Name: İnsan S100A12 ve Bağışıklık Hücre Stimülasyonu için Iyon kaynaklı Oligomerlerin Saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Keşfedin insan S100A12 proteininin iyon kaynaklı oligomerlerini saflaştırma yöntemini. Yüksek verimli ve endotoksin içermeyen protein elde ederek bağışıklık hücre stimülasyonu için fonksiyonel analizler yapabilirsiniz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Muenster Üniversitesi tıp fakültesi (KE121201-C.K.) ve Alman Araştırma Vakfı'nın (DFG, Fo354/3-1'den D.F.)'e intramural yenilikçi tıbbi araştırma programı tarafındandesteklenmiştir.

NOT: Tamponlar ve stok çözümlerinin hazırlanması için lütfen Ek Tablo 1'e bakın.
1. E. coli protein ekspresyonu
<ol><li>
Klonlama
	<ol>
<li>Klon etiketiz insan S100A12 (NCBI Referans Sırası: NP_005612.1) içine bakteriyel ekspresyon vektör pET11b. Proteini ifade etmek için yapıyı E. coli BL21'e (DE3) dönüştürün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kültür
	<ol>
<li>14 mL yuvarlak alt tüpte 5 mL büyüme ortamına (LB suyu 100 μg/mL ampisilin) tek bir koloni aşılayarak bir başlangıç kültürü hazırlayın. Gece boyunca 37 °C'de 220 rpm'de sallayarak kuluçkaya yatırın. 2 L Erlenmayer şişesinde 400 mL'lik büyüme ortamına gece kültürünün 2−4 mL'sini aktarın ve 220 rpm'de sallayarak kültürü 37 °C'de kuluçkaya yatırın. NOT: Ana kültürün başlangıç yoğunluğu 600 nm (OD600) = 0.1 optik yoğunluk olmalıdır.</li>
		<li>Büyüme sırasında OD600'ü izleyin. OD600 = 0.5−0.6'da 1 mM'lik son konsantrasyona 1 M izopropil-ß-D-tiogalaktopiranosid (IPTG) ekleyerek protein ekspresyonunu indükleyin. Ek 4 saat için 37 °C ve 220 rpm'de kuluçkaya yatırın. NOT: Genel olarak, 37 °C'de 1,5−2,5 h'den sonra 0,6'lık bir OD600'e ulaşılacaktır.</li>
		<li>50 mM Tris, 50 mM NaCl ve 1 mM etilendim tetraasetik asit (EDTA) 40 mL deiyonize su eriterek 50 mL sonication tampon hazırlayın. HCl ile pH'ı 8.0'a ayarlayın ve 50 mL'ye kadar yapın. Proteaz inhibitörü (50 mL çözeltisi başına 1 tablet) ekleyin ve tamponu 4 °C'ye dengeleyin.</li>
		<li>Bakteri kültürünü uygun santrifüj şişelerine aktarın ve hücreleri 3200 x g'de 4 °C'de 30 dk'da hasat edin. Supernatant atın ve buz gibi sonication tampon 25 mL pelet resuspend. Bundan sonra hücreleri buzda tut. NOT: Resuspended hücreler kısa süreli olarak -20 °C'de, uzun süreli olarak ise -80 °C'de saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sonication / lysis
	<ol>
<li>Hücreleri buzüzerinde 30 s 6 döngü için sonicate. Her döngüden sonra hücreleri aşırı ısınmadan korumak için hücreleri 30−60 s kadar dinlendirin.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu önceden soğutulmuş 50 mL yüksek hızlı santrifüj tüpüne ve 4 °C'de 30 dakika boyunca 15.000 x g sabit açı rotoruile santrifüje aktarın. Çözünür sitosolik proteinleri içeren temizlenmiş lysat'ı 50 mL'lik taze bir tüpe boşaltın ve peleti atın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Protein Arıtma
<ol><li>Aniyon değişimi kromatografisi
	<ol>
<li>Diyaliz<ol>
<li>20 mM Tris, 1 mM EDTA ve 1 mM etilen glikol-bis(2-aminoetitilether)-N,N,N'-tetraasetik asit (EGTA) deiyonize suda eriterek anyon değişimi kromatografisi (AIEX) tamponUnu hazırlayın ve pH'ı HCl ile 8,5'e ayarlayın. Diyaliz için 2 x 5 L ve kromatografi için 2x 1 L AIEX tampon A hazırlayın. NOT: Diyaliz hacmi örnek hacmin yaklaşık 100 katı olmalıdır. Kromatografi için kullanılan tüm tamponlar filtre edilmeli (0,45 μm veya daha küçük) ve gazgiderilmelidir (örn. ultrasonik banyo veya vakum lu gaz giderme ile).</li>
			<li>Diyaliz borularını (moleküler ağırlık kesme [MWCO]: 3,5 kDa) hava için ek alan ile uygun bir uzunlukta keserek, dönen karıştırma çubuğunun üzerinde numune kaldırma kuvveti sağlayın. NOT: Gliserol membran korur ve kullanmadan önce kaldırılmalıdır.</li>
			<li>Temizlenmiş protein çözeltisinin viskozitesini adım 1.3.2'den azaltmak için, kromatografi kolonuna sonraki uygulamayı kolaylaştırmak için çözeltiyi 25 mL AIEX tampon A ile seyreltin. İlk kapatmayı boruya takın, numuneyi membrana yükleyin ve ikinci kapatmayı borunun üst ucundan en az 1 cm takın.</li>
			<li>AIEX tampon A ile 5 L kabını bir karıştırma plakası üzerine yerleştirin, bir karıştırma çubuğu ve protein çözeltisi ile dolu membran ekleyin. Dönen karıştırma çubuğuna müdahale den kaçınarak numuneyi döndürmek için hızı ayarlayın. 4 °C'de 12−24 saat diyalize koyun, ardından diyaliz tamponu (AIEX tampon A) taze bir önceden soğutulmuş bir hazırlıkla değiştirin ve en az 4 saat daha devam edin. Diyaliz protein çözeltisini 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 0,45 m'lik bir filtre ünitesinden filtreleyin. NOT: Depolama mümkün.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kromatografi</li>
		<li>Sıvı kromatografi sistemini (FPLC) genel bakımla başlatın, kolon tamponlarını AIEX A ve AIEX B (AIEX tamponA 1 M NaCl'li A) ve kolon içeren aniyon değişimi reçinesini bağlayın. Genel kromatografik parametreler için Tablo 1'e bakın. NOT: Arabellekler, kolon ve FPLC ekipmanları çalıştırmaya başlamadan önce aynı sıcaklığa denk verilmelidir (Tablo 1, Tablo 2, Tablo 3, Tablo 4ve Tablo 5'tekikromatografik parametrelere bakın).</li>
		<li>Sütunu AIEX tampon U ile dengeleyin, daha sonra numuneyi kolona yükleyin ve proteinleri %0 ile %100 arasında doğrusal bir degrade yle (AIEX B) uzaklaştırın. Ayrıntılı bir yöntem protokolü için Tablo 2'ye bakın.</li>
		<li>Elüsyon sırasında 2 mL fraksiyonu toplayın ve Coomassie lekeli %15 sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforezinde (SDS-PAGE) her fraksiyonun 10 μL'sini analiz edin. Diyaliz için S100A12 proteini içeren fraksiyonları havuz. NOT: S100A12'nin molekül ağırlığı 10.575 Da'dır.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalsiyuma bağımlı hidrofobik etkileşim kromatografisi (HIC)
	<ol>
<li>Diyaliz<ol>
<li>20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.5'e karşı 2.1.1 bölümünde açıklanan prosedürü uygulayın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Kromatografi<ol>
<li>Deiyonize suda 20 mM Tris, 140 mM NaCl ve 25 mM CaCl2 eriterek 1 L kromatografi tamponu HIC A hazırlayın ve pH'ı 7,5'e ayarlayın. HIC tampon B için 20 mM Tris, 140 mM NaCl ve 50 mM EDTA çözünür. pH'ı 7.0'a ayarlayın ve arabellekleri filtreleyin ve gazdan arındırın. CaCl2'yi numuneye 25 mM'lik son konsantrasyona ekleyin ve 0,45 m. üzerinden filtre uygulayın.</li>
			<li>Sıvı kromatografi sistemini genel bakımla başlatın, hic A ve B sütunaralarını ve sütunu bağlayın. Daha fazla kromatografik parametreler için Tablo 3'e bakın.</li>
			<li>Kolonu dengeleyin, numuneyi yükleyin ve UV sinyali taban çizgisine tekrar ulaşana kadar 'bağlı olmayan numuneyi yıkayın' bloğunu genişletin. Sonra tampon içeren bir kalsiyum şelatör ile elütion başlayın (EDTA). Ayrıntılı bir yöntem protokolü için Tablo 4'e bakın. NOT: Önceki deneyler, kalsiyum fazlalığı kromatografi rezorne S100A12 bağlanması için yararlı gibi görünüyor göstermiştir.</li>
			<li>2 mL'lik pik fraksiyonları toplayın ve Coomassie lekeli %15 SDS-PAGE'de her fraksiyonun 10 μL'sini analiz edin. Havuz saf S100A12 fraksiyonları ve hepes tamponlu tuzlu (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7.0) karşı diyaliz bölüm 2.1.1 açıklandığı gibi. NOT: Monomerik S100A12'nin yok olma katsayısı 2980 M-1 cm-1'dir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. Endotoksinin Saptanması ve Çıkarılması
<ol><li>
Endotoksin tespiti
	<ol>
<li>Endotoksin kontaminasyonunu belirlemek için seyreltilmiş protein konsantrasyonlarını adım 2.2.2.4'ten ölçün. (örneğin, 1:10 ve HBS 1:100) bir enzim bağlı immünosorbent test kullanarak (ELISA) tabanlı, floresan endotoksin algılama tayini (Malzeme Tablosu). Üreticinin protokolünü izleyerek bu tayini gerçekleştirin. NOT: Tampon tarafından endotoksin kontaminasyonunu önlemek için ultra saf deiyonize suda çözünmüş taze hazırlanmış HBS çözeltilerini kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Endotoksinin çıkarılması ve protein konsantrasyonu
	<ol>
<li>Yaklaşık 10 dk. için 3.200 x g ve 10 °C'de 50 kDa santrifüj filtre ünitesine ve santrifüje 15 mL numune yükleyin. Her adımdan sonra mümkün olduğunca fazla protein ilerletmek için filtre zarını HBS ile iki kez yıkayın.</li>
		<li>S100A12 içeren akışı, hacim ilk yükleme hacminin onda birine kadar beşte birine (3.200 x g, yaklaşık 30 dakika boyunca 10 °C'de santrifüj) indirinceye kadar 3 kDa santrifüj filtre kullanarak yoğunlaştırın. Filtreyi gerektiği sıklıkta doldurun, membranı durulayın ve konsantre çözeltiyi her dolumdan sonra yeni bir tüpe aktarın. Akışı atın. Yukarıda açıklandığı gibi 50 kDa ile tekrar filtreuygulayın. NOT: Bu işlem sırasında, protein kaybı dikkat çekicidir (%50'ye kadar), ancak kalan protein preparatları LPS'den tamamen tükenir. Bu yöntem 400 mL kültüründen yaklaşık 10−15 mg protein verir.</li>
		<li>Protein çözeltisini endotoksinsiz HBS ile 1 mg/mL'ye ayarlayın ve adım 3.1.1'de açıklandığı gibi LPS içeriğini ölçün. Protein çözeltisinin LPS içermeyen (<0.1 EU/mL) olarak hala test edilememiş olması durumunda, endotoksin giderme recibunu kullanarak kalıntı kontaminasyonu ortadan kaldırın. NOT: Protein konsantrasyonu 1 mg/mL olan 0.1 EU/mL LPS'nin kontaminasyonu yaklaşık 0.01 pg LPS/μg proteine eşittir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Kimyasal Crosslinking ve Oligomer Ayırma
<ol><li>
Kimyasal crosslinking
	<ol>
<li>Ultra saf deiyonize suda 1 M CaCl2 ve 100 mM ZnCl2'lik son derece saf (endotoksiniçermeyen) stok çözeltilerini hazırlayın(Malzeme Tablosu). Bir sonraki adım için bu arabelleği, yeni yapılmış olarak kullanın.</li>
		<li>10 mL saflaştırılmış endotoksinsiz S100A12 (HBS'de konsantrasyon 1 mg/mL) oda sıcaklığında 30 dakika (RT) dimeric/tetrameric için 25 mM CaCl2 veya hexameric/tetrameric S100A12 için 25 mM CaCl2 ve 1 mM ZnCl2 oligomerlar.</li>
		<li>Kullanmadan önce 500 μL endotoksinsiz suyun 8 mg BS3 mg'ını eriterek çapraz bağlantıyı hazırlayın (10 mL iyon çivili protein çözeltisi için 8 mg crosslinker 1.4 mM'lik son konsantrasyona eşittir). Çapraz bağlantıyı karıştırın ve rt. 1 M Tris-HCl, pH 7.5 50 mM son konsantrasyonve filtre ile 0.45 μm ile reaksiyon quench ek 30 dakika için pipetleme ve kuluçka ile karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Boyut dışlama kromatografisi
	<ol>
<li>Çapraz bağlı numuneyi 12−15 °C (kolon sıcaklığı) arasında dengeleyin ve sıvı kromatografi sistemini genel bakım la çalıştırın. Sütun arabelleği (HBS) ve boyut dışlama sütununa bağlayın. Ayrıntılı bilgi için Tablo 5'e bakın.</li>
		<li>HbS'deki kolonu dengeleyin, numuneyi yükleyin ve çalışma sırasında tepe kesirlerini (1−2 mL) toplayın. Bu kesirleri %4−20 degrade SDS-PAGE ve havuz fraksiyonları üzerinde istenilen protein kompleksinin ana bantları ile analiz edin. NOT: Sulu çözeltilerde BS3 gibi NHS ester reaktiflerinin hidrolizi 280 nm'de güçlü bir emicilik sağlar. Bağlantısız çapraz bağlantı (molekül ağırlığı: 572 g/mol) koşu sonunda eutes ve güçlü bir tepe ile sonuçlanır.</li>
		<li>10 kDa (dimer), 30 kDa (tetramer) veya 50 kDa (hexamer) MWCOs ile santrifüj filtre üniteleri kullanarak çözeltileri konsantre. Bölüm 3.1'de açıklandığı gibi endotoksin kontaminasyonunu belirleyin. Gerekirse, üreticinin tavsiyelerine(Malzeme Tablosu)uyarak kalan LPS'yi endotoksin giderme reçiyonu ile çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Monositler Üzerinde Fonksiyonel Test
<ol><li>Monositlerin hazırlanması
	<ol>
<li>Yoğunluk gradyan santrifüj ve sonraki monosit zenginleştirme ile insan buffy kat monositler izole manyetik boncuk ayırma kiti kullanarak(Malzeme Tablosu). NOT: Bu protokol yaklaşık 5−7 x 107 monosit (bir buffy kat) saflık %83−95 ile sonuçlanacaktır. Hücre sayısı nın değil, aynı zamanda yanıt verme nin donöre bağlı olması nedeniyle, protokolün (gerekli hücre sayısına bağlı olarak) ölçeklendirilmesi gerekebilir.</li>
		<li>Yoğunluk santrifüjü için ayırma çözeltisini (yoğunluk = 1,077 g/mL) RT'ye dengeleyin ve 20 mL'yi 50 mL santrifüj tüpüne (buffy coat başına 2 tüp) aktarın. Hank'in tamponlu tuz çözeltisi (HBSS) ile insan buffy ceketindeki kanı 60 mL toplam hacimve bu karışımın 30 mL'lik tabakasına kadar seyreltin. Sentrifüj 550 x g 35 dk rt. santrifüj fren ilerler.</li>
		<li>Santrifüjden sonra mononükleer periferik kan hücreleri (PBMCs) ayırma ortamının hemen üstünde yer alır. Bu hücreleri 50 mL'lik taze bir santrifüj tüpüne aktarın, HBSS ile 50 mL'ye kadar yapın ve 10 dk.'da 170 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Tüpü 50 mL'ye kadar doldurun ve 10 dk için 290 x g'da santrifüj doldurun. /c9>) 5 x 107 hücre/mL konsantrasyonuna. NOT: HBSS yerine, fosfat tamponlu salin (PBS) hücreleri yıkamak için kullanılabilir.</li>
		<li>PBMC'lerden monosit izolasyonu için manyetik negatif hücre izolasyon kiti kullanın ve üreticinin protokolünü uygulayın. Monositleri sayın ve monosit ortamda (RPMI 1640, %15 ısı-inaktive fetal baldır serumu [FCS], 4 mM L-glutamin, 100 U/mL penisilin/streptomisin) 2 x 106 hücre/mL konsantrasyonuna geri alın.</li>
		<li>Kültür monositler için, ceket kültür yemekleri (örneğin, 100 mm) bir hidrofobik, gaz geçirilebilir film, süspansiyon hücreleri için uygun(Malzeme Tablosu). Yaklaşık 30 dakika UV ışığı kullanarak plakaları sterilize edin. Hücreleri bu kültür plakalarına aktarın ve 37 °C ve %5 CO2'degece boyunca dinlenmelerini sağlar. NOT: Kaplamalı çanak başına 15−25 mL hücre süspansiyonu kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Monosit stimülasyonu
	<ol>
<li>S100A12 ile stimülasyon (wildtype) NOT: İşlenmemiş S100A12'yi (bölüm 2.2.2'den son ürün) çapraz bağlı proteinden ayırt etmek için, aşağıdaki S100A12'ye 'yabani tip' denir.<ol>
<li>Dinlenmiş hücreleri 10 dk için 350 x g'de 50 mL santrifüj tüp ve santrifüje aktarın. streptomisin) 2 x 106 hücre/mL konsantrasyonda.</li>
			<li>Stimülasyon için, 24 iyi süspansiyon plakası kullanın ve kuyu başına 250 μL hücre süspansiyonu ekleyin (0,5 x 106 hücre/kuyu). Amaçlanan kuyulara 50 g/mL polimaddin B ekleyin ve ardından farklı konsantrasyonlarda LPS (25, 50, 100 ve 200 pg/mL) veya wildtype S100A12 (10, 20, 40, 60 μg/mL) ekleyin. Ayrıca, proteini işlenmemiş veya ısıden arındırılmış (99 °C, 10 dk) farklı konsantrasyonlarda hücrelere uygulayın. NOT: Kısa ısıl işlem S100A12 proteinini denatüre eder ancak LPS üzerinde daha az etkisi yoktur.</li>
			<li>37 °C'de 4 saat ve %5 CO2'dekuluçka plakaları. Her kuyunun hücre süspansiyonuna 1,5 mL reaksiyon tüpüne aktararak hücreleri hasat edin. 10 dakika için 500 x g'de santrifüj. Süpernatantları taze tüplere aktarın ve üreticinin tavsiyelerine uygun olarak bir insan TNFα ELISA kiti ile tnfα salınımını farklı seyreltmelerde (örn. 1:2, 1:5, 1:10) ölçün.</li>
		</ol>
</li>
		<li>S100A12 oligomerleri ile stimülasyon<ol>
<li>Hazırlamak ve yukarıda açıklandığı gibi 24 iyi süspansiyon plakaları monositler tohum. Adım 4.2.3 S100A12 oligomerler ekleyerek hücreleri uyarmak. farklı molar konsantrasyonlarında (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM). NOT: Farklı oligomerlerin monositleri uyarabilmeleri için hücrelere karşılaştırılabilir azı lı konsantrasyonlarda oligomerler uygulandı.</li>
			<li>37 °C'de 4 saat ve %5 CO2'dekuluçkaya yatın, hücreleri hasat edin ve yukarıda açıklandığı gibi süpernatantlarda TNFα salınımını ölçün.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Liston, A., Masters, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostasis-altering+molecular+processes+as+mechanisms+of+inflammasome+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).</li>
<li>Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocyte-derived+S100+proteins+in+autoinflammation%3A+putative+role+in+pathogenesis+and+usefulness+as+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers.</a> Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).</li>
<li>Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+circular+dichroism+studies+of+iron%28ii%29+binding+to+human+calprotectin%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin.</a> Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).</li>
<li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).</li>
<li>Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nickel+Sequestration+by+the+Host-Defense+Protein+Human+Calprotectin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).</li>
<li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li>
<li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex%3A+implications+for+host-parasite+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%2C+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li>
<li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc%3A+new+insights+into+S100A12+oligomerisation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).</li>
<li>Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+the+human+%28S100A8%2FS100A9%292+heterotetramer%2C+calprotectin%2C+illustrates+how+conformational+changes+of+interacting+alpha-helices+can+determine+specific+association+of+two+EF-hand+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).</li>
<li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Ca2%2B+and+Zn2%2B+are+essential+for+S100A12+protein+oligomerization+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function.</a> BMC Biochemistry. 10, 11(2009).</li>
<li>Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ions+binding+to+S100+proteins.+I.+Calcium-+and+zinc-binding+properties+of+bovine+brain+S100+alpha+alpha%2C+S100a+%28alpha+beta%29%2C+and+S100b+%28beta+beta%29+protein%3A+Zn2%2B+regulates+Ca2%2B+binding+on+S100b+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).</li>
<li>Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+and+binding+properties+of+calgranulin+C%2C+a+novel+S100-like+calcium-binding+protein+from+pig+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).</li>
<li>Vogl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A12+is+expressed+exclusively+by+granulocytes+and+acts+independently+from+MRP8+and+MRP14%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).</li>
<li>Hofmann, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE+mediates+a+novel+proinflammatory+axis%3A+a+central+cell+surface+receptor+for+S100%2Fcalgranulin+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides.</a> Cell. 97 (7), 889-901 (1999).</li>
<li>Foell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proinflammatory+S100A12+Can+Activate+Human+Monocytes+via+Toll-like+Receptor+4%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).</li>
<li>Kessel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+zinc+tune+autoinflammatory+Toll-like+receptor+4+signaling+by+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).</li>
<li>Armaroli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-Derived+Interleukin-1beta+As+the+Driver+of+S100A12-Induced+Sterile+Inflammatory+Activation+of+Human+Coronary+Artery+Endothelial+Cells%3A+Implications+for+the+Pathogenesis+of+Kawasaki+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease.</a> Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).</li>
<li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Strategies+for+Protein+Purification.+Handbook%22">Strategies for Protein Purification. Handbook</a>. , Freiburg, Germany. (2010).</li>
<li>Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+Purification%2C+and+Antimicrobial+Activity+of+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).</li>
<li>Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+S100+Protein-Protein+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes.</a> Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).</li>
<li>Magalhaes, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+endotoxin+removal+from+biological+preparations%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review.</a> Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).</li>
<li>Petsch, D., Anspach, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+removal+from+protein+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Endotoxin removal from protein solutions.</a> Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).</li>
<li>Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+partial+characterization+of+canine+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Purification and partial characterization of canine S100A12.</a> Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).</li>
<li>Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+human+Ca2%2B-bound+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Solution structure of human Ca2+-bound S100A12.</a> Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).</li>
<li>Endotoxin Removal. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Application+Note+-+Sartorius+Stedim+Biotech%22">Application Note - Sartorius Stedim Biotech</a>. , (2010).</li>
<li>Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymyxin-B+Stimulates+Production+of+Complement+Components+and+Cytokines+in+Human+Monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).</li>
<li>Valentinis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+effects+of+polymyxin+B+on+human+dendritic+cells+maturation+-+The+role+of+I+kappa+B-alpha%2FNF-kappa+B+and+ERK1%2F2+pathways+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).</li>
<li>Teuber, M., Miller, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Binding+of+Polymyxin-B+to+Negatively+Charged+Lipid+Monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokolde, insan S100A12 etiketsiz bakteriyel ekspresyonu ve saflaştırma yanı sıra bağışıklık hücresi stimülasyonu için farklı iyon kaynaklı oligomerler içine ayırma açıklar. S100A12 protein arınması8,23,24üzerine yayınlanan literatürile karşılaştırıldığında hidrofobik etkileşim kromatografisinde yüksek CaCl2 (25 mM) kullanımı bilgimize özgüdür. 1 ila 5 mM arasında konsantrasyon uygulayan çeşitli protokoller saf p...

S100A12 ağırlıklı olarak insan granülositleri tarafından üretilen kalsiyum bağlayıcı bir proteindir. Protein (sistemik) inflamasyon sırasında aşırı ifade edilir ve serum düzeyleri, özellikle sistemik juvenil idiyopatik artrit (sJIA), ailesel Akdeniz ateşi (FMF) veya Kawasaki hastalığı (KD) gibi (oto)inflamatuar hastalıklar hakkında bilgi verebilir hastalık aktivitesi ve tedaviye yanıt. Toll benzeri reseptörler (TLR) gibi örüntü tanıma reseptörlerine (PrR) bağlı olarak, doğuştan gelen bağışıklık sistemi lipopolisakkaritler (LPS) veya hasar ilişkili moleküler desenler (DAMP) gibi patojen ilişkili moleküler desenler (PAMP' ler) tarafından aktive edilebilir; ayrıca 'alarmins' olarak da adlandırılır). DAMP'lar hücresel proteinler, lipidler veya nükleikasitler1 gibi endojen moleküllerdir. DAMP fonksiyonları iyi calgranulin protein ailesinin üyeleri için tarif edilir, S100A8/A9 ve S100A122, ayrıca divalent metal iyon-şelat antimikrobiyal peptidler 3 olarak faaliyet bildirilmiştir3,4, 5,6. Mevcut iyon gücüne bağlı olarak S100A12, S100 ailesinin diğer üyeleri gibi, farklı homomultimerler içine düzenlemek ve yakın zamana kadar PRR-etkileşim, özellikle TLR4 s100A12-oligomerizasyon etkisi bilinmemektedir.
Proteinin monomerik formu (92 amino asit, 10.2 kDa) esnek bir bağlayıcı ile birbirine bağlanan iki EF-el sarlis-döngü-sarlis yapılarından oluşur. C-terminal EF-eli klasik Ca2+-bağlayıcı motifiçerirken, N-terminalEF-eli S100 proteine özgü genişletilmiş döngü yapısını ('pseudo-EF-hand') sergiler ve azaltılmış Ca2+-yakınlığı ortaya çıkarır. Ca2+-S100A12 ile bağlanma proteinlerin C-terminus'unda büyük bir konformasyonel değişikliğe neden olabilir, bu da her monomerde hidrofobik bir yamanın maruz kalmasına neden olur ve dimerizasyon arayüzünü oluşturur. Bu nedenle, fizyolojik koşullar altında, S100A12 tarafından oluşturulan en küçük kuaternary yapı, tek tek monomerlerin antiparalel yönde olduğu kovalent olmayan bir dimer (yaklaşık 21 kDa) dir. Dimer olarak düzenlendiğinde, S100A12 sequester Zn2 + yanı sıra diğer divalent metal iyonları bildirilmiştir, örneğin, Cu2 + yüksek yakınlık ile7. Bu iyonlar S100A12 dimer arabiriminde bir alt birim ve H85 amino asitleri H15 ve D25 yanı sıra anti-paralel diğer alt birim8,9,10H89 tarafından koordine edilir. Daha önceki çalışmalarz Zn2 +yüklü S100A12 homo-tetramer (44 kDa) içine protein organizasyonu neden olabilir ve artmış Ca2 +-afinite11,12, son metal titrasyon neden olabileceğini öne süre çalışmalar6 Zn2 +proteinin afinitesini artırmak için S100A12 tarafından Ca 2+-bağlayıcı öneririz. S100A12 EF-hands tamamen Ca 2+tarafından işgal edildikten sonra, ek Ca2 + dimers arasında bağlamak için düşünülmektedir, hexamer oluşumunu tetikleyen (yaklaşık 63 kDa). Hexameric quarternary yapısının mimarisi tetramerin mimarisinden açıkça farklıdır. Tetramer arabiriminin, hexamerformasyonu 10'afayda sağlayan yeni dimer-dimer arabirimlerine yol vermek için bozulduğu öne sürüldü. S100A12 neredeyse sadece insan granülositler tarafından ifade edilir nerede tüm sitosolik protein13yaklaşık% 5 oluşturmaktadır. Onun DAMP fonksiyonu nda S100A12 tarihsel gelişmiş glisasyon son ürünler için multi-ligand reseptöragonist olarak tarif edildi (RAGE), sonra ekstrasellüler yeni tanımlanan RAGE bağlayıcı protein denir (EN-RAGE)14. Daha önce hem RAGE hem de TLR415için biyokimyasal S100A12-bağlayıcı rapor olsa da, biz son zamanlarda bir TLR4 bağımlı şekilde S100A12 stimülasyon yanıt insan monositler gösterdi16. Bunun için S100A12'nin Ca2+/Zn2+indüklenen hexameric quarternary yapısına düzenlenmesigerekmektedir 16.
Burada rekombinant insan S100A12 ve bağışıklık hücresi stimülasyonu için iyon kaynaklı oligomerler için bir arıtma prosedürü tarif16,17. Bu iki aşamalı kromatografi stratejisine dayanmaktadır, başlangıçta izole etmek ve protein konsantre ve toplu kontaminasyonkaldırmak için bir aniyon değişimi sütun içeren (örneğin, endotoksinler / lipopolisakkaritler)18. İon-exchange kromatografi resinleri farklı net yüzey yükleri temelinde ayrı proteinler. S100A12 (izoelektrik nokta 5.81), pH ile bir tampon sistemi 8.5 ve güçlü bir aniyon değişimi reçine gibi asidik proteinler için iyi bir ayırma yol açar. Bağlı proteinler yüksek tuz tampon gradyanı ile eluted edildi. Elüsyon tamponundaki iyonik mukavemetartışı ile negatif iyonlar rezorin yüzeyindeki yükler için proteinlerle rekabet eder. Proteinler net yüklerine bağlı olarak ayrı ayrı eute ve bunun sonucu olarak, burada açıklanan tamponlar aşırı ifade edilen S100A12 proteinini izole edip konsantre etmelerine olanak sağlar. Lipopolisakkaritlerde negatif yüklü gruplar nedeniyle, bu moleküller de aniyon değişimi reçineler bağlanır. Ancak, onların yüksek net şarj uygulanan yüksek tuz gradyan daha sonra elüsyon sonuçlanır. Arınma prosedürünün ikinci adımı parlatma amacıyla getirilmiştir. Bu, S100A12'nin kalsiyum bağlama yeteneğini kullanır ve hidrofobik etkileşim sütununda kalan yabancı maddeleri ortadan kaldırır. S100A12 kalsiyum bağlanması konformasyonel değişime ve protein yüzeyinde hidrofobik yamalar maruz kalmasına yol açar. Bu durumda, S100A12 resenin hidrofobik yüzeyi ile etkileşime girer. EDTA tarafından kalsiyum-şelat üzerine, bu etkileşim tersine çevrilir. S100A12, başta kalsiyum ve çinko olmak üzere iyonların varlığında homomerik oligomerlere dönüşür. Farklı oligomerlerin yapı-fonksiyon ilişkilerini incelemek için dimerik, tetramerik ve hexameric rekombinant S100A12'yi kimyasal bir çapraz bağlantı ile stabilize ettik ve kompleksleri boyut dışlama kromatografisi sütununda ayırdık. Son olarak, saflaştırılmış proteinin ve iyonkaynaklı oligomerlerin işlevselliğini ve biyolojik aktivitesini analiz etmek için, S100A12 ve LPS uyarılmış monositin sitokin salınımı karşılaştırılabilir.
S100A12'yi arındırmak için şimdiye kadar çeşitli yöntemler tanımlanmıştır. Jackson ve ark.19, örneğin, bir aniyon değişimi sütun ve sonraki boyut dışlama kromatografisi yoluyla arınma ile bir protokol yayınladı. Boyut dışlama sütununda saflaştırma parlatma iyi sonuçlar doğurur, ancak örneğin sınırlı yükleme hacimleri―ölçeklenebilirlik açısından daha az esnektir. Kiss ve ark.20tarafından yayınlanan farklı bir yaklaşım, etiketli proteinin Ni2+ yakınlık sütunu üzerinden saflaştırılmasını ilk saflaştırma adımı olarak tanımlar, ardından etiketi ve daha fazla saflaştırma adımını çıkarmak için enzimatik bölünme yi takip eder. Önseki çalışmaların aksine19,20, bu protokolde açıklandığı gibi üretilen protein bağışıklık hücreleri üzerinde deneyler için belirlenir. Bu nedenle, bakteri kültüründen kalıntı endotoksin kontaminasyonu bir meydan okumadır. Endotoksin çıkarılması için farklı yaklaşımlar şimdiye kadar tarif edilmiş olmasına rağmen, herhangi bir protein çözeltisi için eşit derecede iyi çalışan bir yöntem yoktur21,22.
Özetle, protokolümüz bir bakteri sisteminde etiketsiz ifadenin avantajlarını verimli endotoksin giderme ve yüksek saf protein verimi ile birleştirir.

<table><tbody><tr><td>pET11b vektör</td><td>Novagen</td><td><güçlü>&nbsp; </güçlü></td><td><güçlü>&nbsp; </güçlü></td></tr><tr><td>BL21(DE3) yetkin E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527</td><td><güçlü>&nbsp; </güçlü></td></tr><tr><td><güçlü>&nbsp; </güçlü></td><td><güçlü>&nbsp; </güçlü></td><td><güçlü>&nbsp; </güçlü></td><td><güçlü>&nbsp; </güçlü></td></tr><tr><td>100x Esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Merck</td><td>K 0293</td><td></td></tr><tr><td>%25 HCl</td><td>Carl Roth</td><td>X897.1</td><td></td></tr><tr><td>4&eksi; % 20 Mini-PROTEAN TGX Protein Jelleri</td><td>BioRad</td><td>4561093</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin sodyum tuzu</td><td>Carl Roth</td><td>HP62.1</td><td></td></tr><tr><td>BS3 (bis (sülfosüksinimidil) suberate) - 50 mg</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21580</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyumklorid Dihidrat</td><td>Carl Roth</td><td>5239.1</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Briliant Blue R250 Leke Giderici Solüsyon</td><td>BioRad</td><td>1610438</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Briliant Blue R250 Boyama Solüsyonu</td><td>BioRad</td><td>1610436</td><td></td></tr><tr><td>EasySep İnsan Monosit Zenginleştirme Kiti</td><td>Kök Hücre</td><td>19059</td><td>Manyetik negatif hücre izolasyon kiti</td></tr><tr><td>EDTA disodyum tuzu dihidrat</td><td>Carl Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>EndoLISA</td><td>Hyglos</td><td>609033</td><td>Endotoksin tespiti tahlil</td></tr><tr><td>Endotoksin İçermeyen Ultra Saf Su</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TMS-011-A</td><td>Endotoksin içermeyen tamponların hazırlanması için ultra saf su</td></tr><tr><td>EndoTrap kırmızı</td><td>Hyglos</td><td>321063</td><td>Endotoksin giderme reçinesi</td></tr><tr><td>FBS (ısıyla etkisizleştirilmiş)</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, kalsiyum yok, magnezyum yok</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175053</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Carl Roth</td><td>9105</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (yüksek kalite, endotoksin testis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>hTNF-alpha - OptEia ELISA Set</td><td>BD</td><td>555212</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (izopropil-&szlig;-D-tiyogalaktopiranosid)</td><td>Carl Roth</td><td>CN08.1</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Merck</td><td>K 0282</td><td></td></tr><tr><td>LB-Orta</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>E. coli</em'den lipopolisakkaritler> O55:B5</td><td>Merck</td><td>L6529</td><td></td></tr><tr><td>Pancoll, insan</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-60500</td><td>Ayırma çözeltisi (yoğunluk gradyan santrifüjü</td></tr><tr><td>) Penisilin / Streptomisin (10.000 U / mL)</td> <td>Merck</td><td>A 2212</td><td></td></tr><tr><td>Fenil Sefaroz Yüksek Performanslı</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1082-01</td><td>Reçine için hidrofobik etkileşim kromatografisi</td></tr><tr><td>Polimiksin B</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pmb</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitör tabletleri</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Q Sefaroz Hızlı Akış</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td>Anyon değişim kromatografisi için reçine</td></tr><tr><td>RoboSep tamponu</td><td>Kök Hücre</td><td>20104</td><td>Hücre ayırma tamponu (bölüm 5.1.4)</td></tr> <tr><td>RPMI 1640 Orta</td><td>Merck</td><td>F 1215</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Carl Roth</td><td>P031.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris Tabanı</td><td>Carl Roth</td><td>4855.3</td><td></td></tr><tr><td>Çinko klorür</td><td>Carl Roth</td><td>T887</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,45 ve mikro; m şırınga filtresi</td><td>Merck</td><td>SLHA033SS</td><td></td></tr><tr><td>14 mL yuvarlak tabanlı tüpler</td><td>BD</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>2 L Erlenmyer şişesi</td><td>Carl Roth</td><td>LY98.1</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu süspansiyon plakaları</td><td>Greiner</td><td>662102</td><td></td></tr><tr><td>5 L ölçüm kabı</td><td>Carl Roth</td><td>CKN3.1</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik santrifüj tüpleri</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>50 mL yüksek hızlı santrifüj tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td>3,01,22,178</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Ünitesi MWCO 3 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Santrifüj Filtre Ünitesi MWCO 50 kDa</td><td>Merck</td><td>UFC905024</td><td></td></tr><tr><td>Kültür kabı (100 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>Diyaliz Tüpü Kapakları</td><td>Spektrum 132738</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep mıknatıs 'The Big Easy'Stemcell</td><td></td> <td>18001</td><td></td></tr><tr><td>Fraksiyon toplayıcı tüpler 5 mL</td><td>Greiner</td><td>115101</td><td></td></tr><tr><td>Lumox film, 25 & m, 305 mm x 40 m</td><td>Sarstedt</td><td>94,60,77,316</td><td>Monosit kültür plakaları için film</td></tr><tr><td>Spectra/Por Diyaliz Membranı (3,5 kDa)</td><td>Spektrum</td><td>132724</td><td></td></tr><tr><td>Steritop filtre ünitesi</td><td>Merck</td><td>SCGPT01RE</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Ekipman</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 derece; C İnkübatör (çalkalamalı)</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>&auml; KTA temizleyici UPC 10</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC Sistemi</td></tr><tr><td>Fraksiyon toplayıcı</td><td>GE Healthcare</td><td>Frac-920</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj (rotor A-4-81 ile)</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Sabit açılı rotor</td><td>Eppendorf</td><td>F-34-6-38</td><td></td></tr><tr><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td>BioRad</td><td>1658000EDU</td><td></td></tr><tr><td>NanoFotometre</td><td>Implen</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>Sonikatör</td><td>Brandelin</td><td>UW2070</td><td></td></tr><tr><td>Floresan okuyucu</td><td>Tecan</td><td>sonsuz M200PRO</td><td></td></tr><tr><td>pH metre</td><td>Knick</td><td>765</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan s100a12 ve bağışıklık hücre stimülasyonu için iyon kaynaklı oligomerlerin saflaştırılması

Purification of Human S100A12 and Its Ion-induced Oligomers for Immune Cell Stimulation

Bu protokolde, bağışıklık hücresi stimülasyonu için Escherichia coli kültüründen insan kalsiyum bağlayıcı protein S100A12 ve iyon kaynaklı oligomerleri arındırmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, bir aniyon değişimi kromatografisi sütununda protein ön arıtma ve hidrofobik etkileşim sütununda bir sonraki parlatma adımlarını içeren iki aşamalı bir kromatografi stratejisine dayanmaktadır. Bu strateji yönetilebilir maliyetlerle yüksek saflıkta ve verim S100A12 protein üretir. Bağışıklık hücreleri nihai kalıntı endotoksin kontaminasyonfonksiyonel tahliller için endotoksin içermeyen protein elde etmek için dikkatli izleme ve daha fazla temizlik adımları gerektirir. Endotoksin kontaminasyonlarının çoğu aniyon değişimi kromatografisi ile dışlanabilir. Artık kontaminasyonları tüketmek için, bu protokol santrifüj filtreleri ile bir kaldırma adımı açıklar. Mevcut iyon gücüne bağlı olarak S100A12 farklı homomultimerler içine düzenleyebilirsiniz. Yapı ve fonksiyon arasındaki ilişkiyi araştırmak için, bu protokol s100A12 proteininin iyon tedavisini ve ardından S100A12 oligomerlerini stabilize etmek için kimyasal crosslinking'i ve bunların boyut-dışlanma ile ayrılmasını tanımlar. Kromatografi. Son olarak, saflaştırılmış proteinin biyolojik aktivitesini doğrulayan ve LPS içermeyen hazırlığı doğrulayan hücre bazlı bir test tanımlıyoruz.

AIEX kolonunda ön arıtma(Şekil 1A-C)ve sonraki kalsiyuma bağımlı HIC(Şekil 2A,B)sonra, yüksek saf protein elde edildi (Şekil 2C). Buna ek olarak, endotoksin ölçümleri başarılı LPS kaldırma ortaya. AIEX'i izleyen LPS içeriği, 500 EU/mL'nin üzerinde, yani, assay algılama limitinin 1:10 seyreltmesinde ölçüldü. 50 kDa filtre ünitesinden ilk filtreleme den sonra, LPS içeriği 1 EU/mL'ye düşürüldü. 3 kDa f...

Bu protokol, rekombinant etiketsiz kalsiyum bağlayıcı protein S100A12 ve insan monosit stimülasyonu tahlilleri için iyonkaynaklı oligomerler için bir arıtma yöntemini tanımlar.

İnsan S100A12 ve Bağışıklık Hücre Stimülasyonu için Iyon kaynaklı Oligomerlerin Saflaştırılması

In this protocol, we describe a method to purify human calcium-binding protein S100A12 and its ion-induced oligomers from Escherichia coli culture for ...

Bu protokol, insan kalsiyum bağlayıcı protein, S100A12 için tam bir arıtma prosedürü açıklar, ve özellikle, downstream araştırma etkileri için farklı iyon kaynaklı oligomerler için. Bu teknikle, çok saf ve endotoksiniçermeyen proteinin yüksek verimini koruyabiliyoruz. Boyut dışlama kromatografisi sütununda kimyasal çapraz bağlanma ve ayırma, daha işlevsel tahliller için homo-oligomerik proteinler üretmek için ikna edici bir yöntemdir.Tekniğimiz, ideal olarak yeni hedefli müdahaleler geliştirmek ve tanısal tahlilleri geliştirmek için desen tanıma reseptör ligand ve sanat bilgileri olarak S100A12'nin mekanistik yönlerine gitmemizi sağlar. Bu videoyu izlemenin yanı sıra, karmaşık, çok aşamalı bir yordamı tanımladığımız gibi protokolün dikkatli bir şekilde okunmasını öneririz. Başlamak için, uygun bir uzunlukta, yaklaşık 30 santimetre, hava için ek alan ile bir diyaliz boru kesti.Gliserol kaldırmak için 15 ila 30 dakika deiyonize suda membran ıslatın. Temizlenmiş protein çözeltisinin viskozitesini azaltmak için çözeltiyi 25 mililitre AIEX tamponu a.ekle ile seyreltin. Numuneyi membrana yükleyin ve ikinci kapatmayı borunun üst ucundan en az bir santimetre takın.Dört santigrat derece de soğutulmuş bir odada, bir karıştırma plakası üzerine AIEX tampon A ile konteyner yerleştirin, bir karıştırma çubuğu ekleyin, ve protein çözeltisi ile dolu membran. Döndürme çubuğuna müdahale olmayacak şekilde numuneyi döndürmek için hızı ayarlayın. Diyaliz 12 ila 24 saat boyunca dört santigrat derece sonra ücretsiz önceden soğutulmuş arabellek A ile diyaliz tampon değiştirin ve en az dört ek saat devam edin.Diyaliz protein çözeltisini borudan 0,45 mikron filtre ünitesinden 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. FPLC'yi genel bakımla başlatın. AIEX A ve AIEX B kolon arabelleklerini tampon vanalarına ve kolon içeren aniyon değişim reçinesini FPLC'nin kolon bağlantı noktalarına bağlayın.Genel kromatografik parametreleri buna göre ayarlayın. FPLC yazılımında AIEX programını başlatın ve tampon A.Subsequenta için denge hacmini seçin, örneği sütuna yükleyin ve proteinleri %0 ile %100 arasında yüksek tuz tamponu ile eritin. Elution sırasında iki mililitre kesirler toplamak.Çalıştırmayı bitirdikten sonra eluted kesirleri analiz edin. Bunun için, coomassie lekeli 15% SDS sayfasına her fraksiyonun 10 mikrolitre yük ve S100A12 içeren kesirleri belirlemek. Tris-tamponlu tuzlu içine diyaliz için fraksiyonları içeren bu S100A12 havuzu.Protein arınmasını devam ettirebilmek için, protein diyalizinden sonra, numuneye 25 milimolar'lık son konsantrasyona kalsiyum klorür ekleyin, bu da s100A12'nin bir sonraki adımda resenin bağlanmasını kolaylaştıracaktır. Ardından, numuneyi 0,45 mikron lik bir dökme boyutuna sahip bir filtreden geçirin. HIC tamponlarını ve örneklerini dört santigrat dereceye kadar dengeleyin.Ardından, hic A ve B sütununa ve sütunu sisteme bağlayın ve parametreleri ayarlayın. Kolonu bir ila iki sütun luk tampon HIC A ile dengelemek ve numuneyi yüklemek ve uv sinyali ile yıkama sınırtanımaz numune bloğunu tekrar taban çizgisi seviyesine getirmek için yöntemi başlatın. Sonra tampon EDTA içeren bir kalsiyum şelatör ile elütion başlar.Elüsyon sırasında pik kesirler iki mililitre toplayın. Bir Coomassie lekeli 15% SDS sayfasında her fraksiyonun 10 mikrolitre analiz ettikten sonra saf S100A12 fraksiyonları tanımlar. Bu kesirleri birleştirin ve HBS'ye karşı diyalize gir.İlk olarak, 50 kilodalton santrifüj filtre ünitesiüzerine 15 mililitre numune yükleyin. Yaklaşık 10 dakika boyunca 10 santigrat derecede 3200 kez g santrifüj. Filtratlı akışı buz üzerinde yeni bir gemiye aktarın.Şimdi, filtre zarını durulamak ve filtre ucundaki konsantre çözeltinin seyreltilmesi için bir mililitre HBS kullanın. Santrifüj tekrar akış yoluyla mümkün olduğunca çok protein kurtarmak için. Çözeltiyi filtrelemek için, numune yüklemesini ve santrifüjunu gerektiği sıklıkta tekrarlayın.Daha sonra, akış içeren S100A12 konsantre, yaklaşık 30 dakika boyunca 3200 kez g, 10 derece santigrat üç kilodalton santrifüj filtre ve santrifüj içine yükleyin. Şimdi hacim, ilk yükleme hacminin 1/5'ine kadar 1/10'a düşürülür. Konsantre çözeltiyi yeni bir tüpe aktarın.Konsantrasyon adımını gerektiği sıklıkta tekrarlayın. Kimyasal çapraz bağlama dan sonra, el yazmasına göre, boyut dışlama kromatografisi gerçekleştirin. HBS'deki sütunu dengeleyin, örneği yükleyin ve çalışma sırasında bir ila iki mililitrelik en yüksek kesirleri toplayın.Bu kesirleri %4-20 degradeli SDS sayfasında analiz ettikten sonra, istenilen protein kompleksinin ana bantları ile havuz fraksiyonları. Daha sonra daha önce yapılan çözümleri konsantre. Monositleri insan buffy coats'dan yoğunluk gradyan santrifüjü ile izole etmek için, önce ayırma çözeltisini oda sıcaklığına dengeleyin.15 mililitre lik centrifuge tüpler, buffy ceket başına iki tüp içine 20 mililitre aktarın. HBSS ile insan buffy ceket kan seyreltmek 60 mililitre toplam hacmi ve katman 30 bu karışımın mililitre ayırma ortamının üstüne dikkatlice. Oda sıcaklığında 35 dakika 550 kez g santrifüj.Santrifüjün frenini kapatın. Santrifüjden sonra mononükleer periferik kan hücreleri ayırma ortamının hemen üstünde yer alır. Bir pipet ile, taze, 50 mililitrelik santrifüj tüp içine bu hücreleri aktarın.Tüpü HBSS ile 50 mililitreye ve santrifüjile 10 dakika boyunca 170 kez g olarak doldurun. Supernatant aspirate ve borulama ile HBSS küçük bir hacimde hücre pelet resuspend. Daha sonra tüpü 50 mililitreye kadar doldurun ve 290 kez g'de 10 dakika santrifüj edin.Supernatant'ı tekrar aspire edin. 10 dakika boyunca 170 kez g HBSS ve santrifüj 50 mililitre hücreleri yeniden askıya. Süpernatant aspire ve ayırma tampon bir mililitre küçük bir hacimde hücre pelet resuspend, hücreleri saymak ve mililitre başına yedi hücreye beş kez 10 konsantrasyoniçin tampon ekleyin.Mononükleer periferik kan hücrelerinden monosit izolasyonu için manyetik negatif hücre izolasyon kiti kullanın ve üreticinin protokolüne uyun. Monositleri saymak ve mililitre başına altı hücreye iki kez 10 konsantrasyonmonosit ortamda resuspend için otomatik bir hücre sayacı kullanın. Kültür monositler için, süspansiyon hücreleri için uygun bir hidrofobik gaz geçirilebilir film ile bir hücre kültürü çanak ortaya koymak.Sterilizasyon için plakaları UV ışığı altında yaklaşık 30 dakika yerleştirin. Hücre süspansiyonunun 15 ila 25 mililitresini bu kültür plakalarına aktarın ve bir gece boyunca 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le dinlenmelerine izin verin. AIEX kolonve sonraki kalsiyuma bağımlı HIC'de ön arıtma sonrasında yüksek saf protein elde edildi.Ek bir kontrol olarak, insan monositler LPS ile uyarılmış ve yabani tip protein üretti. Farklı iyonlara protein maruziyeti farklı S100A12 oligomerlerinin düzenlenmesiyle sonuçlanır. Artan çinko konsantrasyonları, %4-20 Coomassie lekeli SDS sayfasında ayrılması üzerine Tetramer ve hexamer'lara S100A12'nin düzenlenmesine neden olur.Çapraz bağlanmadan önce fazla iyon lar uygulandığında, oligomer dengesinin belirgin bir değişimine neden oldu. S100A12, 25 milimoler kalsiyum veya 25 milimoler kalsiyum ve bir milimolar çinko varlığında çapraz bağlıydı. HBS tamponunda 25 milimolar kalsiyum klorür ve bir milimolar çinko klorür ile çapraz bağlantı yapıldıktan sonra hexamer ve tetramer ayrıldı.Tetramer ve dimer HBS tamponunda 25 milimoler kalsiyum klorür ile ayrıldı. Coomassie lekeli bir Coomassie% dört ila 15 gradyan SDS sayfasında ayrıldıktan sonra havuzlu ve konsantre oligomerbir örnek dimer, tetramer ve hexamer gösterir. Hexameric S100A12 ile monosit stimülasyonu tnf alfa salınımı ile sonuçlandı.Endotoksin çıkarıldıktan sonra, sonraki nesil ve oligomerlerin saflaştırılması sırasında numunelere kontaminasyonu yeniden sokmamak önemlidir. S100A12 oligomerizasyonu ile ilgili herhangi bir sürecin downstream analizi düşünülebilir. Benzer şekilde, oliomerizasyon işlemini etkileyen amino asitler ve iyon koşulları analiz edilebilir.Şu anda, proteinin TLF4 üzerinden sinyalini engellemek ve tanısal tahlilleri geliştirmek ve geliştirmek için spesifik peptit ligandları ve antikorlar geliştirmek için tanımlanan protokole göre ayrılmış S100A12 oligomerleri kullanıyoruz.

purification-human-s100a12-its-ion-induced-oligomers-for-immune-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Post-insan genomik dönemde, yerli konformasyonlar rekombinant protein durumu, yapısal, işlevsel ve tedavi araştırma ve geliştirme için çok önemlidir. Burada, bir test-ve rekombinant proteinlerin çeşitli üretmek için kullanılan insan embriyonik böbrek hücreleri 293T büyük ölçekli proteini ifade sistemi açıklamaktadır.

İnsan Hücrelerden salgılanan Proteinlerin Üretimi için Kullanışlı ve Genel Anlatım Platformu

Bu videoda, bir Escherichia coli kültüründen alınan proteinin net yüzey yüküne dayalı olarak insan kalsiyum bağlayıcı protein S100A12 saflaştırmak için bir anyon değişim kromatografisi tekniği gösteriyoruz.

Anyon değişim kromatografisi bazlı protein saflaştırması: Net yüke dayalı olarak diyaliz edilmiş bakteri lizatından ilgilenilen bir proteini izole etmek için bir ayırma tekniği

Bu videoda, kalsiyuma bağımlı hidrofobik etkileşim kromatografisi yoluyla diyalize edilmiş bir hücre lizatından kalsiyum bağlayıcı proteinin saflaştırılmasını gösteriyoruz. Kalsiyum bağlayıcı proteinler, kalsiyum ile bağlandıktan sonra hidrofobik bir bölge açığa çıkarır ve reçine üzerindeki hidrofobik bir grupla etkileşimi kolaylaştırır. Daha sonra bu proteinler, etkileşimi tersine çeviren kalsiyum şelatör EDTA kullanılarak ayrıştırılır.

Kalsiyum Bağımlı Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi: Hidrofobik Etkileşimlere Dayalı Kalsiyum Bağlayıcı Proteinleri Saflaştırmak İçin Bir Teknik

Burada, S100A12'yi (calgranulin C) ifade etmek ve saflaştırmak için bir yöntem sunuyoruz. İnsan patojen H. pylori'ye karşı antimikrobiyal aktivitesini ölçmek için bir protokolü açıklıyoruz.

S100A12&#39;nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Doğuştan gelen bağışıklık MALT1 düzenleyen ama nasıl oluşur kötü tanımlanmış kalır. Biz doğuştan gelen sinyal MALT1 myeloid sitokinler, üretimini düzenler gösteren Toll benzeri veya C tipi lektin-benzeri reseptörler aşağı ve aşağı akım için MALT1 katkısını çözülmeye selektif MALT1 paracaspase inhibitörü MLT-827 kullanılan C tipi lektin benzeri reseptörlerinin seçerek.

Myeloid doğuştan gelen sinyal yolu düzenleme MALT1 Paracaspase etkinlik tarafından

Bu çalışmada, biz bir roman ve lenfositlerin izolasyonu için etkili iletişim kuralı Peyer's yamalar (PPs), daha sonra in vivo ve in vitro fonksiyonel deneyleri için hem de akış sitometrik çalışmalar foliküler t kullanılabilir sunmak yardımcı ve germinal Merkez B hücreleri.

Humoral bağışıklık çözülen anahtar oyuncular: gelişmiş ve lenfosit yalıtım antikorundan Peyer's yamalar iletişim kuralından en iyi duruma getirilmiş

Bu çalışmada, BALB/c farelerde, bu hastalıkta görülen cinsiyet farklılıkları da dahil olmak üzere ilaca bağlı otoimmün hepatitin patogenezini incelemek için kullanılabilecek bir in vivo immünizasyon, translasyonel hepatit modeli tanımlanmıştır. Bu modelin in vivo ve in vitro deneysel teknikler kullanarak tekrarlanabilir analizleri nasıl gösterdiğini açıklayacağız.

Patojenik Mekanizmalarının İncelenmesi için BALB/c Farelerde İlaca Bağlı, Otoimmün Hepatitin İndüklenmesi

Aşı geliştirmede kullanılmak üzere kendi kendine biraraya gelen protein nano taneciklerinin (SAPN' ler) saflaştırılmasını, yeniden katlanması ve karakterizasyonu nun tanımlanmasını açıklayan ayrıntılı bir yöntem burada verilmiştir.

Trimerik Epitop Sunumu Gerektiren Aşılar için E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nano tanecikleri Üretimi

Periferik kan mononükleer hücrelerinin Sézary Sendromu tanısı alan hastalardan elde edilen tam kandan izole edilmesi, ardından CD4 + T hücrelerinin seçimi, forbol12-miristat13-asetat ve A23187 iyonofor ile uyarılmaları ve transkriptomik profilleme için RNA'nın hazırlanması için basit bir protokol sunuyoruz.

Transkriptomik Profilleme için İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin ve CD4 + T hücrelerinin Sézary Sendromu Hastalarından İzole Edilmesi

Protokol, nanoemülsiyon ofiyopogonin D adjuvanının etkili hücresel immün yanıtları destekleyip desteklemediğini değerlendirmek için ayrıntılı yöntemler sunar.

İn Vitro Nanoemülsiyon Aşısı Adjuvan Ophiopogonin D'nin Hücresel Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Bir sialidaz tedavisi kullanılarak izole edilmiş periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) de-sialillenmiş insan monosit türevli dendritik hücreler (mo-DC'ler) oluşturmak için benzersiz, kapsamlı bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, mo-DC'lerin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonunu değerlendirmek ve sialidaz tedavisinin mo-DC'lerin olgunlaşma seviyesini nasıl iyileştirdiğini değerlendirmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Farklı Sialillenmiş Fenotiplere Sahip Monosit Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Üretimi

Keşfedin insan S100A12 proteininin iyon kaynaklı oligomerlerini saflaştırma yöntemini. Yüksek verimli ve endotoksin içermeyen protein elde ederek bağışıklık hücre stimülasyonu için fonksiyonel analizler yapabilirsiniz.

İnsan S100A12 ve Bağışıklık Hücre Stimülasyonu için Iyon kaynaklı Oligomerlerin Saflaştırılması

Daha fazla video keşfet