İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi
25 Eylül 2019
Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinde CRISPR-CAS9 kullanılarak tanımlanmış heterozigot veya homozigot nükleotid değişikliklerinin oluşumunu kolaylaştıracak bir yöntem sağlar.
Gen fonksiyonu ve hastalık çalışmaları insan nüfusunun dışlanmış doğası tarafından engellenir. Hastaya özgü ve kontrol iPS hücre hatlarının farklı genetik arka planlar farklılaşma verimliliği ve belirli bir fonksiyonel tetkik bulunan fenotipler etkileyebilir. Tek farkın ilginin belirli mutasyonu olduğu genetik olarak özdeş veya iyojenik çizgilerin kullanımı bu sorunların üstesinden gelmek için önemlidir.
Birçok insan hastalığı, CRISPR-Cas9 sistemi ile üretilmesi zor olan heterozigot mutasyonlardan kaynaklanır. Bunun nedeni, çok yüksek frekansta meydana gelebilen hedefsiz alellerdeki indel mutasyonlarının oluşmasıdır. Tekniğimiz, sadece bir tanesinin ilgi çekici mutasyonu barındıran iki onarım şablonu kullanarak bu sorunun üstesinden gelebilmektedir.
Bu tekniği deneyen herhangi bir araştırmacı insan pluripotent kök hücre kültüründe yetenekli olmalıdır. Koloni toplama video gösteri doğru boyut ve morfoloji yanı sıra toplama ve tarama için kullanılan tekniği göstermek için yararlı olacaktır. Bu prosedürü gösteren Leo Cardenas olacaktır.
Başlamak için, 6 kuyulu bir plaka içinde ışınlanmış MEFs üzerinde plaka insan ESCs. Transfection master karışımını hazırlayın. Pipetleme ile karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Hücreler % 70-80 biraraya ulaştığında, daha sonra, transfection master karışımı damla hücreleri ile her kuyuya akıllıca damla ekleyin ve 48 saat boyunca 37 santigrat derece kuluçka. Her 24 saatte bir medyayı değiştirin. Hücreleri hasat etmek için, ilk olarak, enzimatik MEFs kaldırmak için oda sıcaklığında üç dakika boyunca Triple E ile hücreleri kuluçka.
10 mikromolar ROCK inhibitörü ile HESC orta 0,5 mililitre ekleyin. Pelet hücreleri 300 kez g üç dakika ve 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile insan ESC orta 0,5 mililitre yeniden askıya. Hücre süspansiyonuna 35 mikronluk bir süzgeç kapağından beş mililitrelik bir tüpe süzün.
Floresan aktive hücre sıralama kullanarak, canlı hücrelerüzerinde kapı ve yeşil floresan protein-pozitif hücreleri sıralamak. Daha sonra, 1-3 bazal membran matris ve ışınlanmış MEFs ve insan ESC orta ROCK inhibitörü içeren ile kaplanmış 10 santimetre lik bir çanak doğrudan dört sıralanmış hücrelere 1,5 kez 10 maksimum aktarın. ROCK inhibitörü olmadan insan ESC ortamını kullanarak her gün ortayı değiştirin.
10-15 gün sonra kolonilerin çapı yaklaşık 1-2 milimetredir. Mikroskop altında, tek bir klonu dikkatlice kazımak ve hücreleri pipetin içine çekmek için P200 pipetkullanın. Hücreleri 96 kuyuluk bir kuyuda, koloniyle birlikte hazırlanan ortamda 3-4 kez hafifçe borulandırarak dağıtın.
Sonra, her kılavuz RNA için 20 koloni seçin ve tarama için PCR şerit tüpleri içine dağıtmak. Beş dakika boyunca 10,000 kez G'de santrifüj ile hücreleri pelet. Şimdi, 20 mikrolitre proteinaz K tamponundaki hücre peletlerini kuluçkaya yatırArak DNA ve girdapları şiddetle izole edin.
Santrifüj 10,000 kez G beş dakika. Daha sonra, düzenlenmiş DNA'nın PCR taramasını gerçekleştirin. Tüpler içine 20 mikrolitre ana karışımı ekleyin, ileri ve ters astarlar da dahil olmak üzere, ilgi bölgesini yükseltmek için tasarlanmış, yanı sıra Proteinase K sindirimi beş mikrolitre.
Tarama PCR yaparken temiz bir amplicon onaylamak için kontrol iPSC hattından izole genomik DNA kullanın. PCR ürünlerinin bir saatlik elektroforezini 70-90 volt tan sonra hacim agarose jeli ile %2,5 ağırlıkta değerlendirin. Herhangi bir boyut farkı dekolte göstergesidir.
Tek iplikçik oligo DNA'sını ve CRISPR-Cas9 plazmidlerini nakletmek için, hedef hücre hattını, bir gecede kuluçkadan sonra %70 ila %80'lik bir araya gelmek için ışınlanmış MEF'ler üzerinde 6 kuyulu bir tabakta plakalayın. Transfeksiyon reaksiyonu açıklandığı gibi ayarlayın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca pipetleme ve kuluçka ile reaksiyonu karıştırın.
Sonra, hücrelere akıllıca transfection reaksiyon karışımı damla ekleyin. 48 saat sonra, hücreleri daha önce olduğu gibi hücre sıralamaiçin hazırlayın. Tek hücreleri kaplamaktan yaklaşık 10 gün sonra, 200 mikrolitrelik pipet kullanarak PCR şerit tüplere kolonileri ve jelatin ve MEF'lerle önceden kaplanmış 12 kuyulu bir plaka kuyusunun içine yerleştirin.
Daha önce jelatin ve ıŞıNlanmış MEF'ler ile daha önce kaplanmış 24 veya 48 kuyulu bir plakanın her kuyuya 100 mikrolitre hücre aktarımı. DNA izolasyonu için kalan 100 mikrolitreyi kullanın. Tek iplikçikli oligo DNA'sının başarılı entegrasyonunu kontrol etmek için, her koloniden izole edilmiş beş mikrolitre DNA alın ve daha önce tasarlanmış tarama astarlarını kullanarak PCR'yi gerçekleştirin.
PCR ürünlerini arındırın ve tek iplikçikli oligo DNA'sında oluşturulan benzersiz enzim bölgesini kullanarak 40 mikrolitre kısıtlama enzimi sindirimi hazırlayın. Bir ila üç saat boyunca üreticinin tavsiye edilen sıcaklıkta pipetleme ve kuluçka ile reaksiyonkarıştırın. Daha sonra, hacim ethidium bromür agarose jel, elektrofore 80-100 volt 40 dakika ile% 1.5 ağırlık bir yükleme boya sıyrık ile eklenen sindirilmiş PCR ürünleri görselleştirin.
Tek iplikçikli oligo DNA'sının başarılı entegrasyonu gerçekleşmişse, iç içe olmuş bir astar kullanarak diziye özgü mutasyonlar meydana gelir. Bu çalışmada, kılavuz RNA yapımı için 100 baz çifti bandı %1.5 agarose jelden çıkarıldı. Hücre transfeksiyonu sonrasında kılavuz RNA kesiminin doğrulaması %2.5 agarose jel kullanılarak görselleştirildi.
180 baz çifti PCR ürünü, kesilmemiş bir kontrol ve bant kaymaları ile indel oluşumunu gösteren farklı klonlar gösterdi. Farklı kılavuz RNA'ların farklı kesme verimleri vardı. CRISPR-Cas9'un düzenlenmiş alellerin yeniden kesilmesini önlemek için PAM dizisi G'den A'ya sessiz mutasyon kullanılarak değiştirildi.
PAM dizisindeki sessiz bir mutasyon, bir veya iki alelile başarılı bir entegrasyon için tarama ya da yardımcı benzersiz bir kısıtlama sitesi oluşturdu. Genomda düzenlenmiş kök hücre hatları, belirli bir mutasyonun insan gelişimi ve hastalığı üzerindeki etkisini incelemek için aşağı akım farklılaştırmalarında ve fonksiyonel tahlillerde kullanılabilir. Bu metodoloji, insan hastalıklarının geniş bir yelpazede karıştığı belirli bir heterozigot veya homozigot mutasyonlar ile izojenik hücre hatlarının oluşumunu sağlar.
Bu hastalık modelleri yeni hücresel tedavilerin geliştirilmesinin yanı sıra ilaç keşfi için platformlar da sunmaktadır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinde CRISPR-CAS9 kullanarak tanımlanmış heterozigot veya homozigot nükleotid değişikliklerin oluşturulmasını kolaylaştıran bir yöntem sunar. Bu teknik, özel mutasyonlarla genetik olarak özdeş hatların oluşturulmasındaki zorlukları ele alır ve gen işlevi ve hastalık çalışmaları için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Genetik
- Kök Hücre Biyolojisi
- CRISPR Teknolojisi
Arka Plan
- İnsan popülasyonunun çiftler arası doğası, gen işlevi çalışmalarını karmaşıklaştırır.
- iPS hücre hatlarının genetik arka planları farklılaşma ve fenotiplere etki edebilir.
- İzojenik hatlar, doğru işlevsel değerlendirmeler için şarttır.
- Heterozigot mutasyonlar insan hastalıklarında yaygındır.
Çalışmanın Amacı
- Tanımlanmış nükleotid değişiklikleri oluşturmak için bir yöntem geliştirmek.
- Belirli mutasyonlarla genetik olarak özdeş hatlar yaratmak.
- Heterozigot mutasyonlar üretmede CRISPR-Cas9'un verimliliğini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- CRISPR-Cas9 teknolojisinin kullanımı.
- İlgili mutasyonlu bir tamir şablonunun kullanımı.
- İzojenik insan pluripotent kök hücre hatlarının oluşturulması.
- Farklılaşma verimliliğini değerlendirmek için işlevsel değerlendirmeler.
Ana Sonuçlar
- Tanımlanmış heterozigot ve homozigot değişikliklerin başarılı bir şekilde oluşturulması.
- Hedeflenmeyen allellerdeki indel mutasyonlarının azaltılması.
- İzojenik hatlarda farklılaşma verimliliğinin artırılması.
- Yöntemin işlevsel değerlendirmelerle doğrulanması.
Sonuçlar
- Protokol, kök hücrelerde gen düzenleme için güvenilir bir yaklaşım sağlar.
- Genetik hastalıkları incelemede önemli zorlukları ele alır.
- Bu yöntem, gen işlevini anlamamızı artırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Generating isogenic human pluripotent stem cell lines with defined heterozygous or homozygous mutations is critical for reducing genetic variability in disease modeling and drug screening. This CRISPR-Cas9 protocol improves precision by minimizing indel formation in non-targeted alleles, thereby increasing confidence in genotype-phenotype correlations. The approach supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by enabling reliable functional assays in a controlled genetic background.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by creating isogenic lines where only the mutation of interest differs.
- Operational Value: Reduces confounding genetic background effects in functional assays, improving data reproducibility.
- Predictive Value: Supports target confidence through precise modeling of disease-relevant heterozygous mutations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces validated stem cell lines suitable for downstream differentiation and phenotypic screening.
- Operational Value: Standardizes genome-edited cell preparation via optimized transfection and colony screening workflows.
- Assay Readiness: Enables scalable generation of control and mutant lines for compound evaluation in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates study of mutation effects on human development and disease through functional assays in differentiated progeny.
- Operational Value: Supports preclinical continuity by providing genetically defined models for target validation.
- Translational Biomarker Alignment: Allows assessment of how specific mutations influence biomarker expression in disease-relevant cell types.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing genetically defined cellular models that enhance predictive confidence before preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise genetic modifications in human pluripotent stem cells.
- Screening: Delivers assay-ready, isogenic cell lines with quantitative outputs for compound screening and target engagement studies.
- Analytics: Generates PCR and restriction digestion readouts to quantify editing efficiency and validate allelic specificity.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical use by producing stem cell lines applicable to differentiation and functional assays.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genome-editing capability for multiple targets across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity from genetic noise in disease models.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized transfection, colony picking, and screening protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early de-risking of targets via precise genetic models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through reliable isogenic lines for target validation and lead identification.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human pluripotent stem cell culture and colony picking techniques.
- Dependent on fluorescence-activated cell sorting and PCR-based screening infrastructure.
- Necessitates optimization of transfection efficiency and guide RNA design for target specificity.
- Involves adaptation of repair template design to prevent re-cutting via silent mutations in PAM sequences.
- Dependent on downstream validation methods such as restriction enzyme digestion and sequencing for allelic confirmation.
