Name: Kromatin Etki Alanlarının De novo Oluşumunu İnceleme Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Keşfedin, fare embriyonik kök hücrelerinde CRISPR/Cas9 kullanarak PRC2 aracılıklı kromatin etki alanlarının dinamik oluşumunu nasıl izleyeceğinizi. Bu yöntem, kromatin dinamiklerini gerçek zamanlı analiz için duraklatılabilir bir sistem sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. L. Vales, D. Ozata ve H. Mou'ya makalenin revizyonu için teşekkür ederiz. D.R. Lab, Howard Hughes Tıp Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01CA199652 ve R01NS100897) tarafından desteklenir.

İndüklen EED kurtarma mESC'lerinin üretimi
1. Hücre kültürü
<ol><li>4-Hidroksitamoksifen (4-OHT)13uygulanması üzerine çekirdeğe transkus transretobilen, koably entegre CreERT2 transgene sahip besleyicisiz C57BL/6 fare embriyonik kök hücreleri (mESCs) kullanın.</li>
	<li>1000 U/mL LIF, 1 μM ERK inhibitörü PD0325901 ve 3 μM GSK3 inhibitörü CHIR99021 ile desteklenen konvansiyonel ESC orta14,15,mESK'lerde büyütün. Konvansiyonel ESC ortamı için %15 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 1X penisilin/streptomisin ve 0.1 mM 2-mercaptoetanol içeren nakavt DMEM kullanın.</li>
	<li>MESC'ler için %0,1 jelatin çözeltisi ile kaplanmış plakalar kullanın.</li>
</ol>2. Klonal EED nakavt (KO) mESCs üretimi
<ol><li>Tasarım kılavuzu RNA 'lar (gRNA'lar) Exon 10 ve Exon 11'i silmek için, Benchling16'dakiCRISPR tasarım aracını kullanarak mESC'lerde EED'nin endojen kopyalarını siler. EED-KO-gRNA-1, exon 10'un intron'u hemen yukarıya ve EED-KO-gRNA-2'yi Exon 11'in hemen aşağısına doğru hedefler. Bu gRNA'ların eşzamanlı uygulaması homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) ile Hem Exon 10 hem de Exon 11'i siler.</li>
	<li>Clone gRNA'lar içine pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Ran ve ark.</li>
	<li>6-iyi plaka formatında, transfect 2 x 105 mESCs her EED-KO-gRNA-1 ve EED-KO-gRNA-2 1 mg (Malzemeler Tablosubakınız) üreticinin talimatları na uyarak transfeksiyon reaktifi kullanarak. Transfeksiyondan sonra ortamı 24 saat değiştirin.</li>
	<li>Transfeksiyondan iki gün sonra, Floresan aktive hücre sıralama (FACS) kullanarak GFP pozitif hücreleri izole edin. Transfeksiyon veriminin %10-30 civarında değişmesini bekleyin. Kaplama için yeterli GFP pozitif hücreleri yakalamak için 5 x 105 hücreleri etrafında sıralayın.</li>
	<li>Koloni toplama için izole GFP pozitif mESC'leri %0,1 jelatin (plaka başına 10-20 x103 hücre) ile önceden kaplanmış 15 cm'lik plakalara plakalayın.</li>
	<li>Tek koloniler görünene kadar ESC ortamındaki hücreleri yaklaşık bir hafta büyütün. Her 2 günde bir ortamı değiştirin.</li>
	<li>20 μL mikropipet ucu kullanarak en az 48 koloni seçin. Mikropipet ucuna aspire ederken koloninin üzerine kazıyın. Koloniyi tek bir hücreye ayırma. Koloniyi bir accutase içeren (20 mL) 96 kuyu plakasına aktarın.</li>
	<li>Tüm hücreler ayrıştırılıncaya kadar kolonileri 37 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Çok kanallı pipet kullanarak her kuyuya 200 mL ESC ortam ekleyin.</li>
	<li>İyi bir şekilde karıştırın ve çok kanallı pipet kullanarak hücreleri iki ayrı 96 kuyu plakasına plakalayın.</li>
	<li>Genotipleme için 96 kuyu plakasından birini kullanın ve genotipleme sonuçlanana kadar diğerini büyütmeye devam edin. Üreticinin talimatlarına uyarak 96 kuyu plakasından DNA çıkarmak için DNA çıkarma solüsyonu kullanın.</li>
	<li>Silinen siteye yayılan ve üreticinin talimatları doğrultusunda Takdna polimeraz ile genotipleme pcr gerçekleştiren Gnt_EED-KO-up ve Gnt_EED-KO_downgenotyping astarları kullanın. NOT: Dna polimerazların diğer türleri de genotipleme için kullanılabilir, ancak, PCR reaksiyonu doğrudan renkli reaksiyon tampon kullanıldığında bir jel üzerine yüklenebilir gibi Taq DNA polimeraz kolaylık sağlar.<ol>
<li>Vahşi tip (WT) kasasına göre homozigot silme ile hücrelerde daha düşük molekül ağırlığına sahip bir DNA ürününün gözlemlein. NOT: PRC2 null hücreleri oluşturmak için, exons homozigot silme 10 ve 11 eed, çekirdek PRC213önemli bir alt birimi istikrarsızlaştırmak ve bozunmak için gereklidir. CRISPR hedefleme verimliliği %10 civarındadır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>EED ekson 10 ve 11'in silinmesini ve Sırasıyla Sanger dizilimi ve Batı lekeleme ile EED protein kaybını doğrulayın.</li>
	<li>EED ve H3K27me2/me3'ün EED KO hücrelerindeki kromatinden H3K27me2/me3 ve EED'ye karşı antikorlar kullanarak ChIP-seq ile tükenmesini onaylayın. ChIP-seq deneyleri için Oksuz vd., 2017 15'te verilen protokolü kullanın.</li>
</ol>3. Cre-ERT2 tabanlı indüklen EED ifadesini barındıracak EED nakavt mESC'lerini tasarlamak
<ol><li>Tasarım gRNA (EED-gRNA-inducible) Benchling16'daki CRISPR tasarım aracını kullanarak EED'nin ekson 9'undan sonra intron içinde bir kesim tanıtmak için 16 (bkz. </li>
	<li>Clone gRNA'lar içine pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) Ran ve ark.</li>
	<li>Ekson 9'dan sonra EED cDNA dizisini ve T2A-GFP dizisinin C-terminal Flag-HA etiketini içeren bir donör şablonu DNA'sı tasarla, hepsi endojen gen dizisine göre ters yönde.<ol>
<li>Bir splice-acceptor ve heterolog ters loxP siteleri (lox66 ve lox71) 18 arasında yuvalanmışbir poliadeniletion dizisi ile kaset flank .</li>
		<li>Her iki ucundan en az 500 bp homoloji silah ekleyin. Donör şablonu gBlocks gen parçalarının 2 segmentine bölün (bkz. gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" ve gBlock-2-cage-mutant "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") PCR Blunt vektör üreticisinin talimatları aşağıdaki Gibson klonlama kullanarak. NOT: gblock-2 H3K27me312ile etkileşim için önemli olan EED kafes içinde bir aromatik kalıntı (Y365) içerir. gBlock-2-Wt yabani tip kalıntısı içerirken, gblock-2-cage-mutant, H3K27me3'e bağlanamayan EED (Y365A) kafes mutantını içerir. Indüklen WT EED kurtarma i-WT-r ve indüklen kafes mutant EED kurtarma kolaylık sağlamak için i-MT-r olarak gösterilir olarak gösterilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>6-iyi plaka formatında, transfect 2 x 105 mESCs gRNA 1 mg (EED-gRNA-inducible) ve 1 mg Donör şablonları (i-WT-r veya i-MT-r) transfeksiyon reaktif kullanarak ve FACS kullanarak GFP pozitif hücreleri izole.</li>
	<li>Başarılı hedefleme için genotiplemeye hazır kolonileri izole etmek için 2.3-2.11 adımlarını izleyin.</li>
	<li>Genotyping astarlar Inducible_Genotype-FW-1 ve Inducible_Genotype-REV-1kullanın , hangi eklenen kaset yayılan ve Tak DNA polimeraz kullanarak genotipleme PCR gerçekleştirmek. NOT: CRISPR için hedefleme verimliliği %10 civarındadır.<ol>
<li>İnducible_Genotype-FW-2 ve Homoloji kollarının dışında olan Inducible_Geotype-REV-2 astarlarını kullanarak kasetin PCR ile doğru entegrasyonunu onaylayın. NOT: EED'nin verimli bir şekilde kurtarılması için kasetin homozigot entegrasyonu gereklidir. Homozigot entegrasyona sahip hücrelerin WT EED ile karşılaştırıldığında tek bir büyük DNA ürünü üreteceğini unutmayın, bu da kısa bir ürün üretecektir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kasetin Sanger sıralaması ile entegrasyonunu onaylayın.</li>
	<li>Batı lekeleme tarafından 4-OHT yönetimi üzerine kaset ve EED ve diğer PRC2 temel bileşenleri (örneğin, EZH2 ve SUZ12) ifadesinin flipping onaylayın.</li>
	<li>T2A-GFP ifadesini ve akış sitometrisi ile çevirme yüzdesini doğrulayın. GFP ifadesinin kasetin çevrildiğini ve EED ifadesinin göstergesi olduğunu unutmayın.</li>
</ol>4. Kromatin üzerinde ÇHC2 aktivitesinin çekirdekleşme ve yayılmasınıtaki takip
<ol><li>I-WT-r ve i-MT-r mESC'lerin akış sitometrisi tarafından GFP'nin sızdıran ekspresyonuna sahip olmadığını doğrulayın. GFP'nin sızdıran ekspresyonu durumunda, denemeye başlamadan önce GFP negatif hücreleri FACS tarafından yalıtın.</li>
	<li>i-WT-r ve i-MT-r mm'leri beş adet 15 cm plakaya (plaka başına 5x 106 hücre) genişletin.</li>
	<li>0 saat, 12 h, 24 saat, 36 saat ve 8 gün (her koşulda bir 15 cm plaka) için 0,5 mM 4-OHT uygulama ile WT veya kafes mutant EED indükleme ekspresyonu. 12 saatten uzun tedaviler için 12 saat sonra ortamı değiştirin. GFP kullanarak FACS tarafından başarılı bir şekilde yeniden birleştirilmiş hücreleri izole edin. Tüm koşulların aynı anda toplandığı tedavilerin zamanını ayarlayın.</li>
	<li>H3K27me2 için ChIP-seq gerçekleştirin, H3K27me3 WT veya kafes mutant EED yeniden ifade yanıt olarak kromatin onların zamansal birikimi araştırmak için. Oksuz ve ark., 2017 15'te ayrıntılı olarak kullanılankütüphane hazırlama yı içeren ChIP-seq protokolünü kullanın.</li>
	<li>Farklı zaman noktaları arasında nicel karşılaştırma sağlamak için her örnekte başak-in denetim kullanın19.<ol>
<li>Başak kontrolü için, Drosophila melanogaster (mESC kaynaklı kromatin oranı 1:50 oranında) yanı sıra Drosophila spesifik H2Av antikor (1 μL H2Av antikor başına 4 μg Drosophila kromatin üreticinin talimatları) her örnekte.</li>
		<li>Drosophila'dan gelen kromatini Oksuz ve ark., 2017 15'te ayrıntılı olarakbelirtilen protokolü kullanarak, MSK'lardan alınana benzer bir şekilde hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Varsayılan parametreleri20kullanarak Bowtie 2 ile Mm10 genom chIP-seq için sıra okur Harita .</li>
	<li>Normalleştirmek fare ChIP-seq spike-drosophila okumak sayımları21okur . Aşağıdaki formülü kullanarak başak-in normalleştirme faktörü hesaplamak: 1 x 106/unique Drosophila okuma sayıları. Yaklaşık 1 x 106Drosophila okuma sayıları ve deneme başına 20 x 106 fare okuma sayıları almak için bekleyin.<ol>
<li>Giriş örneklerini sıralarken Drosophila kromatinini eklemeyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bam dosyasını bedgraph 22'ye dönüştürmekiçin bedtools genomecov aracını kullanın. Sonra, USCS23,24 bedGraphToBigWig aracını kullanarak bigwig dosyasına bedgraph dönüştürmek . Aşağıdaki komut dosyasına bakın: gen="mm10 genomuna giden yol" chr="mm10 kromozom boyutlarına giden yol" inp_bam="giriş yolu bam dosyası " multiply="başak-in normalleştirme faktörlerini hesapla" bedtools genomecov -bg -ölçek $multiply -ibam $inp_bam -g $gen > output.bedGraph sıralama -k1,1 -k2,2n output.bedGraph > output_sorted.bedGraph bedGraphToBigWig output_sorted.bedGraph $chr output.bw
</li>
	<li>USCS genom tarayıcı24bigwig dosyaları yükleyerek ChIP-seq okuma yoğunlukları görselleştirin.</li>
</ol>5. MESC'lerin çekirdeklerinde H3K27me3 focisinin ortaya çıkışını ve büyümesini izleme
<ol><li>Plaka 1x 104 mESCs içine 8-iyi oda slaytlar önceden% 0.1 jelatin ile kaplanmış.</li>
	<li>Ertesi gün, belirtilen zaman noktaları (0 saat, 12 saat, 24 h ve 36 saat) için EED ifade hücreleri toplamak için ardışık 4-OHT (0,5 mM) indüksiyonlar yapmaya başlayın. 12 saatten uzun tedaviler için 12 saat sonra ortamı değiştirin.</li>
	<li>10 dakika oda sıcaklığında (RT) fosfat tamponlu salin (PBS) % 4 paraformaldehit ile mESC'leri düzeltin.</li>
	<li>30 dakika boyunca RT PBS/0.25% Triton X-100 ile hücreleri permeabilize.</li>
	<li>PBS/5% eşek serumu/0.1% Triton X-100 (engelleme tampon) ile HÜCRELERI 30 dakika boyunca RT'de bloke edin.</li>
	<li>Seyreltik H3K27me3 birincil antikor 1:500 engelleme tampon ve hücrelere ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri bir gecede 4 °C'de primer antikorile kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Ertesi gün, PBS/0.1% Triton X-100 ile 3 yıkıntı gerçekleştirin.</li>
	<li>Sekonder antikor (Alexa flor 595) 1:1000 engelleme tampon seyreltmek ve hücrelere ekleyin.<ol>
<li>Alexa Fluor ile konjuge ikincil antikorlar ışığa duyarlı olduğu gibi aşağıdaki adımlarda karanlıkta tüm kuluçka gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İkincil antikor2 saat RT'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>PBS/0.1% Triton X-100 ile 3 yıkama gerçekleştirin.</li>
	<li>Seyreltik DAPI (1 mg/mL) PBS/0.1% Triton X-100 ile 1:4000 ve hücrelere ekleyin.</li>
	<li>RT'de 10 dakika boyunca DAPI ile hücreleri kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Aqua montaj ile hücreleri monte edin.</li>
	<li>63X büyütmede konfokal mikroskopi ile hücreleri görüntüleyin.</li>
	<li>ImageJ, Fiji 25'in dağıtımını kullanarakgörüntüleri işleme ve sözde renklendirme.</li>
</ol>

<ol><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+function+of+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (11), 661-678 (2016).</li>
<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li>
<li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li>
<li>Carelli, F. N., Sharma, G., Broad Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Domains%3A+An+Important+Facet+of+Genome+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Chromatin Domains: An Important Facet of Genome Regulation.</a> Bioessays. 39 (12), (2017).</li>
<li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Polycomb+complex+PRC2+and+its+mark+in+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Polycomb complex PRC2 and its mark in life.</a> Nature. 469 (7330), 343-349 (2011).</li>
<li>Holoch, D., Margueron, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+Regulating+PRC2+Recruitment+and+Enzymatic+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms Regulating PRC2 Recruitment and Enzymatic Activity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 531-542 (2017).</li>
<li>Cao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+histone+H3+lysine+27+methylation+in+polycomb-group+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of histone H3 lysine 27 methylation in polycomb-group silencing.</a> Science. 298 (5595), 1039-1043 (2002).</li>
<li>Kuzmichev, A., Nishioka, K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methyltransferase+activity+associated+with+a+human+multiprotein+complex+containing+the+enhancer+of+zeste+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Histone methyltransferase activity associated with a human multiprotein complex containing the enhancer of zeste protein.</a> Genes and Development. 16 (22), 2893-2905 (2002).</li>
<li>Czermin, B., Melfi, R., McCabe, D., Seitz, V., Imhof, A., Pirrotta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+enhancer+of+Zeste%2FESC+complexes+have+a+histone+H3+methyltransferase+activity+that+marks+chromosomal+Polycomb+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites.</a> Cell. 111 (2), 185-196 (2002).</li>
<li>Müller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methyltransferase+activity+of+a+Drosophila+Polycomb+group+repressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Histone methyltransferase activity of a Drosophila Polycomb group repressor complex.</a> Cell. 111 (2), 197-208 (2002).</li>
<li>Ferrari, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb-Dependent+H3K27me1+and+H3K27me2+Regulate+Active+Transcription+and+Enhancer+Fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Polycomb-Dependent H3K27me1 and H3K27me2 Regulate Active Transcription and Enhancer Fidelity.</a> Molecular Cell. 53 (1), 49-62 (2014).</li>
<li>Margueron, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+polycomb+protein+EED+in+the+propagation+of+repressive+histone+marks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of the polycomb protein EED in the propagation of repressive histone marks.</a> Nature. 461 (7265), 762-767 (2009).</li>
<li>Oksuz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+the+Onset+of+PRC2-Mediated+Repressive+Domain+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Capturing the Onset of PRC2-Mediated Repressive Domain Formation.</a> Molecular cell. 70 (6), 1149-1162 (2018).</li>
<li>Tee, W. W., Shen, S. S., Oksuz, O., Narendra, V., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erk1%2F2+activity+promotes+chromatin+features+and+RNAPII+phosphorylation+at+developmental+promoters+in+mouse+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Erk1/2 activity promotes chromatin features and RNAPII phosphorylation at developmental promoters in mouse ESCs.</a> Cell. 156 (4), 678-690 (2014).</li>
<li>Oksuz, O., Tee, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+chromatin+modifications+in+response+to+ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Probing chromatin modifications in response to ERK signaling.</a> Methods in Molecular Biology. 1487, 289-301 (2017).</li>
<li>Benchling Inc. Benchling for Academics. Benchling. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://benchling.com">https://benchling.com</a> (2018).</li>
<li>Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Zhang, Z., Lutz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase-mediated+inversion+using+lox66+and+lox71%3A+method+to+introduce+conditional+point+mutations+into+the+CREB-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase-mediated inversion using lox66 and lox71: method to introduce conditional point mutations into the CREB-binding protein.</a> Nucleic acids research. 30 (17), 90(2002).</li>
<li>Orlando, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+ChIP-Seq+normalization+reveals+global+modulation+of+the+epigenome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Quantitative ChIP-Seq normalization reveals global modulation of the epigenome.</a> Cell reports. 9 (3), 1163-1170 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Descostes, N. ChIPSeqSpike: ChIP-Seq data scaling according to spike-in control. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDescostes%2C+N+%22R+package+version+1.2.1%22">R package version 1.2.1</a>. , (2019).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BigWig+and+BigBed%3A+enabling+browsing+of+large+distributed+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).</li>
<li>UCSC Genome Browser Home. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://genome.ucsc.edu">https://genome.ucsc.edu</a> (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Nishimura, K., Fukagawa, T., Takisawa, H., Kakimoto, T., Kanemaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+auxin-based+degron+system+for+the+rapid+depletion+of+proteins+in+nonplant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An auxin-based degron system for the rapid depletion of proteins in nonplant cells.</a> Nature Methods. 6 (12), 917-922 (2009).</li>
<li>Banaszynski, L. A., Chen, L., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G. L., Wandless, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid%2C+Reversible%2C+and+Tunable+Method+to+Regulate+Protein+Function+in+Living+Cells+Using+Synthetic+Small+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Rapid, Reversible, and Tunable Method to Regulate Protein Function in Living Cells Using Synthetic Small Molecules.</a> Cell. 126 (5), 995-1004 (2006).</li>
<li>Højfeldt, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+H3K27+methylation+can+be+established+de+novo+by+SUZ12-directed+PRC2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Accurate H3K27 methylation can be established de novo by SUZ12-directed PRC2.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 225-232 (2018).</li>
</ol>

D.R. Constellation Pharmaceuticals ve Fulcrum Therapeutics'in kurucularındandır. Yazarlar hiçbir rakip çıkarları olduğunu beyan.

Belirli bir kromatin etki alanının oluşumu sırasında mekanistik ayrıntıları anlamak için güçlü bir yaklaşım, ilk etki alanı bozmak ve daha sonra hücreler içinde devam eden yeniden izlemedir. Devam eden olayları ayrıntılı olarak analiz etmek için yeniden yapılanma sırasında herhangi bir zamanda duraklatılmış olabilir. Kromatin etki alanları üzerinde daha önce yapılan çalışmalar, bu tür olayları sabit durum koşullarında (örneğin, yabani tip ve gen nakavtı karşılaştırması) gerçekleştirdikleri için çözemedikleri için çözemed...

Ökaryotik genomlar son derece organize ve kromatin erişilebilirlik değişiklikleri doğrudan gen transkripsiyonkontrol 1. Genom transkripsiyonel aktivite ve çoğaltma zamanlaması2,3ile ilişkili kromatin etki alanları, farklı türleri içerir. Bu kromatin etki alanları boyutu birkaç kilobases (kb) fazla 100 kb arasında değişir ve farklı histon modifikasyonları bir zenginleştirme ile karakterizedir4. Temel sorular şunlardır: bu etki alanları nasıl oluşur ve nasıl yayılır?
En iyi karakterize kromatin etki alanlarından biri Polycomb baskıcı kompleks 2 (PRC2) aktivitesi ile teşvik edilir. PRC2, Polycomb Group 'un (PcG)5,6proteinlerinin bir alt kümesinden oluşan ve histon H3 (H3K27me1/me2/me3) 27 lisenin mono-, di-ve trimethylation katalizler bir çok alt birim kompleksidir 7,8, 9,10. H3K27me2/me3 baskıcı kromatin durumu ile ilişkilidir, ancak H3K27me1 fonksiyonu belirsiz6,11. ÇHC2 temel bileşenlerinden biri, embriyonik ektoderm gelişimi (EED), çHC2 kataliz son ürün bağlanır, H3K27me3, aromatik kafes aracılığıyla ve bu özellik PRC2 allosteric stimülasyon sonuçları12,13. ÇHC2 enzimatik aktivitesi belirli bir soy için kontrendike olan bazı gelişimsel genlerin uygunsuz ifadesi olarak gelişim sırasında hücresel kimliğin korunması için çok önemlidir, zararlı olacaktır5,6 . Bu nedenle, PrC2'nin memelilerde baskıcı kromatin alanlarının oluşumunu teşvik ettiği mekanizmaların çözülmesi hücresel kimliğin anlaşılması için temel öneme sahiptir.
PrC2 aracılı kromatin etki alanları da dahil olmak üzere kromatin etki alanı oluşumunu araştırmak için tasarlanmış tüm deneysel sistemler, kromatin etki alanı oluşumunun gelişen olaylarını takip edemeyen sabit durum koşullarında gerçekleştirilmiştir. Hücre. Burada, kromatin alanadlarının ilk işe alımını ve yayılmasını izleyen indüklenebilir bir hücresel sistem oluşturmak için ayrıntılı bir protokol salıyoruz. Özellikle, H3K27me2/3'ü oluşturan ÇHC2 aracılı baskıcı kromatin etki alanlarının oluşumunu izlemeye odaklanıyoruz. Kromatin etki alanı oluşumunun mekanistik ayrıntılarını yakalayabilen bu sistem, H2AK119ub veya H3K9me'den oluşan yaygın olarak çalışılan etki alanları gibi diğer kromatin etki alanlarını da dahil etmek üzere uyarlanabilir. Genomik ve görüntüleme teknolojileri ile birlikte, bu yaklaşım kromatin biyolojisindeki çeşitli önemli soruları başarılı bir şekilde ele alma potansiyeline sahiptir.

<table><tbody><tr><td>(Z) -4-Hidroksitamoksifen (5 mg)</td> <td>Sigma</td><td>H7904-5MG</td><td>EED ekspresyonunun indüksiyonu için</td></tr><tr><td>% 16 Paraformaldehit sulu çözelti (10x10 ml)</td> <td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td>İmmünofloresan için</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>LifeTechnologies</td><td>21985-023</td><td>mESC kültürü için</td></tr><tr><td>% 2 Jelatin Çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>G1393-100ml</td><td>mESC'ler için kültür</td></tr><tr><td>Accutase 500 ML</td><td>Yenilikçi Hücre Teknolojisi / FISHER</td><td>AT 104-500</td><td>mESC kültürü için</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Tavşan IgG (H + L)</td> <td>Jackson immunoresaerch</td><td>711-585-152</td><td>İmmünofloresan</td></tr><tr><td>için Aqua-Mount Montaj Ortamı</td><td>FISHER/VWR</td><td>41799-008</td><td>İmmünofloresan</td></tr><tr><td>için CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK</td><td>Fisher Sci</td><td>177445PK</td><td>İmmünofloresan</td></tr><tr><td>DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür) için - 10 mg</td><td>Life Tech</td><td>D1306</td><td>İmmünofloresan</td></tr><tr><td>ERK inhibitörü için, PD0325901</td><td>Stemgent</td><td>04-0006</td><td>mESC kültürü için</td></tr><tr><td>ESGRO Rekombinant Fare LIF Proteini</td><td>Millipore/Fisher</td><td>ESG1107</td><td>mESC kültürü için</td></tr><tr><td>FBS Kök Hücre Nitelikli</td><td>Atlanta</td><td>S10250</td><td>mESC kültürü için</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td>Donör şablonu klonlama için</td></tr><tr><td>GSK3 inhibitörü, CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td>mESC kültürü için</td></tr><tr><td>H3K27me2 (D18C8) tavşan mAB</td><td>Hücre Sinyali</td><td>9728S</td><td>ChIP-seq</td></tr><tr><td>H3K27me3</td> için Antikor <td>ChIP-seq</td><td>Histon</td> H2Av için Hücre Sinyali <td>9733S</td> Antikoru</tr><tr><td> antikor (pAb)</td><td>Aktif motif</td><td>39715</td><td>ChIP-seq Knockout</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829-018</td><td>için spike-in kontrolü mESC kültürü için</td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td>mESC kültürü için</td></tr><tr><td>Transfeksiyon için Lipofektamin 2000</td><td>LifeTech</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Genotipleme PCR için</td> <td>MangoTaq DNA Polimeraz</td><td></td><td>Bioline BIO-21079</td></tr><tr><td>Normal eşek serumu (10 mL)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>İmmünofloresan için</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Sigma/Roche</td><td>P0781</td><td>mESC kültürü için</td></tr><tr><td>pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)</td><td>Addgene</td><td>48138</td><td>gRNA klonlaması için</td></tr><tr><td>QuickExtract DNA Ekstraksiyon Solüsyonu</td><td>Lucigen</td><td>QE0905T</td><td>Genotipleme için</td></tr><tr><td>PCR Triton X-100</td><td>Donör</td> şablon klonlama için Sigma <td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Sıfır Künt PCR Klonlama</td><td>Kiti Thermo Fisher</td><td>K270020</td><td></td></tr><tr><td>Primers/gBlocks</strong</td>><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EED-KO-gRNA-1</td><td></td><td></td><td>Sıra: ctctggctactgtcaactag. gRNA'lar, i-WT-r ve i-MT-r sistemleri için C57BL/6 ESC'lerde EED'yi nakavt etmek için eşleşir.</td></tr><tr><td>EED-KO-gRNA-2</td><td></td><td></td><td>Dizisi: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNA'lar, i-WT-r ve i-MT-r sistemleri için C57BL/6 ESC'lerde EED'yi nakavt etmek için eşleşir.</td></tr><tr><td>EED-gRNA ile indüklenebilir</td><td></td><td></td><td>Sekans: atggcaccccgaaattagaa. EED-KO arka planında i-WT-r sistemi oluşturmak için gRNA ve Donör.</td></tr><tr><td>i-WT-r Donör</td><td></td><td></td><td>https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. EED-KO arka planında i-WT-r sistemi oluşturmak için gRNA ve Donör.</td></tr><tr><td>EED-gRNA ile indüklenebilir</td><td></td><td></td><td>Sekans: atggcaccccgaaattagaa. EED-KO arka planında i-WT-r sistemi oluşturmak için gRNA ve Donör.</td></tr><tr><td>i-MT-r Donör</td><td></td><td></td><td>https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA ve Donör, EED-KO arka planında i-MT-r sistemi oluşturmak için.</td></tr><tr><td><güçlü>Genotipleme Primerleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gnt-EED-KO-FW-1</td><td></td><td></td><td>Sırası: ctgtaggctgccatctgtga. Yabani tip alel 1.9 kb'lik bir ürün üretecektir. Nakavt aleli 200 bp'lik bir ürün üretecek.</td></tr><tr><td>Gnt-EED-KO-REV-1</td><td></td><td></td><td>Sırası: agccagggctacacagagaa. Yabani tip alel 1.9 kb'lik bir ürün üretecektir. Nakavt aleli 200 bp'lik bir ürün üretecek.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-FW-1</td><td></td><td></td><td>Sırası: tgcagtgaaacaaatttggaa. Kaset yerleştirildiğinde, astarlar 1863 bp üretecektir. Yabani tip alel, ~200 bp'lik bir ürün üretecektir.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-REV-1</td><td></td><td></td><td>Sırası: gagagggggtggcactgtaaa. Kaset yerleştirildiğinde, astarlar 1863 bp üretecektir. Yabani tip alel, ~200 bp'lik bir ürün üretecektir.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-FW-2</td><td></td><td></td><td>Sırası: ccccctctttctcttttt. Kaset yerleştirildiğinde, astarlar 3200 bp üretecektir. Yabani tip alel, 1560 bp'lik bir ürün üretecektir.</td></tr><tr><td>Inducible_Genotype-REV-2</td><td></td><td></td><td>Sırası: atgcctgggtgaatgaaaaa. Kaset yerleştirildiğinde, astarlar 3200 bp üretecektir. Yabani tip alel, 1560 bp'lik bir ürün üretecektir.</td></tr></tbody></table>

kromatin etki alanlarının de novo oluşumunu İnceleme yöntemi

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

Kromatin etki alanlarının organizasyonu ve yapısı tek tek hücre soylarına özgüdür. Onların yanlış regülasyonu hücresel kimlik ve / veya hastalık kaybına yol açabilir. Muazzam çabalara rağmen, kromatin alanlarının oluşumu ve yayılması anlayışımız hala sınırlıdır. Kromatin etki alanları, kuruluşları sırasında ki ilk olayları takip etmeye elverişli olmayan sabit devlet koşullarında incelenmiştir. Burada, kromatin etki alanlarını inducibly yeniden inşa etmek ve zamanın bir fonksiyonu olarak yeniden oluşumunu takip etmek için bir yöntem salıyoruz. Her ne kadar ilk olarak ÇHC2 aracılı baskılayıcı kromatin etki alanı oluşumu olgusuna uygulansa da, diğer kromatin etki adlarına kolayca adapte edilebilir. Bu yöntemin genomik ve görüntüleme teknolojileri ile değiştirilmesi ve/veya kombinasyonu, kromatin alanlarının kurulmasını ayrıntılı olarak incelemek için paha biçilmez araçlar sağlayacaktır. Bu yöntemin kromatin alanlarının nasıl oluştuğu ve birbirleriyle nasıl etkileşimde olduğu anlayışımızda devrim olacağına inanıyoruz.

Koşullu kurtarma sisteminin genel bir şeması Şekil 1 endojen EED locus ifade edilir Ya WT veya kafes mutant (Y365A) EED ile EED KO hücreleri koşullu kurtarmak için hedefleme şeması gösterir. Stabilitesi ve enzimatik aktivitesi için gerekli olan ÇHC2'nin çekirdek alt birimi olan EED'yi nakavt ettikten sonra, EED'nin ekson 9'unu takip eden intron içinde bir kaset tanıtılır (Şekil1). Kaset, endojen gen dizilimine göre ters yönde, EED'nin kalan 3...

Bu yöntem hücre hatlarında ÇHC2 aracılı kromatin etki alanlarının oluşumunu takip etmek için tasarlanmıştır ve yöntem diğer birçok sistemlere uyarlanabilir.

Kromatin Etki Alanlarının De novo Oluşumunu İnceleme Yöntemi

The organization and structure of chromatin domains are unique to individual cell lineages. Their misregulation might lead to a loss in cellular identity ...

Kromatin etki alanlarının dinamik oluşumunu değerlendirmek için bir sistem anahat. Bu sistemi, prc2 aracılı kromatin etki alanlarının hücrelerde işe alınmasını ve yayılmasını takip etmek için kullanıyoruz. Devam eden olayları çözümlemek için işlem herhangi bir zamanda duraklatılmış olabilir.Bu sistem herhangi bir hücresel süreç dinamik değişiklikleri izlemek için yönelik olabilir ve bu nedenle kromatin etki alanı oluşumuizleme ile sınırlı değildir. CRISPR Tasarım Aracı'nı kullanarak fare embriyonik kök hücrelerinde embriyonik ektoderm gelişiminin veya EED'nin endojen bir kopyasının exon 10 ve 11'ini silmek için kılavuz RNA'lar tasarlayarak başlayın. Kılavuzu RNA'ları el yazması talimatlara göre CRISPR/Cas9 plazmidine kopyala.Altı kuyulu plaka biçiminde, transfect 200, 000 fare embriyonik kök hücreleri veya mESCs, üreticinin talimatlarına göre transfeksiyon reaktifleri kullanarak her kılavuz RNA bir mikrogram ile. Transfection'dan 24 saat sonra ortamı değiştirin. Transfeksiyondan iki gün sonra, FACS kullanarak GFP pozitif hücreleri izole edin.Transfeksiyon verimliliği yaklaşık %10 ila %30 arasında değişir, bu nedenle kaplama için yeterli GFP pozitif hücreleri yakalamak için 500,000 hücre yi sıralar. İzole GFP pozitif hücreleri koloni toplama için %0,1 jelatinle önceden kaplanmış 15 santimetrelik plakalara plakalayın. TEK koloniler görünür olana kadar ESC ortamındaki hücreleri yaklaşık bir hafta büyüterek ortamları iki günde bir değiştirdiğinden emin olun.20 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak en az 48 koloni seçin. Koloniyi tek bir hücreye ayırmadan, Accutase içeren 96 kuyuluk bir plakaya aktarın. Hücreleri ayrıştırmak için kolonileri 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra çok kanallı pipetle her kuyuya 200 mikrolitre ESC ortam ekleyin. İyi bir şekilde karıştırın ve hücreleri iki ayrı 96-well plakaya plakalayın. Genotipleme için plakalardan birini kullanın ve genotipleme sonuçlanana kadar diğerini büyümeye devam edin.Ticari reaktifler kullanarak ve üreticinin yönergelerini izleyerek plakadan DNA ayıklayın. Taq DNA polimeraz ile genotipleme PCR gerçekleştirmek için silinen siteye yayılan genotipleme astarkullanın. Vahşi tip hücrelere göre homozigot silme ile hücrelerde daha düşük molekül ağırlığı na sahip bir DNA ürünü gözlemleyin.Tasarım kılavuzu RNA bir CRISPR Tasarım Aracı kullanarak EED exon 9 aşağıdaki intron içinde bir kesim tanıtmak ve el yazması yönlere göre CRISPR/Cas9 plazmid içine klonlamak. Ekson 9'dan sonra EED cDNA dizisini ve T2A-GFP dizisinin C-terminal Flag-HA etiketini içeren bir donör şablonu DNA'sı tasarla, hepsi endojen gen dizisine göre ters yönde. Bir splice-acceptor ve heterolog ters loxP siteleri arasında yuvalanmış bir poliadeniletion dizisi ile kaset flank ve her iki ucundan homoloji silah en az 500 baz çifti içerir.Donör şablonunu gBlocks Gen Parçaları'nın iki bölümüne bölün ve üreticinin talimatları doğrultusunda Gibson klonlamasını kullanarak pcr Blunt vektörüne birleştirin. Altı kuyulu plaka biçiminde transfect 200, 000 mESCs kılavuz RNA bir mikrogram ve donör şablonları bir mikrogram. Sonra FACS kullanarak GFP pozitif hücreleri izole edin.El yazması talimatlara göre genotipleme için tek tek kolonileri izole edin. MESC'lerin GFP'nin sızdıran ifadesi olmadığını doğrulamak için akış sitometrisini kullanın ve bunu yaparlarsa, deneye başlamadan önce GFP negatif hücreleri FACS tarafından yalıtın. Beş 15 santimetre plakaları içine hücreleri genişletin ve sıfır saat sekiz gün arasında değişen beş farklı süreler için 5 mikromolar 4-hidroksitamoksifen uygulayarak vahşi tip veya kafes mutant EED ifade neden.Bundan daha uzun süren tedaviler için 12 saat sonra ortamı değiştirin. GFP kullanarak FACS tarafından başarılı bir şekilde yeniden birleştirilmiş hücreleri izole edin ve yabani tip veya kafes mutant EED'nin yeniden dışa konması için kromatine zamansal birikimini araştırmak için H3K27me2 ve H3K27me3 için ChIP-seq gerçekleştirin. Indükleyici vahşi tip kurtarma ve indükleyici mutant kurtarma sistemleri doğrulamak için, batı leke 4-hidroksitamoksifen tedavisi ile yabani tip veya kafes mutant EED indüksiyon sonra tüm özleri üzerinde yapıldı.Akış sitometri analizi, ters kasetin başarılı bir şekilde takla attığını gösteren 4-hidroksitamoksifen tedavisinden önce ve sonra i-WT-r hücrelerinde T2A-GFP ekspresyonunun etkinliğini doğrulamak için kullanıldı. H3K27me3'ün ChIP-seq'u yabani tip veya kafes mutantı EED'nin yeniden ifade edilmesinden sonra yapıldı. H3K27me3'ün ortaya çıkışı, ayrık çekirdekleşme bölgelerinde yabani tip EED ekspresyonundan 12 saat sonra, ilk çekirdekleşme bölgelerinden uzak bölgelerde 24 saat olarak gözlenir.ChIP-seq da H3K27me2, H3K27me3 birikimi öncesinde görünür zamansal birikimi izlemek için kullanılmıştır. H3K27me3 foci ve büyüme de floresan mikroskopi ile görselleştirilmiştir. Vahşi tip EED ifade 12 saat sonra, H3K27me3 foci oluşumu kanıt vardır.Bu foci sayısı ve boyutu 24 saat artar ve sonunda 36 saat çekirdeğin büyük bölgelerine yayıldı. DNA yapılarının doğru tasarımı istenilen indükedilemez kurtarma sistemi oluşturmak için çok önemlidir. Bu yöntem farelerdeki protein mutasyonlarının zamansal ve özel bir kontrol ünü sağlayabilir.Bu şekilde, belirli bir dokuda veya gelişimin belirli bir aşamasında mutasyonların etkisini belirleyebilir. Şu anda başka bir kromatin etki alanı, Polycomb baskıcı kompleks 1 dinamik kurulmasını izlemek için bu sistemi kullanıyoruz.

a-method-to-study-de-novo-formation-of-chromatin-domains

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu videoda, mikrokokal nükleaz enzimatik sindirimi kullanarak kromatin kesme protokolü açıklanmaktadır. Kromatin kesme, insan kronik miyeloid lösemi hücrelerinde protein-DNA etkileşimini araştırmaya yardımcı olan Kromatin immünopresipitasyonu veya ChIp iş akışında önemli bir adımdır. Özellik protokolünde kromatin kesme, sonikasyon kullanılarak gerçekleştirilir.

Kromatin kesme: Enzimatik sindirim kullanarak kromatin parçaları oluşturmak için bir yöntem

nasıl kromatin düzenleyiciler ve kromatin devletlerin soru in vivo genom hücre kaderi kararları gelişen embriyonun yapılır ne kadar erken anlayışımıza önemli olduğunu etkileyebilir. ChIP-Seq-küresel düzey bir Xenopus embriyolar için burada özetlenen kromotin özelliklerini araştırmak için en popüler yaklaşım.

Kromatin Regülatörleri ve Devletleri&#39;nde genom Anlık<em&gt; Ksenopus</emChIP-Sıra tarafından&gt; Embriyolar

Tuz çıkarımı sıralı bağlı Kromatin proteinleri büyük protein kompleksleri bağlama özelliklerini belirlemek için yararlı bir araçtır. Bu yöntem tek tek alt birimleri veya etki alanlarında bulunan genel benzeşme Kromatin toplu olarak karmaşık bir proteinin rolü değerlendirmek için istihdam edilebilir.

Kromatin kompleksleri değiştirme özelliklerini bağlama toplu Kromatin analizi için sıralı tuz çekimi

Biz (ChIP-seq) metodolojisi sıralı veri kümeleri micrococcal nükleaz (MNase) erişilebilirlik entegre bir nucleosome yoğunluğu ChIP-seq analitik çerçeve için uygun üretimi için sıralama değiştirilmiş yerli Kromatin immunoprecipitation mevcut Histon değişiklik ölçümleri ile.

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

Nükleer mimari plastisite kodlamayan RNA'ların, DNA metilasyonu, nucleosome yeniden konumlandırma gibi Histon kompozisyon ve değiştirme işlemleri de dahil olmak üzere dinamik epigenetik mekanizmalar tarafından kontrol edilir. Burada tekrarlanabilir, ucuz ve basit bir şekilde Kromatin erişilebilirlik belirlenmesi sağlayan bir Formaldehyde-Assisted yalıtım, Düzenleyici öğelerini (dürüst) protokolünü açıklar.

Düzenleyici elemanlarının ölçü Kromatin erişilebilirlik memeli hücrelerinde formaldehit destekli izolasyon

Bu protokol, dondurulmuş dokulardan kromatin preparatına odaklanır ve Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ve ardından kantitatif PCR analizi (X-ChIP-qPCR) veya yeni nesil dizileme yaklaşımları (X-ChIP-seq) için uygundur.

Kromatin İmmünopresipitasyon Analizi için Dondurulmuş Kimerik Karaciğer Dokusundan Kromatin Ekstraksiyonu

Bu protokol, yapısal olarak korunmuş kromatin in situ içindeki replikasyon bölgelerinin yüksek çözünürlüklü haritalanması için, önceden gömülmüş EdU-streptavidin-Nanogold etiketleme ve ChromEMT'nin bir kombinasyonunu kullanan bir teknik sunar.

Elektron Tomografisi ile Ultrayapısal Olarak Korunmuş Kromatinde Görüntüleme Replikasyon Alanları

Bu protokol, topolojik olarak ilişkili alanların (TAD'ler) sınırları ve düzenleyici ve diğer DNA dizisi elemanları arasındaki uzun menzilli kromatin etkileşimleri de dahil olmak üzere, mega tabanlı boyutlu hedeflenen genomik bölgelerin 3D organizasyonunu yüksek çözünürlükte karakterize etmek için kullanılan Capture Hi-C yöntemini açıklar.

Yüksek Çözünürlüklü 3D Kromatin Organizasyonunun Capture Hi-C ile Deşifre Edilmesi

Burada, kromozom konformasyon yakalama (3C) tekniğinin lisans katılımı ve öğrenimine vurgu yaparak ayrıntılı olarak bir adaptasyonunu sunuyoruz.

3C'lerle A Almak: Lisans Öğrencileri için Kromozom Konformasyon Yakalama

Uzaysal analiz için euchromatin, heterokromatin ve RNAP II'nin tekrarlanabilir haritalanmasını sağlayan üç renkli kromatin tek molekül lokalizasyon mikroskopisi (SMLM) boyama ve analiz protokolü sunuyoruz. Bu protokol, kromatinle ilişkili hedefler dahil olmak üzere yoğun nükleer ortamlarda verimli çok renkli etiketleme sağlar ve güvenilir eşzamanlı tespiti sağlar.

Yoğun Nükleer Ortamda Kromatinin Araştırılması İçin Çok Etiketli Tek Molekül Lokalizasyon Mikroskopi Protokolü

Keşfedin, fare embriyonik kök hücrelerinde CRISPR/Cas9 kullanarak PRC2 aracılıklı kromatin etki alanlarının dinamik oluşumunu nasıl izleyeceğinizi. Bu yöntem, kromatin dinamiklerini gerçek zamanlı analiz için duraklatılabilir bir sistem sunar.

Kromatin Etki Alanlarının De novo Oluşumunu İnceleme Yöntemi

Daha fazla video keşfet