Name: İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Öğrenin, CRISPR-Cas9 ile insan pluripotent kök hücrelerinde heterozigot ve homozigot mutasyonların nasıl üretileceğini. Bu yöntem, gen fonksiyonu ve hastalık çalışmaları için izojenik hücre hatları oluşturmayı kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, U01HL099656 (P.G. ve D.L.F.) ve U01HL134696 (P.G. ve D.L.F.) hibeleri yoluyla Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI), Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden fon la desteklenmiştir.

1. Kılavuz RNA'nın (gRNA) tasarımı ve inşası
NOT: Her gRNA, 100 bp çift iplikçikli (ds) oligonükleotid(Şekil 1A-C)oluşturmak için annealed iki 60 baz çifti (bp) oligonükleotid oluşur. gRNA tasarımı, üretimi ve test kesme verimliliği için zaman çizelgesi yaklaşık 2 haftadır(Şekil 2).
<ol><li>Genom düzenlenecek DNA bölgesini seçin ve formata uygun 3-4 23 bp dizileri tanımlayın, 5'-G(N19)NGG-3'. Bu diziler ilgi alanının 20 bp içinde yer almalıdır. NOT: Hedefleme duyu veya anti-sense iplikçik üzerinde yapılabilir.</li>
	<li>CRISPOR (http://crispor.tefor.net) gibi bir kaynak kullanarak gRNA dizilerini genomik fazlalık ve hedef dışı olasılık açısından değerlendirin.</li>
	<li>Gösterildiği gibi iki 60-mer oligonükleotid içine 20 bp hedef dizisi (protospacer bitişik motif veya PAM hariç) dahil (dizileri 5'e 3' ve kırmızı ve yeşil şekil 1Cgösterildiği gibi ters tamamlar vardır).</li>
	<li>Sipariş iki 60 bp oligonükleotid satıcıdan tercih. Oligonükleotidler alındıktan sonra, ddH2O.'da 100 μM'lik son konsantrasyona kadar her birini yeniden askıya alın.</li>
	<li>Anneal iki oligonükleotid ve DNA polimeraz kullanarak 100 bp dsDNA parçası oluşturmak(Tablo Malzemeler). 5 μL 10 μM ileri oligonükleotid ve 5 μL 10 μM ters oligonükleotidbir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) şerit tüp ve inkübat 95 °C 5 dakika. Oda sıcaklığında 10 dakika için reaksiyon uçıkarın (RT).</li>
	<li>PCR'yi Tablo 1'deaçıklandığı şekilde ayarlayın. Tablo 2'debelirtilen parametreleri kullanarak bir termal çevrimcide PCR amplifikasyonu gerçekleştirin.</li>
	<li>PCR ürünlerini %1,5 (w/v) ethidium bromür (EtBr) agarose jelelektrofore edilip 40 dk. 100 bp bandı(Şekil 3A),led ışık kutusunda görselleştirilmiş, jilet kullanarak jelden arındırın ve jel kullanarak arındırın ekstraksiyon kiti (Malzeme Tablosu).</li>
</ol>2. Tarama için PCR astar tasarımı
<ol><li>Özel ilgi geninin 400-500 bp bölgesini yükseltmek için tasarlanmış ileri ve ters PCR astarları kullanarak düzenlenmiş DNA'nın taramasını gerçekleştirin(Tablo 2). Tarama PCR yaparken temiz bir amplicon onaylamak için herhangi bir kontrol iPSC hattından izole DNA kullanın.</li>
	<li>PCR ürünlerini 80-100 V'de 1 saat elektroforezi takip eden %1,5 (w/v) jel üzerinde görselleştirin. NOT: Düzenlenmiş klonların dizilişi, tarama astarı setinin onaylanmasından sonra tasarlanmış iç içe bir astar kullanılarak gerçekleştirilir. Örnekler sıralama için ticari bir kaynağa gönderilir.</li>
</ol>3. gRNA_klonlama vektör plazmidinin hazırlanması
<ol><li>Klonlama vektörünü doğrusallaştırmak için 1,5 mL santrifüj tüp alın ve gRNA_klonlama vektörünün 1-5 g g g g g g g g g g g g g gg'sini ilave edin ve 4 μL AflII restriksiyon enzimi tamponu ve 1,5 μL AflII restriksiyon enzimi ekleyin. DDH2O.'nun 24 μL'lik reaksiyonu yukarı ve aşağı borular ile karıştırın. Gece boyunca 37 °C'de (O/N) kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Elektroforse 1 h ve tüketim bantları için 80-100 V bir% agarose jel üzerinde (beklenen bant boyutu ~ 3519 bp).</li>
	<li>Ayıklayın ve adım 1.6 gibi arındırın.</li>
</ol>4. gRNA vektörünün montajı
<ol><li>Reaksiyonlar ayarlayın ve Montaj kiti kullanarak DNA parçaları monte(Tablo Malzemeler) AflII sindirilmiş gRNA klonlama vektör100 bp jel saflaştırılmış eklemek için 1:5 oranları, Tablo 3açıklandığı gibi .</li>
	<li>Reaksiyonu 50 °C'de 15 dk. DDH2O'da 1:3 oranında seyreltin ve üreticinin talimatlarına göre bakteri dönüşümü için 3 μL kullanın (Malzeme Tablosu). Kanamisin LB/agar plakalarında plaka hücreleri.</li>
	<li>GRNA başına 3-5 koloni seçin. Her koloniyi 4 mL LB'de aşılamak ve orbital sallayarak inkübatör de 37 °C'de O/N büyütün.</li>
	<li>Plazmid DNA'sını miniprep plazmid izolasyon kiti kullanarak arındırın ve başarılı klonlama sağlamak için aşağıdaki astarları kullanarak her gRNA'yı sıralayın: İleri: GTACAAAAAAGCAGGCTTAAAGG; Ters: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.</li>
</ol>5. Test gRNA kesme verimliliği
<ol><li>Daha önce açıklandığı gibi, 6 kuyulu bir plaka içinde ışınlanmış murine embriyonik fibroblastlar (MEFs) üzerinde Plaka hESCs21. Hücreler %70-80 birleşime ulaştığında, Tablo 4'teözetlenen transfeksiyon ana karışımını hazırlayın.</li>
	<li>15 dk. RT'de pipetleme ve kuluçka ile karıştırın.</li>
	<li>48 saat sonra sıralama için hasat hücreleri.<ol>
<li>3 dk RT kuluçka ile MEF'leri enzimatik olarak(Malzeme Tablosu)çıkarın.</li>
		<li>Hücreleri 1x hESC orta ile durular (Tablo 5) ve hESC orta + 10 μM Y-27632 dihidroklorür içine kazıyın (Malzeme Tablosu).</li>
		<li>3 dk için 300 x g pelet hücreleri ve hESC orta 0,5 mL resuspend + 10 μM Y-27632 dihidroklorür.</li>
		<li>35 μm'lik hücre süzgeci kapağından 5 mL'lik bir tüpe süzün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Floresan aktif hücre sıralama (FACS), canlı hücreler üzerinde kapı ve yeşil floresan protein (GFP) pozitif hücreleri sıralamak kullanarak.</li>
	<li>1:3 bazal membran matrisi(Malzeme Tablosu)ile kaplanmış ve HESC ortamda(Tablo 5)Y-27632 dihidroklorür içeren ışınlanmış MEF'lere doğrudan 10 cm2 tabak içine maksimum 1,5 x 104 sıralanmış hücre aktarın.</li>
	<li>Y-27632 dihidroklorür içermeyen hESC ortamını(Tablo 5)kullanarak günlük orta yıkın ve kolonilerin ~1 mm çapında olduğu 10-15 gün sonra klonları manuel olarak seçin.<ol>
<li>P200 pipet ve mikroskop kullanarak, tek bir klonu dikkatlice kazıyın ve hücreleri pipete çekin.</li>
		<li>Koloni ile birlikte hazırlanan ortamda 96 kuyu plakasında 3-4x'i yavaşça boruhaline vererek hücreleri dağıtın.</li>
		<li>Tarama için PCR şerit tüpleriçine dağıtın ve 5 dk. gRNA başına 20 koloni seçin 10.000 x g santrifüj ile hücreleri pelet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Klon taraması
<ol><li>Hücre peletlerini 20 μL proteinaz K tamponu(Tablo 5) (55 °C'de 1 saat ve 95 °C'de 10 dakika) ve girdap ta dinleyerek DNA'yı izole edin. 5 dk için 10.000 x g santrifüj ve supernatant toplamak.</li>
	<li>PcR (bölüm 2) taramasını, ilgi bölgesini ve proteinaz K sindiriminin 5°L'sini yükseltmek için tasarlanmış astarlar da dahil olmak üzere ana karışım içeren bir ana karışım kullanarak toplam 20 μL hacimde gerçekleştirin. Kontrol olarak düzenlenmiş olan hücre hattından izole edilmiş genomik DNA kullanın.</li>
	<li>70-90 V'de 1 saat elektroforezi takip eden PCR ürünlerinin boyut değişikliklerini %2,5 (w/v) agarose jel(Şekil 3B,C)üzerinde değerlendirin. Herhangi bir boyut farkı dekolte göstergesidir.</li>
</ol>7. Tek iplikçikli oligo DNA (ssODNs) kullanılarak pluripotent kök hücrelerde hassas genom düzenleme
<ol><li>Tasarım 100 bp ssODNs en verimli gRNA dizisi etrafında en iyi kesme verimliliğine sahip olduğu belirlenen merkezli.</li>
	<li>GRNA dizisinde sessiz mutasyonlar oluşturarak yeniden birleştirilmiş ODN'nin yeniden bölünmesini önleyin. PAM dizisinde tek bir sessiz mutasyon yeterlidir, ancak mümkün değilse 3-4 sessiz mutasyon işe yarayacaktır. NOT: Hedeflenen klonların taranmasını kolaylaştırmak için, gRNA dizisinin ~20 bp içinde bir kısıtlama alanının tanıtılması idealdir.</li>
	<li>Faiz mutasyonu ve baz değişimi(ler) olmadan bir ODN oluşturmak için istenilen baz değişimi(ler) ile bir ODN tasarlayın. NOT: Bu değişiklikler, tahmin edilen CRISPR/CAS9 kesme alanından ~20 bp'den fazla olmamalıdır, çünkü rekombinasyon daha uzak mesafelerde önemli ölçüde düşer.</li>
	<li>İki ssODN'yi satıcıdan sipariş edin ve 1 μg/μL hisse senedi yapmak için suda yeniden askıya alın. Stokları -20 °C'de saklayın.</li>
</ol>8. Transfection kurulumu
<ol><li>SsODN ve CRISPR-CAS9 plazmidlerini nakletmek için, hedef hücre hattını, O/N kuluçkadan sonra %70-80'lik bir araya gelmek için ışınlanmış MEF'ler üzerinde 6 kuyulu bir tabakta plakalayın.</li>
	<li>Tablo 6'daaçıklandığı gibi transfeksiyon reaksiyonu ayarlayın. REAKSIYONu pipetleme ile karıştırın ve 15 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatırın. Transfeksiyon reaksiyonu karışımını damla yla hücrelere ekleyin.</li>
	<li>48 saat sonra, bölüm 5.3'te açıklandığı gibi hücreleri hücre sıralamasıiçin hazırlayın.</li>
	<li>200 μL pipet kullanarak tek hücreleri kaplamaktan yaklaşık 10 gün sonra kolonileri seçin. 100 μL'lik hücreyi daha önce jelatin ve Radyasyonlu MEF'ler hESC ortamda Y-27632 dihidroklorür ile kaplanmış 24 veya 48 kuyu plakalı bir kuyuya aktarın. Bölüm 6'da açıklandığı gibi DNA izolasyonu için kalan 100 μL'yi kullanın.</li>
</ol>9. Tek kolonilerdeki mutasyonların kontrol edilmesi
<ol><li>ssODN'nin başarılı entegrasyonunu kontrol etmek için, bölüm 2'de tasarlanan tarama astarlarını kullanarak PCR'yi gerçekleştirmek için her koloniden izole edilmiş 5 μL DNA alın. PCR ürünlerini(Malzeme Tablosu)arındırın ve ssODN'de oluşturulan benzersiz enzim bölgesini kullanarak restriksiyon enzim sindirimini hazırlayın. NOT: Bu sindirim aynı zamanda restriksiyon enzimtamponve 40 μL bir hacimde restriksiyon enzimüreticinin önerilen konsantrasyon içerir.</li>
	<li>1-3 saat boyunca üreticinin tavsiye edilen sıcaklıkta pipetleme ve kuluçka ile reaksiyonu karıştırın.</li>
	<li>Sindirilmiş PCR ürünlerini %1,5 (w/v) EtBr agarose jel elektroforeli 80-100 V'da 40 dakika boyunca görselleştirin. SSODN'nin başarılı entegrasyonu gerçekleşmişse, iç içe olmuş bir astar kullanarak diziye özgü mutasyonlar meydana geldi.</li>
</ol>

<ol><li>Srivastava, D., Dewitt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+In+Vivo+Cellular+Reprogramming%3A+The+Next+Generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Review In Vivo Cellular Reprogramming: The Next Generation.</a> Cell. 166 (6), 1386-1396 (2016).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Review Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Embryonic+Stem+Cells+to+Relevant+Populations%3A+Lessons+from+Embryonic+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Embryonic Stem Cells to Relevant Populations: Lessons from Embryonic Development.</a> Cell. 132 (4), 661-680 (2008).</li>
<li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells%3A+from+2D+to+3D+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), 1-6 (2018).</li>
<li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (3), 170-182 (2016).</li>
<li>Tiyaboonchai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA6+Plays+an+Important+Role+in+the+Induction+of+Human+Definitive+Endoderm%2C+Development+of+the+Pancreas%2C+and+Functionality+of+Pancreatic+%CE%B2+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">GATA6 Plays an Important Role in the Induction of Human Definitive Endoderm, Development of the Pancreas, and Functionality of Pancreatic β Cells.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 589-604 (2017).</li>
<li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+hESCs+to+Probe+the+Interaction+of+the+Diabetes-Associated+Genes+CDKAL1+and+MT1E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Using hESCs to Probe the Interaction of the Diabetes-Associated Genes CDKAL1 and MT1E.</a> Cell Reports. 19 (8), 1512-1521 (2017).</li>
<li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Isogenic+Human+ESC+Platform+for+Functional+Evaluation+of+Genome-wide-Association-Study-Identified+Diabetes+Genes+and+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery.</a> Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+with+zinc+finger+nucleases+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Genome editing of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells with zinc finger nucleases for cellular imaging.</a> Circulation Research. 111, 1494-1503 (2012).</li>
<li>Xue, H., Wu, J., Li, S., Rao, M. S., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Modification+in+Human+Pluripotent+Stem+Cells+by+Homologous+Recombination+and+CRISPR%2FCas9+System%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic Modification in Human Pluripotent Stem Cells by Homologous Recombination and CRISPR/Cas9 System.</a> Methods in Molecular Biology. 1307, 173-190 (2014).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+gene-corrected+adult+beta+globin+protein+in+human+erythrocytes+differentiated+from+patient+iPSCs+after+genome+editing+of+the+sickle+point+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Production of gene-corrected adult beta globin protein in human erythrocytes differentiated from patient iPSCs after genome editing of the sickle point mutation.</a> Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+detection+of+off-target+cleavage+by+CRISPR-Cas9+and+TALENs+using+integrase-defective+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Unbiased detection of off-target cleavage by CRISPR-Cas9 and TALENs using integrase-defective lentiviral vectors.</a> Nature Biotechnology. 33 (2), 175-178 (2015).</li>
<li>Sim, X., Cardenas-Diaz, F. L., French, D. L., Gadue, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Doxycycline-Inducible+System+for+Genetic+Correction+of+iPSC+Disease+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Doxycycline-Inducible System for Genetic Correction of iPSC Disease Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1353, 13-23 (2015).</li>
<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Review Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).</li>
<li>Byrne, S. M., Mali, P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in human stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 119-138 (2014).</li>
<li>Zhu, Z., González, F., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iCRISPR+platform+for+rapid+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Methods in Enzymology. 546, 215-250 (2014).</li>
<li>Hou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genome+engineering+in+human+pluripotent+stem+cells+using+Cas9+from+Neisseria+meningitidis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient genome engineering in human pluripotent stem cells using Cas9 from Neisseria meningitidis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15644-15649 (2013).</li>
<li>Cong, L., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using CRISPR-Cas9 system.</a> Methods in Molecular Biology. 1239, Clifton, N.J. 197-217 (2015).</li>
<li>Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+as+a+versatile+tool+for+engineering+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cas9 as a versatile tool for engineering biology.</a> Nature Methods. 10 (10), 957-963 (2013).</li>
<li>Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+homology+directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing homology directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).</li>
<li>Maguire, J. A., Cardenas-Diaz, F. L., Gadue, P., French, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+crispr+cas9-mediated+genome+editing+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Highly efficient crispr cas9-mediated genome editing in human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 64(2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokolde, CRISPR-CAS9'un iki ssODN onarım şablonu ile birlikte belirli heterozigot veya homozigot genom değişiklikleri oluşturmak için kullanılması insan pluripotent kök hücrelerinde gösterilmiştir. Bu yöntem, heterozigot genomik değişiklikleri %10'a yakın bir verimlilikle ifade eden izojenik hücre hatlarının başarılı bir şekilde üretilmesiyle sonuçlandı. Bu protokol, hücre ayrıştırma sonrası düşük yoğunlukta hücre kültürlerinden sonra hücre büyümesini ve sağkalımlarını destekleyen ışınlanmış MEF'lerde yetiştirilen ...

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESCs) ve indüklenen pluripotent kök hücreler (iPSCs) insan hastalığı yenileme kapasiteleri nedeniyle modelleme için değerli araçlar, farklı soy hücre tipleri oluşturmak için yeteneğini korurken1,2 ,3,4. Bu modeller gen fonksiyonunu sorgulama imkanını açar ve spesifik mutasyonların ve fenotiplerin çeşitli hastalıklarla nasıl ilişkili olduğunuanlarlar 5,6. Ancak, belirli bir değişiklik belirli bir fenotip bağlı nasıl anlamak için, eşleştirilmiş bir iyojenik kontrol ve mutant hücre hatları nın kullanımı çizgi değişkenlik7için kontrol etmek önemlidir7 ,8. Transkripsiyon aktivatör benzeri efektör nükleazlar (TALENs) ve çinko parmak nükleazları, birincil hücreler de dahil olmak üzere çeşitli genetik modellerde ekleme veya silme (indels) mutasyonları oluşturmak için kullanılmıştır; ama bu nükleazlar kullanmak için hantal olabilir ve pahalı9,10,11,12,13,14. Kümelenmiş düzenli olarak uzaylanmış kısa palindromik tekrarın (CRISPR)-CAS9 nükleazının keşfi, genomun hemen hemen her bölgesinde indel oluşumundaki verimlilik, kullanım kolaylığı ve maliyet15'teki azalma nedeniyle sahada devrim yarattı15 , 16.02.20 , 17.000 , 18.000 , 19. yıl.
CRISPR-CAS9 tabanlı genom düzenleme teknolojisini kullanmanın zorluğu, ikinci alel20'deindel mutasyonu yaratmadan bir aleldeki spesifik mutasyonların oluşturulması veya düzeltilmesi olmuştur. Bu protokolün temel amacı, ikinci alelinin indel oluşumunu azaltmak için iki tek iplikli oligonükleotit (ssODN) onarım şablonu kullanarak bu zorluğun üstesinden gelmektir. Her iki ssODN'ler, CAS9 nükleazının yeniden kesilmesini önlemek için sessiz mutasyonlar içerecek şekilde tasarlanmıştır, ancak sadece bir tanesi ilgi nin değişimini içerir. Bu yöntem, ikinci alelinin indel oluşumunu indüklemeden belirli bir heterozigot genetik modifikasyon oluşturma nın verimliliğini artırır. Bu protokolü kullanarak, altı bağımsız genomik lokasyonda yapılan gen düzenleme deneyleri, ikinci alelde indel oluşumu olmadan bir alelde istenilen genomik değişimin kesin olarak ortaya çıkarılabilmeyi ve ~%10 genel verimlilikle meydana geldiğini göstermektedir. Açıklanan protokol Maguire ve ark.21uyarlanmıştır.

<table><tbody><tr><td>Hücre süzgeç kapaklı 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı tüp</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu polistiren doku kültürü kapları</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>AflII kısıtlama endonükleaz</td><td>New England Biolabs</td><td>R0520</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>VWR</td><td>N605</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 orta boy</td><td>ThermoFisher</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>dNTP'ler</td><td>Roche</td><td>11969064001</td><td></td></tr><tr><td>Floresanla aktive edilen hücre sıralayıcı (FACS) aparatı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jel ekstraksiyon kiti</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Montaj Kiti</td><td>New England Biolabs</td><td>E2611</td><td></td></tr><tr><td>gRNA_Cloning Vector</td><td>Addgene</td><td>41824</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu içeren LB agar plakaları; g/ml kanamisin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin Kök Reaktifi</td><td>ThermoFisher</td><td>(STEM00001)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Murin embriyonik fibroblastlar (MEF'ler)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Jel Ekstraksiyonu ve PCR Temizleme Kiti</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Orbital çalkalama inkübatörü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCas9_GFP vektör</td><td>Addgene</td><td>44719</td><td></td></tr><tr><td>PCR şerit tüpleri</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High Fidelity DNA Polimeraz ve 5 kez; Görüş tamponu</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>PurelinkTM Hızlı Plazmid Miniprep Kiti</td><td>İnvitrojen</td><td>K210011</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Qiagen Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>StellarTM elektroyetkin Escherichia coli hücreleri</td><td>Takara</td><td>636763</td><td></td></tr><tr><td>SOC ortamı</td><td>New England Biolabs</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Ekspres Enzim</td><td>ThermoFisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihidroklorür/ROCK inhibitörü (ROCKi)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan pluripotent kök hücrelerinde crispr-cas9 kullanılarak tanımlanmış genomik modifikasyonların Üretimi

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

İnsan pluripotent kök hücreleri gen fonksiyonunu incelemek ve hastalığa özgü mutasyonları modellemek için güçlü bir sistem sunar. İkinci alelde CRISPR-CAS9 aracılı indel oluşumu nedeniyle hassas heterozigot genetik modifikasyonların oluşturulması zordur. Burada, her iki şablon da yeniden kesme ve indel oluşumunu önlemek için sessiz mutasyonlar içerirken, yalnızca bir tanesinin istenen sıra değişikliğini ifade ettiği iki onarım şablonu kullanarak bu zorluğun üstesinden gelinmesine yardımcı olacak bir protokol gösteriyoruz. Bu metodoloji, insan hastalığı ve biyoloji sinaması için isojenik kontrol ve mutant insan kök hücre hatları oluşturmak için DNA'nın gen düzenleme kodlama bölgeleri için en avantajlı yöntemdir. Buna ek olarak, transfeksiyon ve tarama metodolojilerinin optimizasyonu, gen düzenleme deneyinin işçiliğini ve maliyetini azaltmak için gerçekleştirilmiştir. Genel olarak, bu protokol yaygın insan pluripotent kök hücre modeli kullanan birçok genom düzenleme projeleri için geçerlidir.

GRNA'ların üretimi ve indels için tarama
Her gRNA bir plazmid vektör içine klonlanmış olacak ve U6 organizatörü kullanılarak ifade edilecektir. AflII restriksiyon enzimi plazmidi doğrusallaştırmak için kullanılır (addgene #41824) ve U6 organizatöründen sonra bulunur. İki 60 bp oligonun karıştırıldıktan sonra oluşturulan 100 bp bandı, DNA montajı kullanılarak gRNA ekspresyon vektörüne klonlanır. GRNA plazmidleri oluşturulduktan sonra CRISPS-CAS9 GFP plazmidi (addgene #...

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinde CRISPR-CAS9 kullanılarak tanımlanmış heterozigot veya homozigot nükleotid değişikliklerinin oluşumunu kolaylaştıracak bir yöntem sağlar.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Gen fonksiyonu ve hastalık çalışmaları insan nüfusunun dışlanmış doğası tarafından engellenir. Hastaya özgü ve kontrol iPS hücre hatlarının farklı genetik arka planlar farklılaşma verimliliği ve belirli bir fonksiyonel tetkik bulunan fenotipler etkileyebilir. Tek farkın ilginin belirli mutasyonu olduğu genetik olarak özdeş veya iyojenik çizgilerin kullanımı bu sorunların üstesinden gelmek için önemlidir.Birçok insan hastalığı, CRISPR-Cas9 sistemi ile üretilmesi zor olan heterozigot mutasyonlardan kaynaklanır. Bunun nedeni, çok yüksek frekansta meydana gelebilen hedefsiz alellerdeki indel mutasyonlarının oluşmasıdır. Tekniğimiz, sadece bir tanesinin ilgi çekici mutasyonu barındıran iki onarım şablonu kullanarak bu sorunun üstesinden gelebilmektedir.Bu tekniği deneyen herhangi bir araştırmacı insan pluripotent kök hücre kültüründe yetenekli olmalıdır. Koloni toplama video gösteri doğru boyut ve morfoloji yanı sıra toplama ve tarama için kullanılan tekniği göstermek için yararlı olacaktır. Bu prosedürü gösteren Leo Cardenas olacaktır.Başlamak için, 6 kuyulu bir plaka içinde ışınlanmış MEFs üzerinde plaka insan ESCs. Transfection master karışımını hazırlayın. Pipetleme ile karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.Hücreler % 70-80 biraraya ulaştığında, daha sonra, transfection master karışımı damla hücreleri ile her kuyuya akıllıca damla ekleyin ve 48 saat boyunca 37 santigrat derece kuluçka. Her 24 saatte bir medyayı değiştirin. Hücreleri hasat etmek için, ilk olarak, enzimatik MEFs kaldırmak için oda sıcaklığında üç dakika boyunca Triple E ile hücreleri kuluçka.10 mikromolar ROCK inhibitörü ile HESC orta 0,5 mililitre ekleyin. Pelet hücreleri 300 kez g üç dakika ve 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile insan ESC orta 0,5 mililitre yeniden askıya. Hücre süspansiyonuna 35 mikronluk bir süzgeç kapağından beş mililitrelik bir tüpe süzün.Floresan aktive hücre sıralama kullanarak, canlı hücrelerüzerinde kapı ve yeşil floresan protein-pozitif hücreleri sıralamak. Daha sonra, 1-3 bazal membran matris ve ışınlanmış MEFs ve insan ESC orta ROCK inhibitörü içeren ile kaplanmış 10 santimetre lik bir çanak doğrudan dört sıralanmış hücrelere 1,5 kez 10 maksimum aktarın. ROCK inhibitörü olmadan insan ESC ortamını kullanarak her gün ortayı değiştirin.10-15 gün sonra kolonilerin çapı yaklaşık 1-2 milimetredir. Mikroskop altında, tek bir klonu dikkatlice kazımak ve hücreleri pipetin içine çekmek için P200 pipetkullanın. Hücreleri 96 kuyuluk bir kuyuda, koloniyle birlikte hazırlanan ortamda 3-4 kez hafifçe borulandırarak dağıtın.Sonra, her kılavuz RNA için 20 koloni seçin ve tarama için PCR şerit tüpleri içine dağıtmak. Beş dakika boyunca 10,000 kez G'de santrifüj ile hücreleri pelet. Şimdi, 20 mikrolitre proteinaz K tamponundaki hücre peletlerini kuluçkaya yatırArak DNA ve girdapları şiddetle izole edin.Santrifüj 10,000 kez G beş dakika. Daha sonra, düzenlenmiş DNA'nın PCR taramasını gerçekleştirin. Tüpler içine 20 mikrolitre ana karışımı ekleyin, ileri ve ters astarlar da dahil olmak üzere, ilgi bölgesini yükseltmek için tasarlanmış, yanı sıra Proteinase K sindirimi beş mikrolitre.Tarama PCR yaparken temiz bir amplicon onaylamak için kontrol iPSC hattından izole genomik DNA kullanın. PCR ürünlerinin bir saatlik elektroforezini 70-90 volt tan sonra hacim agarose jeli ile %2,5 ağırlıkta değerlendirin. Herhangi bir boyut farkı dekolte göstergesidir.Tek iplikçik oligo DNA'sını ve CRISPR-Cas9 plazmidlerini nakletmek için, hedef hücre hattını, bir gecede kuluçkadan sonra %70 ila %80'lik bir araya gelmek için ışınlanmış MEF'ler üzerinde 6 kuyulu bir tabakta plakalayın. Transfeksiyon reaksiyonu açıklandığı gibi ayarlayın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca pipetleme ve kuluçka ile reaksiyonu karıştırın.Sonra, hücrelere akıllıca transfection reaksiyon karışımı damla ekleyin. 48 saat sonra, hücreleri daha önce olduğu gibi hücre sıralamaiçin hazırlayın. Tek hücreleri kaplamaktan yaklaşık 10 gün sonra, 200 mikrolitrelik pipet kullanarak PCR şerit tüplere kolonileri ve jelatin ve MEF'lerle önceden kaplanmış 12 kuyulu bir plaka kuyusunun içine yerleştirin.Daha önce jelatin ve ıŞıNlanmış MEF'ler ile daha önce kaplanmış 24 veya 48 kuyulu bir plakanın her kuyuya 100 mikrolitre hücre aktarımı. DNA izolasyonu için kalan 100 mikrolitreyi kullanın. Tek iplikçikli oligo DNA'sının başarılı entegrasyonunu kontrol etmek için, her koloniden izole edilmiş beş mikrolitre DNA alın ve daha önce tasarlanmış tarama astarlarını kullanarak PCR'yi gerçekleştirin.PCR ürünlerini arındırın ve tek iplikçikli oligo DNA'sında oluşturulan benzersiz enzim bölgesini kullanarak 40 mikrolitre kısıtlama enzimi sindirimi hazırlayın. Bir ila üç saat boyunca üreticinin tavsiye edilen sıcaklıkta pipetleme ve kuluçka ile reaksiyonkarıştırın. Daha sonra, hacim ethidium bromür agarose jel, elektrofore 80-100 volt 40 dakika ile% 1.5 ağırlık bir yükleme boya sıyrık ile eklenen sindirilmiş PCR ürünleri görselleştirin.Tek iplikçikli oligo DNA'sının başarılı entegrasyonu gerçekleşmişse, iç içe olmuş bir astar kullanarak diziye özgü mutasyonlar meydana gelir. Bu çalışmada, kılavuz RNA yapımı için 100 baz çifti bandı %1.5 agarose jelden çıkarıldı. Hücre transfeksiyonu sonrasında kılavuz RNA kesiminin doğrulaması %2.5 agarose jel kullanılarak görselleştirildi.180 baz çifti PCR ürünü, kesilmemiş bir kontrol ve bant kaymaları ile indel oluşumunu gösteren farklı klonlar gösterdi. Farklı kılavuz RNA'ların farklı kesme verimleri vardı. CRISPR-Cas9'un düzenlenmiş alellerin yeniden kesilmesini önlemek için PAM dizisi G'den A'ya sessiz mutasyon kullanılarak değiştirildi.PAM dizisindeki sessiz bir mutasyon, bir veya iki alelile başarılı bir entegrasyon için tarama ya da yardımcı benzersiz bir kısıtlama sitesi oluşturdu. Genomda düzenlenmiş kök hücre hatları, belirli bir mutasyonun insan gelişimi ve hastalığı üzerindeki etkisini incelemek için aşağı akım farklılaştırmalarında ve fonksiyonel tahlillerde kullanılabilir. Bu metodoloji, insan hastalıklarının geniş bir yelpazede karıştığı belirli bir heterozigot veya homozigot mutasyonlar ile izojenik hücre hatlarının oluşumunu sağlar.Bu hastalık modelleri yeni hücresel tedavilerin geliştirilmesinin yanı sıra ilaç keşfi için platformlar da sunmaktadır.

generation-defined-genomic-modifications-using-crispr-cas9-human

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu video, insan pluripotent kök hücrelerinde (hPSC'ler) çinko parmak nükleaz tabanlı genom düzenleme tekniğini göstermektedir. hPSC'ler potansiyel olarak çeşitli hücre tiplerine ayrılabildiğinden, bu teknoloji hastaya özgü bir şekilde in vitro patolojik ve farmakolojik çalışmalar için yararlıdır.

Çinko Parmak Nükleaz Tabanlı Genom Düzenleme: İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde Çift Sarmallı Homoloji Bağımlı Onarım Mekanizması ile Genomu Değiştirme Tekniği

CRISPR (Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar) / Cas (CRISPR ile ilişkili) sistemi gibi genom düzenleme araçları, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde (hiPSC'ler) gen hedefleme verimliliğini büyük ölçüde geliştirmiştir. Bu el yazması, CRISPR/Cas sistemi destekli homolog rekombinasyon kullanılarak soya özgü hiPSC raportörü oluşturmak için bir protokolü açıklamaktadır.

HiPSC Sinir Lineage Özgül Knockin Muhabirleri Verimli Nesil kullanma CRISPR / Cas9 ve Cas9 Çift Nickase Sistemi

İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) genom düzenlemesi hızlı ve verimli bir şekilde yapılabilir. Burada, EGFP'yi eksprese etmek ve antibiyotik direncini ortaya çıkarmak için AAVS1 güvenli liman lokusunun düzenlenmesiyle örneklendiği gibi, hPSC'leri genetik olarak tasarlamak için sağlam bir deneysel prosedür sunulmaktadır.

Genom düzenlenmiş İnsan Pluripotent Kök Hücre Hatları oluşturulması: İzolasyon hedefleyen Gönderen

Protokoller iCRISPR platformu kullanılarak hPSC mutan çizgileri oluşturmak için ve tarif edilen glukoz duyarlı β-benzeri hücrelere hPSCs ayırt etmek. hPSC yönettiği farklılaşma ile genom düzenleme teknolojisini birleştirerek insan gelişimi ve hastalık seyrinde soy belirleyicilerinin rolü sistematik analizi için güçlü bir platform sunmaktadır.

İnsan Pankreas Geliştirme Lineage Belirleyicileri sorgulanması için Genom Düzenleme ve hPSCs arasında Yönetmen Farklılaşma

Bu iletişim kuralı koşullarda besleyici içermeyen insan pankreas hücreleri ayak izi-Alerjik İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) nesil ayrıntılı olarak anlatılmaktadır kullanarak CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins ve değiştirilmiş karakterizasyonu düzenleyerek takip tek hücre klonlar.

Verimli üretimi ve besleyici-Alerjik IPSCs CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak insan pankreas hücreleri düzenleme

Bir iletişim kuralı için hızlı fare CRISPR/Cas9-aracılı gene bozulma ve insan birincil hematopoetik hücreler bu makalede açıklanan. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins elektroporasyon ile vitro transkripsiyon ve ticari Cas9 ile oluşturulan sgRNAs ile tanıtılmaktadır. Yüksek Düzenleme verimliliği sınırlı zaman ve maliyet ile elde edilir.

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Burada açıklanan endogenously etiketleme için bir protokol proteinler insan indüklenmiş pluripotent kök hücreler CRISPR/Cas9 kullanarak floresan etiketleri ile ifade olmasıdır. Putatively düzenlenen hücreleri hücre aktif floresans sıralayarak zenginleştirilmiş ve klonal hücre satırları oluşturulur.

Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

CRISPR-Cas bitki ve hayvan karmaşık genleri Mühendisi için güçlü bir teknolojidir. Burada, verimli bir şekilde farklı Cas endonucleases kullanarak insan genomu düzenlemek için bir iletişim kuralı ayrıntılı. Biz ilgili önemli noktalar ve Düzenleme verimliliği optimize etmek için tasarım parametreleri vurgulayın.

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

Burada, piggyBac bazlı bir donör plazmid ve Cas9 nickaz mutantı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinde dikişsiz gen düzenleme için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunun ekzon 8'ine iki nokta mutasyonu getirildi.

Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

Sunulan yöntem, yüksek verimli bir lentiviral aracılı gen dağıtım sistemi kullanarak L2HGDH genini hedefleyen sgRNA'ları kararlı bir şekilde ifade eden insan embriyonik kök hücre (hESC) hattı H9'da CRISPR aracılı bir gen nakavtının oluşturulmasını açıklar.

Besleyicisiz Koşullar Altında Kültürlenen İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Delesyonuna

Protokol, plazmid DNA transfeksiyonu ve mRNA nükleofeksiyonu kullanılarak insan hücre hatlarında Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR) tabanlı epigenom düzenleme yöntemlerini açıklar.

Plazmid DNA Transfeksiyonu ve mRNA Nükleofeksiyon Dağıtımı Kullanılarak İnsan Hücrelerinde CRISPR Epigenom Düzenleme

Öğrenin, CRISPR-Cas9 ile insan pluripotent kök hücrelerinde heterozigot ve homozigot mutasyonların nasıl üretileceğini. Bu yöntem, gen fonksiyonu ve hastalık çalışmaları için izojenik hücre hatları oluşturmayı kolaylaştırır.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Daha fazla video keşfet