Name: ΓH2AX ve Apoptosisin Genotoksik Stres sonrası Akış Sitometrisi ile Hücre Döngüsüne Özgü Ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Öğrenin, akış sitometrisi ile γH2AX ve apoptozu ölçerek hücre döngüsüne özgü DNA hasarı yanıtlarını değerlendirin. Bu yöntem, radyobiyoloji ve onkolojide tedavi etkinliğini analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Alman Kanser Araştırma Merkezi'ndeki (DKFZ) Flow Sitometri Tesisi ekibine desteklerinden dolayı teşekkür ederiz.

<ol><li>Jensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+non-small+cell+lung+cancer+with+intensity-modulated+radiation+therapy+in+combination+with+cetuximab%3A+the+NEAR+protocol+%28NCT00115518%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Treatment of non-small cell lung cancer with intensity-modulated radiation therapy in combination with cetuximab: the NEAR protocol (NCT00115518).</a> BMC Cancer. 6, 122(2006).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Glioblastoma+and+Carcinoma+Xenograft+Tumors+Treated+by+Combined+Radiation+and+Imatinib+%28Gleevec%29%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Human Glioblastoma and Carcinoma Xenograft Tumors Treated by Combined Radiation and Imatinib (Gleevec).</a> Strahlentherapie und Onkologie. 182 (7), 400-407 (2006).</li>
<li>Timke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor%2FPlatelet-Derived+Growth+Factor+Receptor+Inhibition+Markedly+Improves+Radiation+Tumor+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Combination of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor/Platelet-Derived Growth Factor Receptor Inhibition Markedly Improves Radiation Tumor Therapy.</a> Clinical Cancer Research. 14 (7), 2210-2219 (2008).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimodal+glioblastoma+treatment+consisting+of+concurrent+radiotherapy%2C+temozolomide%2C+and+the+novel+TGF-%CE%B2+receptor+I+kinase+inhibitor+LY2109761%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Trimodal glioblastoma treatment consisting of concurrent radiotherapy, temozolomide, and the novel TGF-β receptor I kinase inhibitor LY2109761.</a> Neoplasia. 13 (6), 537-549 (2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
<li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage%2C+Aging%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">DNA Damage, Aging, and Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 361 (15), 1475-1485 (2015).</li>
<li>Rodgers, K., McVey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Error-Prone+Repair+of+DNA+Double-Strand+Breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Error-Prone Repair of DNA Double-Strand Breaks.</a> Journal of Cellular Physiology. 231 (1), 15-24 (2016).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+Damage+Response%3A+Making+It+Safe+to+Play+with+Knives%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA Damage Response: Making It Safe to Play with Knives.</a> Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).</li>
<li>Rothkamm, K., Krüger, I., Thompson, L. H., Löbrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+DNA+double-strand+break+repair+during+the+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (16), 5706-5715 (2003).</li>
<li>Escribano-Díaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cell+Cycle-Dependent+Regulatory+Circuit+Composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+Controls+DNA+Repair+Pathway+Choice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A Cell Cycle-Dependent Regulatory Circuit Composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP Controls DNA Repair Pathway Choice.</a> Molecular Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li>
<li>Bakr, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+crosstalk+between+DNA+damage+response+proteins+53BP1+and+BRCA1+regulates+double+strand+break+repair+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">Functional crosstalk between DNA damage response proteins 53BP1 and BRCA1 regulates double strand break repair choice.</a> Radiotherapy and Oncology. 119 (2), 276-281 (2015).</li>
<li>Mladenov, E., Magin, S., Soni, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+repair+in+higher+eukaryotes+and+its+role+in+genomic+instability+and+cancer%3A+Cell+cycle+and+proliferation-dependent+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break repair in higher eukaryotes and its role in genomic instability and cancer: Cell cycle and proliferation-dependent regulation.</a> Seminars in Cancer Biology. 37-38, 51-64 (2016).</li>
<li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response+of+clinical+carbon+ion+versus+photon+radiation+in+human+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">DNA damage response of clinical carbon ion versus photon radiation in human glioblastoma cells.</a> Radiotherapy and Oncology. 133, 77-86 (2019).</li>
<li>Oertel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+suberoylanilide+hydroxamic+acid+with+heavy+ion+therapy+shows+promising+effects+in+infantile+sarcoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+oncology%22%5BJournal%5D)">Combination of suberoylanilide hydroxamic acid with heavy ion therapy shows promising effects in infantile sarcoma cell lines.</a> Radiation oncology. 6 (1), 119(2011).</li>
<li>Blattmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+affects+%CE%B3H2AX+expression+in+osteosarcoma%2C+atypical+teratoid+rhabdoid+tumor+and+normal+tissue+cell+lines+after+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Strahlentherapie+und+Onkologie%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid affects γH2AX expression in osteosarcoma, atypical teratoid rhabdoid tumor and normal tissue cell lines after irradiation.</a> Strahlentherapie und Onkologie. 188 (2), 168-176 (2012).</li>
<li>Thiemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+efficacy+of+the+histone+deacetylase+inhibitor+suberoylanilide+hydroxamic+acid+in+combination+with+radiotherapy+in+a+malignant+rhabdoid+tumor+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">In vivo efficacy of the histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid in combination with radiotherapy in a malignant rhabdoid tumor mouse model.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 52(2012).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+retain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+exposure+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells retain their defining stem cell characteristics after exposure to ionizing radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 87 (5), 1171-1178 (2013).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+resistant+to+carbon+ion+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are resistant to carbon ion radiotherapy.</a> Oncotarget. 6 (4), 2076-2087 (2015).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+exhibit+resistance+to+topoisomerase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+letters%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells exhibit resistance to topoisomerase inhibition.</a> Cancer letters. 374 (1), 75-84 (2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+maintain+their+defining+stem+cell+characteristics+after+treatment+with+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells maintain their defining stem cell characteristics after treatment with cisplatin.</a> Scientific Reports. 6, 20035(2016).</li>
<li>Nicolay, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+are+sensitive+to+bleomycin+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells are sensitive to bleomycin treatment.</a> Scientific Reports. 6, 26645(2016).</li>
<li>Rühle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin+radiosensitizes+radioresistant+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Cisplatin radiosensitizes radioresistant human mesenchymal stem cells.</a> Oncotarget. 8 (50), 87809-87820 (2017).</li>
<li>Münz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+lose+their+functional+properties+after+paclitaxel+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells lose their functional properties after paclitaxel treatment.</a> Scientific Reports. 8 (1), 312(2018).</li>
<li>Rühle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Radiation+Resistance+of+Human+Multipotent+Mesenchymal+Stromal+Cells+Is+Independent+of+Their+Tissue+of+Origin%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">The Radiation Resistance of Human Multipotent Mesenchymal Stromal Cells Is Independent of Their Tissue of Origin.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 100 (5), 1259-1269 (2018).</li>
<li>Dean, P. N., Jett, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mathematical+analysis+of+DNA+distributions+derived+from+flow+microfluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mathematical analysis of DNA distributions derived from flow microfluorometry.</a> Journal of Cell Biology. 60 (2), 523-527 (1974).</li>
<li>Fox, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+the+computer+analysis+of+synchronous+DNA+distributions+obtained+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">A model for the computer analysis of synchronous DNA distributions obtained by flow cytometry.</a> Cytometry. 1 (1), 71-77 (1980).</li>
<li>Costes, S. V., Boissière, A., Ravani, S., Romano, R., Parvin, B., Barcellos-Hoff, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+features+that+discriminate+between+foci+induced+by+high-+and+low-LET+radiation+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Imaging features that discriminate between foci induced by high- and low-LET radiation in human fibroblasts.</a> Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).</li>
<li>Meyer, B., Voss, K. -O., Tobias, F., Jakob, B., Durante, M., Taucher-Scholz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucleic Acids Research. 41 (12), 6109-6118 (2013).</li>
<li>Lopez Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+light+microscopy+shows+nanostructure+of+carbon+ion+radiation-induced+DNA+double-strand+break+repair+foci%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB%22%5BJournal%5D)">Superresolution light microscopy shows nanostructure of carbon ion radiation-induced DNA double-strand break repair foci.</a> FASEB. 30 (8), 2767-2776 (2016).</li>
<li>Schipler, A., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand-break+complexity+levels+and+their+possible+contributions+to+the+probability+for+error-prone+processing+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand-break complexity levels and their possible contributions to the probability for error-prone processing and repair pathway choice.</a> Nucleic Acids Research. 41 (16), 7589-7605 (2013).</li>
<li>Stenerlow, B., Hoglund, E., Carlsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+fragmentation+by+charged+particle+tracks%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Space+Research%22%5BJournal%5D)">DNA fragmentation by charged particle tracks.</a> Advances in Space Research. 30 (4), 859-863 (2002).</li>
<li>Friedland, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+track-structure+based+evaluation+of+DNA+damage+by+light+ions+from+radiotherapy-relevant+energies+down+to+stopping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comprehensive track-structure based evaluation of DNA damage by light ions from radiotherapy-relevant energies down to stopping.</a> Scientific Reports. 7, 45161(2017).</li>
<li>Pang, D., Chasovskikh, S., Rodgers, J. E., Dritschilo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+DNA+Fragments+Are+a+Hallmark+of+Heavy+Charged-Particle+Irradiation+and+May+Underlie+Their+Greater+Therapeutic+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Short DNA Fragments Are a Hallmark of Heavy Charged-Particle Irradiation and May Underlie Their Greater Therapeutic Efficacy.</a> Frontiers in Oncology. 6, 130(2016).</li>
<li>Böcker, W., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Methods+for+analysis+of+foci%3A+validation+for+radiation-induced+gamma-H2AX+foci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Computational Methods for analysis of foci: validation for radiation-induced gamma-H2AX foci in human cells.</a> Radiation Research. 165 (1), 113-124 (2006).</li>
<li>Löbrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3H2AX+foci+analysis+for+monitoring+DNA+double-strand+break+repair%3A+Strengths%2C+limitations+and+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">γH2AX foci analysis for monitoring DNA double-strand break repair: Strengths, limitations and optimization.</a> Cell Cycle. 9 (4), 662-669 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Özellikli yöntem kullanımı kolaydır ve çift iplikçik break (DSB) indüksiyon ve onarım, hücre döngüsü etkileri ve apoptotik hücre ölümü de dahil olmak üzere DNA hasar yanıtı hızlı, doğru ve tekrarlanabilir ölçüm sunuyor. Bu uç noktaların birleşimi, bireysel tahlillerden daha fazla ilişki ortamı sağlar. Bu yöntem, radyasyon biyolojisi, tedavisi ve korunması alanlarında ve daha genel olarak onkolojide (örn. çevresel risk faktörü değerlendirmesi, ilaç taraması ve genetik değerlendirme için) kapsamlı bir genotoksisite talimi ...

Onkolojinin amacı normal hücrelere zarar vermeden kanser hücrelerini öldürmek veya inaktive etmektir. Birçok tedaviler ya doğrudan ya da dolaylı olarak kanser hücrelerinde genotoksik stres neden, ama aynı zamanda bazı normal hücrelerde genişletmek. Kemoterapi veya hedefli ilaçlar genellikle radyasyonlu tümör 1 radyosensitivite artırmak için radyoterapi ile birleştirilir1,2,3,4,5, hangi bir azalma sağlar normal doku hasarı en aza indirmek için radyasyon dozu.
Iyonlaştırıcı radyasyon ve diğer genotoksik ajanlar, baz modifikasyonları, iplikçik çapraz bağlantıları ve tek veya çift iplikçikli kırılmalar da dahil olmak üzere farklı türde DNA hasarına neden olur. DNA çift iplikçiksi sonları (DSB' ler) en ciddi DNA lezyonlarıdır ve indüksiyonları radyokemoterapide iyonlaştırıcı radyasyon ve çeşitli sitostatik ilaçların hücre öldürücü etkisinin anahtarıdır. DSB'ler sadece genomun bütünlüğüne zarar vermekle kalmıyor, aynızamanda mutasyonların oluşumunu teşvik 6,7. Bu nedenle, farklı DSB onarım yolları, ve mekanizmalar apoptoz gibi onarılamaz hasarlı hücreleri ortadan kaldırmak için evrim sırasında geliştirilmiştir. Tüm DNA hasar yanıtı (DDR) DNA hasarı tanıma ve hücre döngüsü tutuklama DNA onarımı için izin vermek için ulaşmak sinyal yolları karmaşık bir ağ tarafından düzenlenir, programlanmış hücre ölümü veya inaktivasyon onarım başarısızlık durumunda8.
Sunulan akış sitometrik yöntemi, DSB indüksiyon ve onarımının yanı sıra onarım arızalarının sonuçlarını kapsayan kapsamlı bir analizde genotoksik stresten sonra DDR'yi araştırmak için geliştirilmiştir. Yaygın olarak uygulanan DSB marker γH2AX'ın ölçümü ile hücre döngüsünün analizi ve apoptozin indüksiyonu, klasik subG1 analizi ve caspase-3 aktivasyonunun daha spesifik değerlendirilmesi ile birleştirir.
Bu uç noktaların tek bir teşrindeki birleşimi sadece zaman, işçilik ve maliyet giderlerini azaltmaz, aynı zamanda hücre döngüsüne özgü DSB indüksiyon ve onarım ölçümünün yanı sıra caspase-3 aktivasyonunu da sağlar. Bu tür analizler bağımsız olarak yapılan tahlillerle mümkün değildir, ancak genotoksik stres sonrası DNA hasar yanıtının kapsamlı bir şekilde anlaşılması için son derece önemlidir. Birçok anti-kanser ilaçları, sitostatik bileşikler gibi, hücreleri bölen karşı yönlendirilir ve verimlilik güçlü hücre döngüsü aşamasına bağlıdır. Farklı DSB onarım süreçlerinin durumu da hücre döngüsü aşaması ve onarım doğruluğu için kritik olan yol seçimi bağlıdır ve sırayla hücre nin kaderini belirler9,10,11, 12. Yıl. Buna ek olarak, DSB düzeylerinin hücre döngüsüne özgü ölçümü havuzlu analizden daha doğrudur, çünkü DSB düzeyleri sadece bir genotoksik bileşiğin veya radyasyonun dozuna değil, aynı zamanda hücrenin DNA içeriğine de bağlıdır.
Bu yöntem glioblastoma13 direnç mekanizmaları aşmak için farklı radyoterapilerin etkinliğini karşılaştırmak ve osteosarkom 14,15 iyonlaştırıcı radyasyon ve hedefli ilaçlar arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılmıştır ve atipik teratoid rabdoid kanserler16. Ayrıca, açıklanan yöntem yaygın olarak mezenkimal kök hücreler üzerinde radyo ve kemoterapi yan etkilerini analiz etmek için kullanılmıştır17,18,19,20,21, 22,23,24, tedavikaynaklı normal doku hasarının onarımı için gerekli olan ve rejeneratif tıpta potansiyel bir uygulama var.

<table><tbody><tr><td>1.000 ve mikro; L filtre uçları</td><td>Nerbe plus</td><td>07-693-8300</td><td></td></tr><tr><td>100-1.000 & mikro; L pipet</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm Hücre Süzgeç Kapaklı Tüpler, 35 & m gözenek boyutu</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tüpler</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>200 & mikro; L filtre uçları</td><td>Nerbe plus</td><td>07-662-8300</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &mikro; L pipet</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>4 ', 6-Diamidin-2-fenilindol (DAPI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>200 & mikro'da suda çözülür; g / mL ve alikotları -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-H2A.X Fosfo (Ser139) Antikoru, RRID: AB_2248011</td><td>BioLegend</td><td>613406</td><td>1:20 Seyreltik</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Tavşan Anti-Aktif Kaspaz-3 Antikoru, AB_1727414</td><td>BD Pharmingen</td><td>560626</td><td>Seyreltik 1:20</td></tr><tr><td>BD FACSClean çözümü</td><td>BD Biosciences</td><td>340345</td><td>Ölçümden sonra sitometre temizleme rutini için</td></tr><tr><td>BD FACSRinse solüsyonu</td><td>BD Biosciences</td><td>340346</td><td>Ölçümden sonra sitometre temizleme rutini için</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Tuz (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L 182</td><td>Suda 1x konsantrasyona kadar çözün</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'u stabil glutamin ile</td><td>Biochrom</td><td>FG 0415</td><td>Protokolde kullanılan örnek hücre hattı için rutin hücre kültürü materyali</td></tr><tr><td>Etanol mutlak</td><td>VWR</td><td>20821.330</td><td></td></tr><tr><td>Excel yazılımı</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS Superior (fetal sığır serumu)</td><td>Biochrom</td><td>S 0615</td><td>Protokolde kullanılan örnek hücre hattı için rutin hücre kültürü materyali</td></tr><tr><td>FlowJo v10 yazılımı</td><td>LLC</td><td>çevrimiçi sipariş</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>Lekeli numunelerden mikroskobik slaytların isteğe bağlı olarak hazırlanması için gömme ortamı</td></tr><tr><td>Katlanmış selüloz filtreler, sınıf 3hw</td><td>NeoLab</td><td>11416</td><td></td></tr><tr><td>LSRII veya LSRFortessa sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Calbiochem</td><td>474787</td><td>apoptoz pozitif kontrol için isteğe bağlı ilaç</td></tr><tr><td>Multifuge 3SR +</td> <td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>AppliChem</td><td>A3813</td><td>% 4.5 çözeltiyi taze hazırlayın. PBS'de 80 ° C'ye ısıtarak seyreltin; Çeker ocak altında yavaş karıştırarak C. Isı kaybını önlemek için şişeyi alüminyum folyo ile örtün. Çözeltiyi oda sıcaklığına soğumaya bırakın ve son hacmi ayarlayın. Çözeltiyi bir selüloz filtreden geçirin.</td></tr><tr><td>Fosfo-Histon H3 (Ser10) (D2C8) XP Tavşan mAb (Alexa Fluor&reg; 555 Eşlenik) RRID: AB_10694639</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td> <td># 3475</td><td>Seyreltik 3:200</td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2</td><td>Integra Biosciences</td><td>155 016</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipetler, 10 mL</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipetler, 25 mL</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipetler, 5 mL</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>SuperKillerTRAIL (modifiye TNF ile ilişkili apoptozu indükleyen ligand)</td> <td>Biomol</td><td>AG-40T-0002-C020</td><td>apoptoz pozitif kontrol için isteğe bağlı ilaç</td></tr><tr><td>T25 hücre kültürü şişeleri</td><td>Greiner bio-one</td><td>690160</td><td>Protokolde kullanılan örnek hücre hattı için rutin hücre kültürü materyali</td></tr><tr><td>Tripsin/EDTA</td><td>PAN</td><td>Biotech P10-025500</td><td>U87 MG glioblastoma hücreleri protokolünde kullanılan örnek hücre hattı için rutin hücre kültürü materyali</td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>ATCC-HTB-14</td><td>Protokolde kullanılan örnek hücre hattı</td></tr></tbody></table>

Γh2ax ve apoptosis'in genotoksik stres sonrası akış sitometrisi ile hücre döngüsüne Özgü Ölçümü

Cell Cycle-specific Measurement of &#947;H2AX and Apoptosis After Genotoxic Stress by Flow Cytometry

Sunulan yöntem veya biraz değiştirilmiş versiyonları klinik onkolojide kullanılan çeşitli anti-kanser tedavilerinin spesifik tedavi yanıtlarını ve yan etkilerini incelemek için geliştirilmiştir. Radyoterapi ve çok sayıda anti-kanser ilacının indüklediği gibi, genotoksik stres sonrası DNA hasar yanıtının kantitatif ve uzunlamasına analizini sağlar. Yöntem DNA hasar tepkisinin tüm aşamalarını kapsamaktadır, dna çift iplikçikli sonları (DSBs), hücre döngüsü durması ve onarım apoptosis ile hücre ölümü için uç noktaları sağlar. Bu ölçümlerin birleştirilmesi hücre döngüsüne bağlı tedavi etkileri hakkında bilgi sağlar ve böylece hücresel proliferasyon ve DNA hasarına karşı başa çıkma mekanizmaları arasındaki etkileşimin derinlemesine incelenmesini sağlar. Kemoterapötik ajanlar ve iyonlaştırıcı radyasyon da dahil olmak üzere birçok kanser terapötik etkisi sınırlı dır veya güçlü belirli hücre döngüsü aşamalarına göre değişir, korelasyon analizleri tedavi etkilerini değerlendirmek için sağlam ve uygulanabilir bir yöntem güveniyor hücre döngüsüne özgü bir şekilde DNA üzerinde. Bu tek uç nokta lı denemeler ve sunulan yöntemin önemli bir avantajı ile mümkün değildir. Yöntem herhangi bir hücre hattı ile sınırlı değildir ve iyice tümör ve normal doku hücre hatları çok sayıda test edilmiştir. Çevresel risk faktörü değerlendirmesi, ilaç taraması ve tümör hücrelerindeki genetik istikrarsızlığın değerlendirilmesi de dahil olmak üzere radyo-onkolojinin yanı sıra onkolojinin birçok alanında kapsamlı bir genotoksisite teşbesi olarak yaygın olarak uygulanabilir.

İnsan U87 veya LN229 glioblastoma hücreleri 4 Gy foton veya karbon iyon radyasyonu ile ışınlandı. Hücre döngüsüne özgü γH2AX düzeyleri ve apoptoz, burada sunulan akış sitometrik yöntemi kullanılarak ışınlama dan sonra 48 saate kadar farklı zaman noktalarında ölçüldü (Şekil 3). Her iki hücre hattında da karbon iyonları daha yüksek γH2AX pik seviyelerini indükler ve aynı fiziksel dozdaki foton radyasyonuna kıyasla 24 ila 48 h'de önemli ölçüde yükselmiş olarak kaldılar (Şekil<strong class="xfig...

Sunulan yöntem DNA çift iplikçiks breaks (DSBs), hücre döngüsü dağılımı ve apoptosis kantitatif analizi birleştirerek DSB indüksiyon ve onarım hücre döngüsü özgü değerlendirilmesi yanı sıra onarım başarısızlık sonuçları sağlar.

ΓH2AX ve Apoptosis'in Genotoksik Stres sonrası Akış Sitometrisi ile Hücre Döngüsüne Özgü Ölçümü

The presented method or slightly modified versions have been devised to study specific treatment responses and side effects of various anti-cancer ...

Bu yöntem hücre döngüsüne bağımlı tedavi etkileri hakkında bilgi sağlar ve hücresel proliferasyon ve DNA hasarına karşı başa çıkma mekanizmaları arasındaki etkileşimin derinlemesine incelenmesine olanak sağlar. Bu yöntem, çift iplikçik frag tanıma ve onarımı, hücre döngüsü etkileri ve apoptoz ile nihai hücre ölümü gibi DNA hasar tepkisinden önemli uç noktaları kapsamlı bir analizde birleştirir. Bu tekniği daha çok klinik onkolojide radyokemoterapötik tedavilerin spesifik tedavi yanıtlarını ve yan etkilerini araştırmak için kullandık.Bu çalışma radyobiyoloji ve radyoterapi alanlarında ki korelasyon çalışmaları için çok yararlıdır, ancak onkolojinin çeşitli alanlarına da uygulanabilir. Standart hücre toplama prosedürlerine göre kültürden hücreleri topladıktan sonra, PBS bir mililitre pelet resuspend. Ve hücreleri bir başlıktaki iki mililitre fiksasyon çözeltisine aktarın.Oda sıcaklığında 10 dakikalık bir kuluçka dan sonra, santrifüj ile hücreleri toplamak ve supernatant decant. Hücreleri tek bir hücre süspansiyonu olarak sabitlemek ve tüm numuneler için fiksasyon süresini sabit tutmak önemlidir. Yapışık hücrelere, analiz için güzelce yuvarlatılmış hücreler elde etmek için ayırmak için yeterli zaman verin.Sonra dokunarak pelet gevşetin ve% 70 etanol üç mililitre hücreleri yeniden askıya. Boyama dan önce hücreleri yıkamak için, santrifüj ile hücreleri tortu ve dokunarak pelet gevşetin. Daha sonra üç mililitre yıkama çözeltisi ve bir mililitre yıkama çözeltisi ile bir yıkama çözeltisi ile iki ardışık yıkama ile hücreleri yeniden askıya alın.Her yıkama arasında supernatant atma. Son yıkamadan sonra, pelet rahatsız etmeden dikkatle supernatant aspire ve ilgi antikor kokteyl 100 mikrolitre lucent pelet resuspend. Oda sıcaklığında bir saat sonra, santrifüj ile hücreleri toplamak ve dikkatle pelet rahatsız etmeden supernatant aspire.Daha sonra, 100 ila 250 mikrolitre DNA boyama çözeltisi içinde gevşetilmiş pelet ifini yeniden askıya alın ve hücreleri 35 mikrometre lik örgü gözenek boyutuna sahip bir numune tüpünün hücre süzgeci kapağından geçirin. Akış sitometrisi ile hücreleri analiz etmek için, sitometre penceresindeki parametreler sekmesini açın ve tabloda belirtildiği gibi parametreleri seçin. Ardından, çalışma sayfası penceresini açın ve belirtildiği gibi çizimler oluşturun.Kontrol örneğini sitometreye yükleyin ve çalıştır düğmesine basın. Tarayıcı penceresindeki ilk tüpü seçin ve tüp adını tıklatın. Denetçi penceresinin parametreler sekmesinde ileri ve yan dağılım ve DAPI için dedektör voltajlarını ayarlayın.Yazılımdaki çalışma sayfası kurulumuna devam etmek için bekleme düğmesine basın. Yan dağılım alanı çizimine karşı ileri dağılım alanındaki hücrelerin popülasyonunu tanımlamak için çokgen geçit aracını kullanın ve DAPI'deki tek hücre popülasyonuna karşı DAPI alanı çizimini tanımlamak için dikdörtgen geçit aracını kullanın. Popülasyon hiyerarşisini göstermek için G denetimine basın ve bunları yeniden adlandırmak için varsayılan kapı adlarını tıklatın.Daha sonra, bağlam menüsünden popülasyonları ve tek hücreleri göstermek için tüm histogramların tümüne sağ tıklayın. Sinyalin tam dinamik aralığını kapsayacak şekilde antikor-coupled floroforlar için dedektör gerilimleri optimize etmek için kontrol ve tedavi örnekleri edinin. Örnekleri ölçmek için sitometredeki çalıştır düğmesine basın ve örnekleri ölçmek için yazılımdaki edinme panosunu kullanın.Ardından, verileri nokta FCS dosyaları olarak kaydetmek için iletişim kutusunda dizin dışa aktarmayı seçmek için dosya, dışa aktarma ve denemeleri seçin. Verileri değerlendirmek için nokta FCS dosyalarını akış sitometrik analiz yazılımının örnek tarayıcısına sürükleyin ve bırakın. Ve çokgen aracını kullanarak hücrelerin popülasyonunu ileri ve yan dağılım alanı çiziminde tanımlayın ve enkazı analizden hariç tonuyla dışla.DAPI alan çizimine karşı DAPI'de, tek hücre popülasyonunu tanımlamak ve çözümlemeden herhangi bir hücre çiftveya kümelenmesini dışlamak için dikdörtgen aracını kullanın. DAPI alan histogramında, normal DNA içeriği olan tek hücreleri bozulmuş DNA'lı apoptotik hücrelerden ayırt etmek için iki sektörlü aracı kullanın. Hücre döngüsü modelleme aracını açmak için takım biyolojisi ve hücre döngüsünü seçin ve G bir S ve G iki M evresindeki hücrelerin sıklığını tahmin etmek için Dean-Jett Fox'u seçin.Hücre döngüsüne özgü gama H iki A X ölçümü sağlamak için hücre döngüsü popülasyonunun DAPI alanı çizimine karşı DAPI ile DAPI'de G bir S ve G iki ve M faz kapıları oluşturun. Hücre döngüsü popülasyonunun Alexa 555 alan histogramındaki üç pozitif ve negatif hücreyi ayırmak ve tek hücre popülasyonunun Alexa 647 alan histogramındaki CAS baz üç pozitif ve negatif hücresini ayırt etmek için iki sektörel aracı kullanın. Tablo düzenleyicisini açmak ve tabloyu belirtildiği gibi yapılandırmak için Denetim T tuşuna basın.Ardından, menü şeridinin çıktı bölümündeki biçimi ve hedefi ayarlamak ve verileri bir elektronik sayfaya aktarmak için Dosyaya'yı seçin. Karbon iyonları glioblastoma hücrelerinde daha yavaş azalmak ve aynı fiziksel dozda foton radyasyonu ile karşılaştırıldığında 24 ila 48 saat içinde önemli ölçüde yüksek kalır yüksek gama H iki AX pik düzeyleri indükler. Hem karbon iyonları hem de foton radyasyonu için gama H iki AX seviyesi G bir fazlı hücrelerde en yüksekti çünkü DNA çift iplikçik kırma onarımı hücre döngüsünde bu aşamada homojen olmayan son birleştirme yolu ile sınırlıdır.Yüksek çift iplikçik kopma indüksiyon hızı ve daha yavaş onarım kinetik doğrultusunda, karbon iyonları G iki fazve fotonlar daha apoptosis daha yüksek bir oranda daha güçlü ve daha uzun süreli hücre döngüsü arrest neden. Tedavi etkisinin gücüne bağlı olarak, farklı hücre döngüsü aşamalarının çözünürlüğü zor olabilir. Bazı hücre hatlarında, DAPI konsantrasyonu hücre döngüsü profilinin kalitesi üzerinde büyük bir etkiye sahiptir ve ayarlanması gerekir.Gama H iki AX foci'nin sayısını, boyutunu ve şeklini değerlendirmek ve odak ve parnükleer gama H iki AX boyamasını ayırt etmek için akış sitometrisinden sonra kalan örneklerden slaytlar hazırlanabilir. Metodumuzu kullanarak, mezenkimal kök hücrelerin iyonlaştırıcı radyasyonlara ve topoizosentezine karşı nispeten dirençli olduğunu ancak gliomiasin e karşı hassas olduğunu gösterebiliriz. PFA dumanları toksik olduğundan, fiksasyon çözeltisini hazırlarken ve fiksasyon adımı sırasında her zaman bir duman başlığı kullanın.AYRıCA DAPI kullanırken eldiven giymeyi unutmayın.

cell-cycle-specific-measurement-h2ax-apoptosis-after-genotoxic-stress

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bir moleküler marker olarak γH2AX oluşumu kullanarak DNA çift iplikli çizgiler Niceleme radyasyon biyoloji paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada hücreler radyasyona maruz kaldıktan sonra γH2AX odakları ölçümü için immünofloresan testinin kullanımını göstermek.

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

ΓH2AX odaklarının dayanarak DNA çift iplikli sonlarının kantitasyonu doku radiosensitivity ve radyasyon değiştirerek bileşikler etkileri değerlendirilmesi için, özellikle radyasyon biyoloji, paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Burada doku örnekleri γH2AX odaklarının kantitatif bir immünofloresan testinin kullanımını göstermek.

Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu

Bu videoda, insan mononükleer hücrelerinde DNA çift sarmallı kırılma bölgelerinde lokalize olan spesifik DNA hasar yanıt proteinlerini tespit etmek için immünofloresan mikroskopi tekniğini açıklıyoruz. Proteinler, spesifik birincil antikorlar tarafından tanınır ve bu antikorlar, mikroskobik görselleştirme sırasında floresan olan florofor etiketli ikincil antikorlara bağlanır ve proteinlerin hücre çekirdeği içinde farklı floresan odaklar olarak görselleştirilmesini sağlar.

DNA Çift İplikli Kırılmaların Analizi için İmmünofloresan Mikroskobu

Bu protokol, zaman içinde belirli bir noktada S fazında olan hücrelerin zamansal izleme izin vermek için bromodeoksiüridin (BrdU) alımından kullanımını tarif eder. DNA boyalar ve antikor etiketleme eklenmesi daha sonraki zamanlarda S fazı hücrelerinin kaderi detaylı analizini kolaylaştırır.

Senkronizasyon Need for olmadan Akım Sitometri Kullanımı Hücre Döngüsü ilerleme zamansal İzleme

Fare dalak lenfositlerinde kronik in vivo düşük doz ışınlamanın neden olabileceği DNA hasar seviyelerindeki ve DNA onarım kapasitesindeki değişiklikleri, DNA çift sarmallı kırılmaların bir belirteci olan fosforile histon H2AX'i ölçerek, akış sitometrisi kullanarak değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır.

Kronik sonra fare dalak DNA hasar ve Onarım Ölçme<em&gt; In Vivo</em&gt; Beta ve gamma-Radyasyonun Çok Düşük Doz Maruz Kalma

Bu el yazması bir iletişim kuralı tarafından γH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu DNA çift iplikli kırılmalara analiz için sağlar.

ΓH2AX ve 53BP1 oluşumu ve DNA çift iplikli kırılmalara tamiri analiz etmek için ayirt mikroskobu

DNA hasarının ardından, insan hücreleri genomlarının bütünlüğünü geri yüklemek için gerekli onarım yollarını aktive ederler. Burada, dolaylı immünoffloresan yöntemini DNA onarım proteinlerini tespit etmek, mekansal ve zamansal işe alımlarını analiz etmek ve DNA hasarı nın olduğu yerlerde protein-protein etkileşimini sorgulamaya yardımcı olmak için bir araç olarak tanımlıyoruz.

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

Bu protokol, periferik kan lenfositleri üzerinde γ-H2AX odak analizinin slayt hazırlanmasını ve otomatik puanlamasını sunar. Tahlil yöntemini ve hassasiyetini göstermek için, izole lenfositler in vitroışınlandı. Dna DSB algılamanın bu otomatik yöntemi, hızlı ve yüksek verimli biyolojik dozimetri uygulamaları için yararlıdır.

İnsan Periferik Kan Lenfositlerinde γ-H2AX Odak Analizi için Otomatik Mikroskobik Puanlama Yöntemi

Burada, tek hücrelerde çoklu yaşlanma ile ilişkili belirteçlerin görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için akış sitometrisine dayalı bir yöntem sunuyoruz.

Tedaviye Bağlı Yaşlanan Kanser Hücrelerinde Çoklu Floresan Yaşlanma Belirteçlerinin Eşzamanlı Görüntüleme ve Akış Sitometrisine Dayalı Tespiti

Bu protokol, bleomisin ile tedavi edilen insan periferik lenfositlerinin interfaz çekirdeklerinde γH2AX ve 53BP1 odaklarının eşzamanlı tespiti yoluyla DNA çift iplikçik kırılmalarının oluşumunu ve onarımını değerlendirmek için bir yöntem sunmaktadır.

İnsan Periferik Lenfositlerinde γH2AX ve 53BP1'in İkili İmmünofloresansı

Burada, DNA hasar bölgelerinde protein etkileşiminin tespiti için basit ve hızlı bir protokol sunuyoruz.

DNA Hasar Bölgelerindeki Proteinleri Lokalize Etmek için Yakınlık Ligand Testi

Öğrenin, akış sitometrisi ile γH2AX ve apoptozu ölçerek hücre döngüsüne özgü DNA hasarı yanıtlarını değerlendirin. Bu yöntem, radyobiyoloji ve onkolojide tedavi etkinliğini analiz eder.

ΓH2AX ve Apoptosis'in Genotoksik Stres sonrası Akış Sitometrisi ile Hücre Döngüsüne Özgü Ölçümü

Daha fazla video keşfet