Arka plan yoğunluğunu ölçmek için, yG'yi embriyodaki bir bölgeye boyama olmadan taşıyın ve YG Yöneticisi'ni ekle'yi tıklatın. Arka plan bölgesini seçin ve Ölçü'ye tıklayın, ardından ortalama yoğunluk değerini elektronik tabloya kaydedin. LEKEli bölgeden arka planın ortalama yoğunluğunu çıkararak NC2 hibridizasyon sinyalinin ortalama piksel yoğunluğunu elde edin.
Her numunenin ortalama piksel yoğunluğunu belirledikten sonra, her örneğe bir genotip atayın. Genotip belirlenemiyorsa, numuneyi sonraki analizden dışlar. Ortalama örneklem yoğunluğu değerlerini genotiplere göre sıralayın ve istatistiksel testlere devam edin.
Bu tekniğin yararı dnmt3bb için ISH gösterilmiştir. 1 bir runx1 heterozigot incross gelen embriyolarda. dnmt3bb bir azalma.
Runx1 homozigot mutantlarda 1 ekspresyon saptanırken heterozigot embriyolar dnmt3bb'de anlamlı bir farklılık göstermedi. 1 ifade. Lmo4 mutasyonunun runx1 ekspresyonu üzerindeki etkisini belirlemeye çalışırken, bu analiz yabani tip ve homozigot lmo4 mutantları arasında anlamlı ifade farklılıkları göstermedi.
Ancak tek embriyo qPCR ile runx1 ekspresyonunda küçük bir azalma saptanır. Runks1-probed embriyoların yaklaşık% 0.4, ISH sinyal çıkarılır zaman negatif bir sayı ile sonuçlanan yüksek bir arka plan vardı. Bu gibi durumlarda, embriyolar analiz dışı bırakıldı.
Embriyolar üzerinde dört farklı bölgelerde arka plan düzeltmeleri optimize etmek için test edilmiştir. Arka plan alanlarının herhangi birinde Yatırım Getirisi'nin yoğunluğunda nispeten kararlı bir fark olsa da, R3 her zaman Yatırım Getirisi'nden daha yüksek yoğunluk gösterdi ve arka plan düzeltmesi için kullanılmamalıdır. R1 ve R4 arka plan düzeltme için en uygun alanlar olduğunu kanıtladı.
Görüntüleme için en iyi koşulları bulmak ve deney boyunca değişmeden tutmak önemlidir. Ayrıca, her bir örneğe bir genotip atamadan önce piksel yoğunluğunun ölçülmesini öneririz.
Genel Bakış
Bu makale, zebra balıklarında paralel embriyo genotipi belirleme ve in situ hibridizasyon sinyallerinin niceliği için bir yöntem sunmaktadır. Bu tarafsız yaklaşımı kullanarak, araştırmacılar fenotipik analizlerde daha yüksek doğruluk elde edebilirler.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Genetik
- Gelişimsel Biyoloji
Arka Plan
- Gen düzenleme teknolojileri, zebra balığı mutantlarının oluşturulmasını kolaylaştırır.
- In situ hibridizasyon, gen ekspresyonunu değerlendirmek için yaygın bir yöntemdir.
- Geleneksel puanlama yöntemleri önyargı ve öznelliği ortaya çıkarabilir.
- Bu çalışma, daha tutarlı ve nicel bir yaklaşım sağlamayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Zebra balıklarında fenotipik analizlerin doğruluğunu artırmak.
- Embriyo genotipi belirleme için standart bir yöntem sağlamak.
- In situ hibridizasyon sinyallerini objektif olarak nicellemek.
Kullanılan Yöntemler
- Stereo mikroskop kullanarak ISH boyalı embriyoların görüntülenmesi.
- Embriyo transferi için gliserol solüsyonlarının hazırlanması.
- DNA ekstraksiyonu için alkalin liz tamponunun kullanılması.
- Görüntü analizi ve nicelleme için Fiji yazılımının kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Runx1 homozigot mutantlarında dnmt3bb.1 ekspresyonunda azalma gösterilmiştir.
- Görüntü analizi için uygun arka plan düzeltme alanları belirlenmiştir.
- Yabani tip ve lmo4 homozigot mutantlar arasında ekspresyonda önemli farklılıklar gösterilmemiştir.
- Piksel yoğunluğuna dayalı olarak genotiplerin atanması için güvenilir bir yöntem sağlanmıştır.
Sonuçlar
- Yöntem, gen ekspresyon analizinin güvenilirliğini artırır.
- Diğer model sistemlerde kullanılmak üzere uyarlanabilir.
- Doğru sonuçlar için tutarlı görüntüleme koşullarının korunması kritik öneme sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ hybridization analysis reduces subjectivity in gene expression assessment, improving data reliability for target validation in zebrafish models. This approach supports mechanistic de-risking by enabling unbiased correlation of genotype with phenotypic expression patterns. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing standardized, replicable measurements across mixed-genotype samples.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through unbiased quantification of spatially restricted gene expression signals.
- Operational Value: Provides a consistent workflow for comparing mutant and wild-type phenotypes without observer bias.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing significant expression changes from background noise in genetic models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline expression profiles.
- Reproducibility: Standardizes image acquisition and analysis protocols to minimize inter-experiment variability.
- Quantitative Output: Generates measurable pixel intensity data suitable for statistical comparison across treatment groups.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains consistency from discovery through preclinical validation by using objective phenotypic readouts.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of gene expression changes with genotypic status for translational biomarker development.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables data-driven advancement decisions by reducing false positives in target validation studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by linking genotypic confirmation with quantitative phenotypic assessment, supporting lead identification through mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing quantitative mRNA distribution data to clarify gene function in developmental pathways.
- Screening: Enables assay standardization through reproducible imaging and analysis conditions for reliable compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative intensity measurements and background-subtracted values that enable statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by ensuring consistent phenotypic scoring across model systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genotyping and quantification platform applicable to multiple genes and mutant lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in gene expression data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized embryo handling and image analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing objective data for capital allocation in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by distinguishing true biological effects from technical variability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, microscopy, and basic genotyping techniques.
- Dependent on stereo microscopy with digital imaging capabilities and Fiji software for analysis.
- Necessitates cross-team standardization of imaging conditions, exposure times, and background correction regions.
- Involves adaptation considerations for different zebrafish strains and developmental stages.
- Includes practical limitations such as background correction optimization and exclusion of samples with indeterminate genotypes or high background noise.
