Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi
21 Ağustos 2019
Kantitatif Multipleks İmmünopantü (QMI), iki örnek arasındaki hedeflenen protein-protein etkileşimlerinin bolluğundaki farklılıkların hassas tespiti için akış sitometrisini kullanır. QMI biyomalzeme küçük bir miktar kullanılarak yapılabilir, genetiği değiştirilmiş etiketleri gerektirmez, ve daha önce tanımlanmış herhangi bir protein etkileşim ağı için adapte edilebilir.
Kantitatif çokkatlı co-immünoprepitasyon veya QMI, kullanıcıların önceden tanımlanmış bir protein etkileşimağında aynı anda yüzlerce ikili etkileşimi ölçmelerini sağlar. Biyoinformatik teknikleri, aynı anda birden fazla eş-IP gerçekleştirerek, eş-ilişkilendirme gruplarının nasıl eşgüdümlü bir şekilde değiştiğini inceleyebilir. Tahse geliştirmek için zaman alıcı, ancak Bir kez QMI paneli elinde ağ ölçek verileri nispeten basit bir gecede tahse sinyal iletim sistemleri hakkında toplanabilir.
QMI, farklı numunelerin ve reaktiflerin 96 kuyu plakasına doğru şekilde pipetlemesini gerektirir. Hataları önlemek için her bir titreyi kurarken ve çalıştırırken dikkatli notlar alınmalıdır. Numune hazırlama ve immünoprepitasyon için, numuneyi proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile uygun bir deterjanla buz üzerinde 15 dakikalık bir kuluçka için lysing ile başlayın.
Kuluçka sonunda, membranları ve döküntüleri çıkarmak için numuneyi aşağı doğru çevirin ve standart protokollere göre protein konsantrasyonunu belirlemek için süpernatant üzerinde bca tayini yapın. Protein konsantrasyonlarını normale döndürtükten sonra, her sınıf için yaklaşık 250 manyetik boncuk içeren bir manyetik boncuk ana karışımı hazırlayın. Numune başına 20 mikrolitre Fly P tamponu boncukları yeniden sumadan önce fly P tamponunda manyetik boncuk karışımını iki kez yıkamak için manyetik ayırmayı kullanın.
Ayrıntılı bir pipetleme den sonra, numune başına bir buz gibi mikrocentrifuge tüpüne 20 mikrolitre boncuk ekleyin ve immünoprediiçin her tüpe normalleştirilmiş protein konsantrasyonları ile eşit hacimlerde lysat ekleyin. Daha sonra her lysate numunesini çalıştırılan her bir plaka için bir tüpe bölün ve numuneleri ışıktan korunan dört derece lik bir rotatörde bir gecede immünoppresipitate edin. Ertesi sabah tüplerin ilk seti lysate kaldırmak ve yıkama başına buz gibi sinek P tampon 500 mikrolitre boncuk iki kez yıkamak için bir manyetik boncuk raf kullanın.
Resuspension hacmi hesaplandıktan sonra, buz soğuk Fly P tampon hesaplanan hacminde immünoppresipitates resuspend. Manyetik boncukları nazik pipetleme ile iyice askıya alın ve buz üzerinde düz dipli 96 kuyu plakası boyunca her biri 25 mikrolitre boncuk dağıtın. Farklı bir 96 kuyu plaka, iki kez çalışma konsantrasyonu attinilated prob antikorları tarafından seyreltin.
Her probuantikor seyreltme 25 mikrolitre dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın manyetik boncuk içeren manyetik boncuk uygun kuyulara ve karıştırmak ve manyetik boncuklar yeniden askıya almak için yatay bir plaka shaker üzerinde yüksek hızda sallamak. Karıştırma sonra, ışıktan korunan dört santigrat derece bir saat kuluçka için hızı azaltmak. Kuluçka sonunda, dört santigrat derece bir manyetik plaka yıkayarak başına taze Fly P tampon ile plaka üç kez yıkayın.
Son yıkamadan sonra, streptavidin PE 50 mikrolitre boncuk resuspend Fly P tampon bir ila 200 seyreltilmiş. Karışımı salla ve ışığı 30 dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırmadan önce boncukları yeniden askıya alın. Kuluçka sonunda, plakayı manyetik plakalı bir çamaşır makinesinde Fly P tamponuyla üç kez yıkayın ve 125 mikrolitre Fly P tamponundaki boncukları yeniden askıya alın.
900 dönüşte plakayı bir dakika boyunca çalkalayarak boncukları iyice askıya alın ve plakayı yeniden buzdolabına konan akış sitometresine yükleyin. Akış sitometre yazılımında, Yüksek RP1 Hedef ayarı, bölge başına 1.000 boncuk luk bir durdurma koşulu ve 80 mikrolitrelik bir örnek hacmi seçin. Yolu yarıladırve yerleşmeyi önlemek için boncukları askıya alın.
Çalıştırmanın sonunda, veri dosyalarını XML biçiminde dışa aktarın. ANC çözümlemesi gerçekleştirmek için, deneysel tasarımın ayrıntılarını yansıtacak şekilde ANC giriş dosyasını doldurun ve etkin dizine bir CSV dosyası yazacak programı çalıştırın. Dosya isabetle bitiyor.
csv, kontrol ve deneysel koşullar arasında 0,05 yanlış pozitif düzeyde önemli ölçüde farklı olan protein ortak çağrışımlarını dört deneysel kopyadan en az üçünde rapor edecektir. Ağırlıklı korelasyon ağ çözümlemesi için, mfi ile biten Matlab tarafından veri dosyası çıktısının sütun başlıklarını yapıştırın. csv yeni bir elektronik tablonun ilk sütununa ve deney numarası ve deney tedavisi için Tedavi ve analiz edilecek diğer değişkenler için Deney sütunları ekleyin.
Bu dosyayı özellik olarak kaydedin. csv ve açık R Studio. Çalışma dizini mfi içeren bir klasöre ayarlayın.
csv ve özellikleri. csv dosyaları, kod bölümlerini vurgulayın ve yorumlanan Komut dosyasında belirtildiği gibi R komutlarını çalıştırmak için Komut girin'i vurdu. Her bir deneysel özellik ile önemli ölçüde ilişkili ağırlıklı korelasyon ağ analizi modülleri bir grafik dosyası olarak çıktı ve her bir modül ile her etkileşimkore csv dosyası olarak çıktı olacaktır.
ANC çıktı dosyasındaki her etkileşim için, bu etkileşimin CNA tarafından da önemli olup olmadığını belirleyin ve her ANC isabetinin de CNA isabeti olup olmadığını belirten yeni bir sütun oluşturun. Değerleri iki kat değişiklik günlüğe dönüştürün ve tüm ANC birleşim CNA isabetleri için ortalama değeri hesaplayın. Son olarak, immünopredem hedefi tarafından bir sütunda listelenen her ANC birliği CNA isabet, ikinci sütunda sonda hedefi ve üçüncü sütunda kat değişim değeri ile yeni bir elektronik tablo yapın.
Düğüm kenarı diyagramı oluşturmak için bu dosyayı ağ olarak Cytoscape'e aktarın. İki bağımsız istatistiksel yaklaşımla tanımlanan yüksek güven protein etkileşimleri, açık kaynak yazılımı Cytoscape kullanılarak düğüm kenarı diyagramları veya ek malzemede yer alan R kodu ve analiz yönergeleri kullanılarak ısı haritaları olarak görselleştirilmiştir. Protokol boyunca, kullanıcıların pipetlere doğru bir şekilde dikkat etmesi, titiz kayıtları tutması ve numuneleri her zaman soğuk tutması gerekir.
Sinyal transdüksiyon yollarının farklı giriş türleri arasında nasıl ayrım dığını ve birden fazla reseptörden gelen bilgileri nasıl entegre ettiğimizi anlamak için QMI'yi kullandık.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Kantitatif multipleks eş-immunoprecipitasyon (QMI), tanımlı bir ağ içindeki sayısız protein-protein etkileşimlerinin eşzamanlı ölçümü için izin verir. Bu yöntem, minimal biyomateryal gerektirir ve genetik olarak mühendislik yapılmış etiketler gerektirmez.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyokimya
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- QMI, örnekler arasındaki protein etkileşimlerindeki farklılıkların tespit edilmesini sağlar.
- Test, çeşitli protein etkileşim ağları için uyarlanabilir.
- Sinyal iletim sistemleri hakkında ağ ölçeğinde veri toplamaya izin verir.
- Hataları önlemek için dikkatli pipetleme ve kurulum kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Protein ağlarındaki ikili etkileşimleri ölçmek.
- Eş-ilişkilerin koordine bir şekilde nasıl değiştiğini analiz etmek.
- Karmaşık biyolojik sistemleri incelemek için güvenilir bir test geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- 96 kuyu plakalarda eşzamanlı eş-immunoprecipitasyon.
- Inhibitorler içeren uygun deterjanlar kullanılarak numunelerin lizisi.
- Veri analizi için biyoinformatik teknikleri.
- Veri toplama için gece boyu testler.
Ana Sonuçlar
- QMI, protein etkileşimlerinin hassas tespiti sağlar.
- Karmaşık sinyal iletim yollarının çalışmasını kolaylaştırır.
- Protein ağlarının yüksek verimli analizini sağlar.
- Immunopritasyonda multipleksinizin etkinliğini gösterir.
Sonuçlar
- QMI, protein etkileşimlerini incelemek için güçlü bir araçtır.
- Karmaşık biyolojik verilerin analiz sürecini basitleştirir.
- Gelecekteki uygulamalar, araştırmanın çeşitli alanlarına genişleyebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) enables biopharma R&D teams to simultaneously measure hundreds of binary protein interactions within a defined network, providing network-scale insights into signal transduction dynamics. By eliminating the need for genetic tagging and requiring minimal biomaterial, QMI supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in discovery workflows. The method generates quantitative fold-change data that can be analyzed using independent statistical approaches (ANC and WGCNA) to increase predictive confidence in protein co-associations relevant to therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying fold changes in protein interactions across experimental conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation without genetic manipulation, preserving native protein complexes.
- Predictive Value: Increases confidence in target selection through coordinated changes in co-associations detected by dual statistical validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative, fluorescence-based readouts of Proteins in Shared Complexes (PiSCES) for reproducible interaction profiling.
- Operational Value: Uses MagBead spectral regions to multiplex immunoprecipitations, enabling parallel processing in 96-well format.
- Scalability Value: Adaptable to any defined protein interaction network, supporting reuse across projects and model systems.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Generates hypothesis-ready data from T cell and neuronal glutamate synapse networks, with direct relevance to immune and neurological disease areas.
- Mechanistic De-risking: Identifies condition-specific interaction changes that inform pathway modulation strategies.
- Preclinical Continuity: Outputs node-edge diagrams and heatmaps that visualize high-confidence interactions for downstream validation.
Pipeline & Workflow Integration
QMI fits within the discovery continuum from target engagement screening to lead optimization, providing interaction network context that informs compound mechanism of action and selectivity profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing how groups of co-associations change in response to stimuli or perturbations.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative interaction data suitable for hit confirmation and pathway elucidation.
- Analytics: Enables comparison of interaction strengths via log2 fold change and statistical significance (FDR < 0.05) across replicates.
- Translational Research: Connects discovery-phase interaction dynamics to disease-relevant systems such as immune synapses and neuronal signaling.
- Enterprise Reuse: Once developed, the QMI panel allows repeated overnight assays, reducing per-experiment time and reagent burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through quantitative, multiplexed interaction measurements.
- Operational Value: Standardizes complex co-IP workflows using magnetic bead separation and flow cytometry readout.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by de-risking mechanistic assumptions early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on network-level interaction dynamics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody validation, magnetic bead handling, and flow cytometry optimization.
- Dependent on access to a refrigerated flow cytometer capable of multiplexed bead region detection.
- Necessitates standardized lysis buffer optimization and careful protein normalization across samples.
- Involves multi-day assay development including antibody screening, bead conjugation, and probe biotinylation.
- Limited to soluble protein complexes; may not capture transient or membrane-embedded interactions without optimization.
