Name: Fare Meme Epitel HC11 ve EpH4 Hücrelerinin Farklılaşması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Keşfedin fare meme epitel HC11 ve EpH4 hücrelerinin farklılaşmasını, üç boyutlu kültürde mammosfer oluşumu ve sinyal iletimi yoluyla kanser tedavisi hedeflerinin belirlenmesi için.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

HC11 hücre hattı dr. D. Medina (Houston, TX) tarafından sağlanmıştır. Yazarlar Dr Andrew Craig Queen's Üniversitesi birçok reaktifler ve değerli öneriler için müteşekkiriz. EpH4 hücreleri Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver) tarafından hediye edildi. Colleen Schick 3D kültür çalışmaları için mükemmel teknik yardım sağladı.
Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC), Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (CIHR), Kanada Meme Kanseri Vakfı (CBCF, Ontario Bölüm), Kanada Meme Kanseri Araştırma İttifakı mali yardım , Ontario Mükemmellik Merkezleri, Meme Kanseri Eylem Kingston (BCAK) ve LR hibe yoluyla Clare Nelson miras fonu minnetle kabul edilmektedir. BE CIHR, CBCF, BCAK ve Kanser Araştırma Derneği A.Ş. PTG bir Kanada Araştırma Başkanı, Kanada Yenilik Vakfı, CIHR, NSERC ve Kanada Kanser Derneği tarafından desteklenir hibe desteği aldı. MN NCIC'den Disiplinlerarası Kanser Araştırmaları Terry Fox Eğitim Programı'ndan bir öğrencilik, Bir Lisansüstü ödülü (QGA) ve Queen's University'den Dekan Ödülü ile desteklenmiştir. MG, ABD Ordusu Meme Kanseri Programı, Ontario Eyaleti Araştırma ve Yenilik Bakanlığı ve Queen's University Danışma Araştırma Komitesi'nden doktora sonrası burslar tarafından desteklendi. VH, CIHR ile işbirliği içinde Terry Fox Vakfı Eğitim Programı'ndan Bir CBCF doktora bursu ve doktora sonrası burs ile desteklenmiştir. Hanad Adan Bir NSERC yaz öğrencilik alıcı oldu. BS, Queen's University lisansüstü ödülü ile desteklendi.

1. KAPLAMA HC11 Hücreleri
<ol><li>Steril teknikler kullanarak bir laminar akış kaputunda 50 mL HC11 hücreli ortama sahip bir şişe hazırlayın: RPMI-1640 %10 fetal sığır serumu (FBS), 5 g/mL insülin ve 10 ng/mL EGF (Bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>3 cm Petri kabı başına yaklaşık 400.000 hücre: İki 10 cm, %50 confluent Petri tabaklarını HC11 orta sında yirmi 3 cm'lik tabaklara geçirin. Hücreler iyi dağılmış olmalı ama kurutma kaçınılmalıdır.<ol>
<li>Bir vakum pompası kullanarak bir şişe içine orta aspire.</li>
		<li>10 cm'lik tabla 250 μL tripsin ekleyin (Bkz. Malzeme Tablosu). Girdap ve trippsin yaymak ve bağlı hücreleri yerinden etmek için yatay tutarken yanlardan plaka vurmak</li>
		<li>Hücrelerin pipetlemeden önce kenarlardan kopmaya başladığından emin olmak için faz kontrast mikroskopisi altında 4 x objektif olarak gözlemleyin.</li>
		<li>Steril bir şekilde yaklaşık 1,5 mL HC11 ortamı, 9 inç Pasteur pipet ve hücrelere dikey olarak fışkırtın. Tüm hücreleri yerinden çıkarmak için fışkırtma sırasında Petri kabını döndürün. Hücrelerin kurumasını önlemek için hızlı çalışmanız gerekir.</li>
		<li>HC11 orta ve girdap ile şişe tüm hücreleri aktarın.</li>
		<li>Her 3 cm Petri kabında pipet 2 mL hücre süspansiyonu. Eşit olarak yaymak için Petri tabakları çapraz sal. Hücreleri 37 °C, %5 CO2 kuluçka makinesine yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ertesi gün, ya da hücreler ~ 90-100% confluent olduğunda, orta aspire, ve FBS ve insülin ile orta ile değiştirin ama EGF eksik.</li>
</ol>2. HC11 Hücrelerinin Farklılaşma İndüksiyonu, İzlenmesi ve Nicelliği
<ol><li>24 saat boyunca EGF eksik orta hücreleri büyüttükten sonra, on 3 cm plakalar için diferansiyasyon orta (HIP orta) ekleyin: RPMI-1640% 10 FBS ile takviye, 1 μg/mL Hydrokortizon (Malzemeler Tablosubakınız), 5 μg/mL Insulin ve 5 μg/mL Prolactin (Malzemeler Tablosunabakın) kadar 10 gün.</li>
	<li>Diğer on 3 cm plakayı kontrol olarak saklayın: EGF ve HIP'den yoksun %10 FBS ve 5 g/mL insülin içeren bir ortama geçiş.</li>
	<li>Her 2-3 günde bir ortamı hem KALÇA ile tedavi edilen hücrelere hem de kontrollere değiştirin. Pipet, hücrelerin kopmadığından emin olmak için ortamı dikkatlice kullanın.</li>
	<li>Farklılaşmayı (yani kubbelerin oluşumunu) izlemek için faz kontrastmikroskobu altındaki hücreleri gözlemleyin(Şekil 1A, sol panel). Hücreler yeşil floresan proteini (GFP) ifade ediyorsanız, floresan mikroskopisi altında gözlemleyin (uyarma = 485/20; emisyon = 530/25; büyütme 240x; 20x objective)(Şekil 1A, sağ panel).</li>
	<li>Farklılaşma derecesini hesaplamak için, kalça ile tedavi edilen hücrelerin ve kontrollerin her birinden proteinleri çıkarmak, günde bir kez toplam 10 gün boyunca ve β-kazein için Batı lekelerini araştırmak (Bkz. Malzeme Tablosu)(Şekil 1B).<ol>
<li>1,5 mL buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) ile buz üzerindeki hücreleri 1,8 ml plastik santrifüj tüpüne kazıyın.</li>
		<li>350 x g,1 dk, 4 °C'de bulunan hücrelerpelet.</li>
		<li>Pelet2x'i buz gibi PBS ile hızlıca yıkayın. Herhangi bir kalıntı drenaj.</li>
		<li>Bir lysis tampon olun: 50 mM HEPES (pH = 7.4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM Na4P2O7,%1 NP-40, 100 mM NaF, 2 mM Na3VO4,0.5 mM fenilmetilsülsfonil florür (PMSF), 10 μg/mL aprotinin, 10 μg/mL leupeptin16. 3 cm Petri kabına 100°L ekleyin.</li>
		<li>10 dk soğukta 10.000 x g santrifüj ile lysate netleştirin.</li>
		<li>Protein konsantrasyonu belirleyin (bkz. Malzemeler Tablosu)ve her örnekten 10-20 μg proteini %10 poliakrilamid-SDS jeline yükleyin.</li>
		<li>45 V'da 15 saat veya ~2-2,5 saat için 100 V'de elektrofor.</li>
		<li>Elektroblot transfer cihazı kullanarak nitroselüloz veya PVDF membranüzerine transfer (Bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Tris-tamponlu serum da %5 büyükbaş serum albumin (BSA) ile %0.1 Tween-20 (TBST) ile blok.</li>
		<li>Birincil antikor, keçi anti-β-kazein seyreltilmiş 1:2.000 veya fare anti-β aktin seyreltilmiş 1:1.000 (Malzeme Tablosubakınız).</li>
		<li>TBST ile 3x yıkayın, 5 dk her zaman.</li>
		<li>İkincil antikor ekleyin, horseradish peroksidaz (HRP) bağlı eşek anti-keçi seyreltilmiş 1:2,500, veya HRP bağlantılı at anti-fare antikor seyreltilmiş 1:10,000.</li>
		<li>TBST ile 3x yıkayın, 5 dk her zaman.</li>
		<li>Üreticinin talimatlarına göre membrana ECL reaktifleri ekleyin (bkz. Malzemeler Tablosu).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. EHS Matrisinde EpH4 Hücrelerinin Kaplama ve 3D Büyümesi
NOT: Matris sıcaklıklarda sıvıdır <10 °C ve yukarıdaki sıcaklıklarda katıdır. -80 °C'de saklayın. Kullanımdan önceki gece 4 °C'de çözülün. İşleme den önce -20 °C'de doku kültürü plakalarını ve pipet uçlarını önceden soğutun ve katılaşmasını önlemek için matris, plaka ve pipet uçlarını buz üzerinde tutun.
<ol><li>RPMI-1640 orta 2D EpH4 hücreleri büyümek 10% FBS ve 5 μg/mL insülin (EGF gerekli değildir).</li>
	<li>İki 50 mL konik tüpte %10 (v/v, 3,500 μL) veya %20 (v/v 2.000 μL) matris ile desteklenen EpH4 büyüme ortamını hazırlayın. Kullanıma hazır olana kadar buzda tutun.</li>
	<li>150 μL'lik seyreltilmemiş matrisiçeren 24 kuyuluk bir tablanın 10 kuyusunu (her biri 1 cm2) kaplayın. Bir pipet ucu kullanarak matris yayıldı. Kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Matrisin kuyunun dibine eşit olarak dağıldığından emin olmak için plakayı yatay olarak tutarken yavaşça dokunun.</li>
	<li>Matrisin katılaması için 24 kuyu plakasını 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Yukarıda HC11 hücreleri için açıklandığı gibi EpH4 hücrelerini trypsinize ve hemositometre ile sayar. Kuyu başına 5 x 104 hücreyi 1,5 mL steril konik santrifüj tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 250 x g'de döndürün.</li>
	<li>Dikkatle orta aspire ve buz üzerinde tüp yerleştirin.</li>
	<li>EpH4 büyüme ortamının 350 μL'lik halindeki hücreleri 1 mL pipet ucu kullanılarak %20 matris ile tamamlanırken konik tüpü buzda tutar. Kabarcıklar kaçının. Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak önemlidir.</li>
	<li>Alt tabaka matrisi katılaştırıldıktan sonra (matris kuyuların ilk kaplamasına göre yarı saydam ve açık renkte görünmelidir), kaplanmış her bir iyiye 350 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve 37 °C'de ~1 saat için ~1 saat bir CO2 kuluçka makinesine yerleştirilerek %20 matris tabakasının katılaşmasını bekleyin.<ol>
<li>4x hedefi ile faz kontrastı altında hücreleri mikroskobik olarak gözlemleyin. Tek hücreler görünür olmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>%20 matris içinde asılı olan 350 μL'lik hücrelerin üzerine %10 matris içeren 200 μL EpH4 ortamı ekleyin. 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>4. EpH4 Hücrelerinin 3B'de Yetiştirilen Farklılaşma İndüksiyonu (Şekil 2)
NOT: Farklılaşmanın yanı sıra, EpH4 hücreleri 3D kültürde HGF (hepatosit büyüme faktörü) ile uyarıldığında tübülogenene de uğrayabilirler. 10 günlük KALÇA ve HGF stimülasyonundan sonra tübüler çıkıntılar görülebilir.
<ol><li>EpH4 hücrelerinin matris kaplama 1 gün sonra farklılaşma indüksiyonbaşlar. Plastik pipet ucu kullanarak kuyulardan %10 matris içeren 150 μL'lik üst ortamı dikkatlice çıkarın. 200 μL EPH4 orta hip ve% 10 matris içeren ekleyin.</li>
	<li>10 güne kadar her 2 günde bir %10 matris-HIP ortamını değiştirin. HIP olmadan aynı% 10 matris ortamda kontrol hücreleri büyümek.</li>
	<li>Faz kontrastı altında mammosfer oluşumunu izleyin(Şekil 3A, alt panel).</li>
</ol>5. 3Boyutlu Olarak Yetiştirilen EpH4 Hücrelerinin Tübülogenez İndüksiyonu (Şekil 3A ve 3C)
<ol><li>3.1-3.9 adımlarında ayrıntılı olarak belirtildiği gibi matris büyüme için 24 kuyu plakaları ve EpH4 hücreleri hazırlayın. Matristeki hücreleri kaplamasından bir gün sonra, plastik pipet ucu kullanarak kuyulardan %10 matris içeren 150 μL EpH4 ortamını çıkarın. %10 matris, HIP ve 20 ng/mL HGF içeren 200 μL EpH4 ortamı ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>%10 matris/HIP/HGF ortamını 12-14 güne kadar her 2 günde bir değiştirin.</li>
	<li>20x veya 40x hedefi(Şekil 3A, sağ panel) kullanarak tübül oluşumunu mikroskobik olarak izleyin.</li>
</ol>6. Farklılaşmanın Nicelliği: Β-kazin için Batı Lekeleme
<ol><li>Kuyulardan %10 matris-HIP ortamını dikkatlice incelikle kapatın. %20 matris tabakasını 350 μL buz gibi PBS ile durulayın. Küreseller hala matris tabakasında bulunmalıdır.</li>
	<li>1 mM ethylenediaminetetraasetik asit (EDTA) ile 700-1.000 μL buz gibi PBS doğrudan kuyulara ekleyin. %100 matrisin alt tabakasını bir pipet ucuyla kuyudan yavaşça ayırarak o tabakada bulunan küresel leri kurtarın. 4 °C'de 30 dk hafifçe çalkalayın.</li>
	<li>Spheroid süspansiyonu konik bir tüpe dikkatlice aktarın. Kuyularda kalan küresel leri kurtarmak ve konik tüpe eklemek için kuyuları ~500 μL PBS-EDTA ile durulayın.</li>
	<li>Ek bir 30 dakika buz üzerinde Kaya 30 dakika. Matris tamamen erimiş olduğundan emin olun. Görünür matris kümeleri görülürse, daha fazla PBS-EDTA ekleyin veya daha uzun süre sallayın.</li>
	<li>5 dk için 350 x g de spheroids pelet için çözelti santrifüj.</li>
	<li>Supernatant aspire, buz-soğuk lysis tampon küresel lyse, ve β-kazein için prob, siklin D1, ve p120RasGAP Batı blotting tarafından adım 2.5 yukarıda16. Birincil antikorlar olarak, 1:2.000 seyreltilmiş keçi anti-β-kazein, tavşan anti-siklin D1 1:2.000 seyreltilmiş ve fare anti-p120 seyreltilmiş 1:2.000 kullanın. İkincil antikorlar için, HRP bağlantılı eşek anti-keçi 1:2.500 seyreltilmiş, HRP bağlantılı eşek anti-tavşan seyreltilmiş 1:2.500 ve HRP bağlantılı at anti-fare seyreltilmiş 1:10.000 kullanın.</li>
</ol>

<ol><li>Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engaged+for+survival%3B+from+cadherin+ligation+to+Stat3+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Jaks-Stat%22%5BJournal%5D)">Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation.</a> Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).</li>
<li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+HC11+mouse+breast+epithelial+cell+differentiation+by+the+E-cadherin%2FRac+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis.</a> Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).</li>
<li>Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolactin+regulation+of+beta-casein+gene+expression+and+of+a+cytosolic+120-kd+protein+in+a+cloned+mouse+mammary+epithelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line.</a> The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).</li>
<li>Humphreys, R. C., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stably+transfected+HC11+cells+provide+an+in+vitro+and+in+vivo+model+system+for+studying+Wnt+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+growth+%26+differentiation%22%5BJournal%5D)">Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function.</a> Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).</li>
<li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((differentiation+and+survival+of+HC11+mammary+epithelial+cells%3A+diverse+effects+of+receptor+tyrosine+kinase-activating+peptide+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors.</a> European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).</li>
<li>Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+epithelial+cell+differentiation+in+vitro+is+regulated+by+an+interplay+of+EGF+action+and+tenascin-C+downregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation.</a> Journal of Cell Science. 108, Pt 6 2445-2456 (1995).</li>
<li>Arbeithuber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+5+expression+in+mouse+mammary+gland+cells+is+not+driven+by+promoter+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation.</a> BioMed Research International. 2015, 460598(2015).</li>
<li>Morrison, B., Cutler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Mammary+Epithelial+Cells+form+Mammospheres+During+Lactogenic+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), e1265(2009).</li>
<li>Merlo, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+suppression+of+normal+mammary+epithelial+cells+by+wild-type+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53.</a> Oncogene. 9, 443-453 (1994).</li>
<li>Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+mammary+epithelial+and+fibroblastic+cell+clones+in+coculture+form+structures+competent+to+differentiate+functionally%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally.</a> Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).</li>
<li>Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+3-kinase+is+required+for+adherens+junction-dependent+mammary+epithelial+cell+spheroid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation.</a> Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).</li>
<li>Mroue, R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cultures+of+mouse+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).</li>
<li>Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+in+murine+mammary+epithelial+stem+cell-like+cells+shows+similarities+to+human+breast+cancer+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression.</a> Breast Cancer Research. 11 (3), 26(2009).</li>
<li>Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+EpH4+mammary+epithelial+cell+subpopulations+which+differ+in+their+morphogenetic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 34 (6), 468-477 (1998).</li>
<li>Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+differentiation+regulated+by+MicroRNA-200a+in+mammary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands.</a> PLoS One. 8 (6), 65127(2013).</li>
<li>Arulanandam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac%2FCdc42+and+Stat3%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).</li>
<li>Geletu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+cadherins+control+survival+through+the+gp130%2FStat3+axis%5BTitle%5D)+AND+%22BBA-Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis.</a> BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).</li>
<li>Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+R%28h%29oads+to+Stat3%3A+Stat3+activation+by+the+Rho+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases.</a> Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).</li>
<li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+structure%2C+to+survival%3A+Stat3+activation+by+cadherin+engagement%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement.</a> Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).</li>
<li>Niit, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Differentiation+of+HC11+Mouse+Breast+Epithelial+Cells+by+the+Signal+Transducer+and+Activator+of+Transcription-3%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3.</a> Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).</li>
<li>Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+growth+factor%2Fscatter+factor+induces+a+variety+of+tissue-specific+morphogenic+programs+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells.</a> Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).</li>
<li>Starova, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Role+of+cell+adhesion+microevironment+and+the+Src%2FStat3+axis+in+autocrine+HGF+signaling+during+breast+tumourigenesis%22">Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis</a>. , Queen's University. M.Sc. Thesis (2008).</li>
<li>Raptis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rasleu61+blocks+differentiation+of+transformable+3T3+L1+and+C3HT1%2F2-derived+preadipocytes+in+a+dose-+and+time-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner.</a> Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).</li>
<li>Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Housekeeping+gene+products%3B+levels+may+change+with+confluence+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells.</a> Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).</li>
<li>Vultur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+models+of+normal+and+malignant+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells.</a> Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).</li>
<li>Hoskin, V. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22A+novel+regulatory+role+of+Ezrin+in+promoting+breast+cancer+cell+invasion+and+metastasis%22">A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis</a>. , Queen's University. Ph.D. Thesis (2015).</li>
<li>Su, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+confluence-induced+activation+of+signal+transducer+and+activator+of+transcription-3+%28Stat3%29+triggers+epithelial+dome+formation+via+augmentation+of+sodium+hydrogen+exchanger-3+%28NHE3%29+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).</li>
<li>Ostrovidov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+tissue+engineering%3A+methods+to+form+skeletal+myotubes+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).</li>
<li>Cass, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Novel+Stat3+and+Stat5+pathways+in+epithelial+cell+differentiation%22">Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation</a>. , Queen's University. Ph.D. thesis (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir çakışmaları yok.

HC11 hücreleri neoplastik transformasyon ile birlikte farklılaşma çalışmaları için idealdir. Ek bir avantajı HC11 hücreleri kolayca Mo-MLV tabanlı retroviral vektörler ile genlerin çeşitli ifade etmek için enfekte olmasıdır. Elimizde, EpH4 hücreleri HC112daha aynı retroviral vektörleri ile enfekte daha zordu.
Hücreden hücreye temas ve büyüme durması HC11 hücre farklılaşmasıiçin önemli ön koşullardır. Bu nedenle, hücre tabakası arasında tek tip farklılaşma elde etmek içi...

Normal dokularda veya tümörlerde, hücreler üç boyutlu bir organizasyonda komşularına yapışma için geniş fırsatlara sahiptir ve bu da kültürde yüksek yoğunluklu hücre büyümesi ile taklit edilir. Hücre-hücre adezyonu esas olarak hücre ve doku mimarisini tanımlayan kadherin reseptörleri aracılığıyla aracılık edilir. İlginçtir, son zamanlarda kadherinler de sinyal iletimi güçlü bir rol oynadığı gösterilmiştir, özellikle hayatta kalma sinyalizasyon1. Paradoksal olarak, kadherinlerden yayılan bu hücreden hücreye yapışma sinyallerinin bir kısmının yakın zamanda hem farklılaşma hem de neoplazi2ile paylaşıldığı bulunmuştur. Burada fare meme epitel hücre hatları, HC11 ve EpH4 iki temsili tip tedisiyasyon indüksiyon ve değerlendirme yöntemleri açıklanmıştır.
HC11 fare meme epitel hücre hattı epitel hücre farklılaşması çalışma için yararlı bir model sağlayabilir. HC11 hücreleri, orta gebe balb/c fare3'ünmeme bezinden kaynaklanan, VIRGÜL-1D türetilmiş bir hücre hattıdır. Diğer VIRMAN-1D türevi klonların aksine, HC11 klonu ekselolarak ekselansları ekstrasellüler matriks veya laktojenik hormonlar tarafından endojen β-kazein geninin in vitro indüksiyonu için diğer hücre tipleri ile birlikte eklenme gereksinimi yoktur3. Bu hücre hattı, normal meme epitelinin önemli özelliklerini koruduğu için ayırım çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır: HC11 hücreleri kısmen temizlenmiş bir meme yağ yastığında duktal epiteli yeniden oluşturabilir4. Ayrıca, h ydrokortizon veya Deksametazon gibi bir steroid varlığında plastik petri çanak yüzeyine bağlı biraraya yetiştirilen bir iki boyutlu (2D) kültür ayırt edebilirsiniz, Insulin ve Prolactin ek olarak (HIP orta) epidermal büyüme faktörü yoksun (EGF), farklılaşma bir inhibitörü5,6,7. Bu koşullar altında, HC11 hücreleri β-kazin ve WAP gibi süt proteinleri üretirler ve indüksiyondan sonraki 4 gün içinde Batı lekeleme ile saptanabilir. Aynı zamanda, HC11 hücrelerinin bir kısmı stochastic bir şekilde "kubbeler" olarak adlandırdığı temel meme bezi benzeri yapılar oluşturur. Kubbeler indüksiyondan 4-5 gün sonra görülebilir ve 10. İlginçtir, HC11 hücreleri mutant p539sahip , ve bu nedenle bir preneoplastik devlet temsil eder. Bu nedenle, HC11 modeli ideal aynı hücre sisteminde neoplazi ile birlikte farklılaşma sinyal ağları çalışmak için uygundur.
EPH4 hücreleri, IM-2 hücrelerinin bir türevi, bir nontumorigenic hücre hattı aslında bir orta hamile Balb / c fare izole spontan ölümsüzleştirilmiş fare meme bezi epitel hücreleri türetilmiştir10. EpH4 hücreleri 2D kültürde sürekli epitel monolayers formu, ancak glandüler benzeri yapılar10,11ayırt yok. Ancak, EHS fare sarkomu hücreleri tarafından üretilen ekstrasellüler matriks proteinlerinin bir karışımından oluşan bir malzemede 3D büyüme sonrasında12 (EHS matris, matris veya Matrigel, Bkz. Malzeme Tablosu),HIP ile uyarılmaya ek olarak, EpH4 hücreleri meme bezi farklılaşmasının ilk aşamalarını özetleyebilir. Bu koşullar altında, EpH4 hücreleri apical-bazal polarite ve içi boş bir lümen sergileyen küresel (mammospheres olarak da adlandırılır) oluştururlar ve süt proteinleri β-kazin ve WAP üretme yeteneğine sahiptirler, emziren meme epitel hücrelerine benzer. Farklılaşmamış HC11 hücrelerinin aksine, ve bazı ekspres mezenkimal belirteçler13, EpH4 hücreleri tamamen luminal morfolojisi sergiler14. EpH4 hücrelerinin de deksametazon, insülin ve prolaktin15ile stimülasyon yoluyla 2D kültürde süt proteinleri üretmek için bildirilmiştir. Ancak bu yaklaşım, 3D kültürde meme bezi mikroçevresini taklit eden düzenleyici etkilerin araştırılmasını engellemektedir.

<table><tbody><tr><td>% 30 Akrilamid /% 0.8 Bis Çözeltisi</td><td>Bio Rad</td><td>1610154</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-Cyclin D1 antikor</td><td>tavşanı, Santa Cruz</td><td>sc-717</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-p120 antikor</td><td>faresi, Santa Cruz</td><td>sc-373751</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-&beta; aktin antikor</td><td>faresi, Hücre Sinyalizasyon teknolojisi</td><td>3700</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Anti-&beta; kazein antikoru</td><td>keçisi, Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-17971</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Bio Shop</td><td>APR600</td><td>Lizis Tamponu</td></tr><tr><td>Biskinkoninik Asit Çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>B9643-1L-KC</td><td>Protein Tayini</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Bio Shop</td><td>ALB007.500</td><td>Protein Tayini</td></tr><tr><td>Netliği Batı ECL Substrat</td><td>Bio Rad</td><td>170-5061</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Bakır (II) sülfat</td><td>Sigma</td><td>C2284-25ML</td><td>Protein Tayini</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td>Boyama</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>14952-500</td><td>Boyama</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Shop</td><td>EDT001.500</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Büyüme Faktörü</td><td>Sigma</td><td>HC11 Hücreleri için E9644</td><td>Ortam</td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>PAA</td><td>A15-751</td><td>Hücre Kültürü Ortamı</td></tr><tr><td>Keçi-Anti Tavşan-HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2004</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Hepatosit Büyüme Faktörü rekombinant</td><td>Gibco</td><td>PHG0321</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>Hücre Kültürü</td></tr><tr><td>At Anti-Fare HRP</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td><td>7076</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Sigma</td><td>H0888</td><td>HIP Orta</td></tr><tr><td>insülin</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>HIP Orta</td></tr><tr><td>Laminer akış başlığı</td><td>BioGard Hood</td><td></td><td>Hücre Kültürü</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Bio Shop</td><td>LEU001.10</td><td>Lizis Tampon</td></tr><tr><td>Matrisi (Engelbreth-Holm-Swarm matrisi, Matrigel)</td><td>Corning</td><td>CACB 354230</td><td></td></tr><tr><td>Fare Anti-Keçi HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8360</td><td>Batı Blotting</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88 Reaktif</td><td>Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd</td><td>475904-100GM</td><td>Boyama</td></tr><tr><td>Çoklu foton konfokal mikroskop</td><td>Leica TCS SP2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Biyo Dükkanı</td><td>SOV850</td><td>Lizis Tamponu</td></tr><tr><td>Na4P207</td><td>Sigma</td><td>125F-0262</td><td>Lizis Tamponu</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Biyo Dükkanı</td><td>SOD001.1</td><td>Batı Blotting</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Fisher Scientific</td><td>7681-49-4</td><td>Lizis Tamponu</td></tr><tr><td>Nikon dijital Fotoğraf Makinesi</td><td>Coolpix 995</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitroselüloz</td><td>Bio Rad</td><td>1620112</td><td>Batı Blotting</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>30525-89-4</td><td>Boyama</td></tr><tr><td>Fazı Kontrast Mikroskobu</td><td>Olympus IX70</td><td></td><td>Hücre Kültürü</td></tr><tr><td>Fenilmetilsufonil florür</td><td>Sigma</td><td>329-98-6</td><td>Lizis Tamponu</td></tr><tr><td>pMX GFP Rac G12V</td><td>Addgene</td><td>14567</td><td></td></tr><tr><td>Prolaktin</td><td>Sigma</td><td>L6520</td><td>HIP Orta</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>Hücresi Kültür Ortamı:</td></tr><tr><td>Doku kültürü kabı 35</td>, <td>Sarstedt</td><td>83.3900.</td><td>Hücre Kültürü</td></tr><tr><td>Doku Kültürü Plakası-24 kuyusu</td><td>Sarstedt</td><td>83.1836.300</td><td>Hücre Kültürü</td></tr><tr><td>Transfer Aparatı</td><td>CBS Scientific Co</td>, <td>EBU-302</td><td>Batı Blotting,</td></tr><tr><td>Tris Asetat</td><td>Bio Shop</td>, <td>TRA222.500</td><td>Western Blotting,</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Sigma</td><td>9002-07-7.</td><td>Hücre Kültürü</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio Shop</td><td>TWN510.500</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>Veritik Jel Elektroforez Sistemi</td><td>CBS Scientific Co</td><td>MGV-202-33</td><td>Western Blotting</td></tr></tbody></table>

fare meme epitel hc11 ve eph4 hücrelerinin farklılaşması

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Kadherinler hücre farklılaşmasının düzenlenmesinde ve neoplazide önemli rol oynarlar. Burada iki fare meme epitel hücre hatları, HC11 ve EpH4 farklılaşma indüksiyon uyupasyon ve meme bezi gelişimi ve neoplastik dönüşüm tamamlayıcı aşamaları çalışma da bunların kullanımı açıklar.
HC11 fare meme epitel hücre hattı hamile bir Balb / c fare meme bezi kökenli. Fetal baldır serumu ve Hydrokortizon, Insulin ve Prolactin (HIP medium) içeren orta derecede plastik Petri kabı yüzeyine bağlı olarak biraraya geldiğinde farklılaşır. Bu koşullar altında, HC11 hücreleri süt proteinleri β-kazein ve peynir altı suyu asidik protein (WAP), emziren meme epitel hücrelerine benzer üretmek ve "kubbe" olarak adlandırılır ilkel meme bezi benzeri yapılar oluştururlar.
EpH4 hücre hattı, hamile bir Balb/c fareden izole edilmiş kendiliğinden ölümsüzleştirilmiş fare meme bezi epitel hücrelerinden türetilmiştir. HC11'in aksine, EpH4 hücreleri HIP ortamda üç boyutlu (3D) büyüme koşulları altında kültürlendiğinde küresel (mammospheres olarak da adlandırılır) tam olarak ayırt edilebilirler. Hücreler, Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarkom hücreleri tarafından üretilen ekstrasellüler matriks proteinlerinin karışımından oluşan %20'lik bir matris içinde, plastik petri kabını veya çok kuyulu plakayı kaplayan konsantre matris tabakasının üzerine kaplanmış ve %10 matris içeren HIP ortamı tabakası ile kaplanır. Bu koşullar altında, EpH4 hücreleri apical-bazal polarite, içi boş bir lümen sergileyen ve β-kazein ve WAP üreten içi boş küreseller oluştururlar.
Bu teknikleri kullanarak, sonuçlarımız cadherin/Rac sinyalinin yoğunluğunun HC11 hücrelerinin farklılaşması için kritik öneme sahip olduğunu göstermiştir. Rac1 farklılaşma ve aktive RacV12 artış farklılaşma düşük seviyelerde için gerekli iken, yüksek RacV12 düzeyleri neoplazi indüklerken farklılaşmayı engeller. Buna karşılık, EpH4 hücreleri meme epitelyal diferansiyasyon daha önceki bir aşamayı temsil, Hangi RacV12bile düşük seviyelerde inhibe edilir .

Uzun epitel hücreleri ve adipositlerin farklılaşması biraraya ve kadherinler2nişan gerektirir bilinmektedir . Biz ve diğerleri, E- veya N-kadherin ve kadherin-11 hücre-hücre adezyon ve nişan gösterdi kültürlü hücrelerin birleşimi ile oluşur, küçük GTPases Rac ve hücre bölünmesi kontrol protein 42 (Cdc42) aktivitesinde dramatik bir artış tetikler ve bu süreç interlökin aktivasyonu yol açar-6 (IL6) aile sitokinler ve Stat3 (sinyal transdüser ve transkripsiyon aktivatör-316<su...

Biz iki meme epitel hatları, HC11 ve EpH4 farklılaşma indüksiyon teknikleri açıklayın. Her ikisi de süt proteinleri üretmek için fetal buzağı serumu, insülin ve prolaktin gerektirirken, EpH4 hücreleri üç boyutlu kültürde mammospheres içine tam olarak ayırt edebilirsiniz. Bu tamamlayıcı modeller farklılaşma ve neoplazi sinyal iletimi çalışmaları için yararlıdır.

Fare Meme Epitel HC11 ve EpH4 Hücrelerinin Farklılaşması

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

HC11 ve EpH4 hücreleri, kültürde ayırt edilebilen fare meme epitel hücre çizgileridir. Aynı zamanda, bu hücreler onkogenler bir dizi tarafından dönüştürülebilir. Bu hücreler farklılaşma ve neoplastik dönüşüm arasındaki ilişki çalışması için idealdir.Bu teknikler sinyal iletim çalışmalarında kanser tedavisi için hedefleri keşfetmek için kullanılabilir. Örneğin, küçük GTPase Rac ve diğer moleküller yüksek seviyelere ifade edildiğinde meme epitel hücrelerinin dönüşümünü tetikleyebilir, ama şaşırtıcı düşük seviyelerde, onlar farklılaşma neden olabilir. Diğer sinyal dönüştürücüleri de benzer şekilde davranabilir.Bu ilkeler, hücre birleşiminin önemli bir rol oynadığı diğer farklılaşma türlerine de uygulanabilir, örneğin adipositlerin veya miyotüplerin farklılaşması gibi. Bu tekniği ilk kez yapan biri, HC11 hücrelerinin kaplamasının önemli olduğunu unutmamalıdır. Bunun nedeni hücreden hücreye temas farklılaşma için önemlidir olmasıdır.Dikkat edilmesi gereken bir diğer nokta da, eph4 hücrelerinin matristen doğru şekilde çıkarılmasının protein niceliği için kritik öneme sahip olmasıdır, çünkü herhangi bir kalıntı protein tayinini etkileyecektir. Protokolün bazı ayrıntılarını kağıt üzerinde açıklamak zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi yararlıdır. El yazması talimatlara göre 50 mililitre HC11 hücreli ortam bir şişe hazırlayarak başlayın.Hücreleri kaplamak için, beş altı santimetre 50% confluent Petri yemekleri orta aspire ve steril dokuz inç pamuk bağlı Pasteur pipet kullanarak trypsin yaklaşık 1.8 mililitre ile hücreleri yıkayın. Sonra plaka başına trypsin 200 mikrolitre ekleyin ve bağlı hücreleri yerinden etmek için plaka girdap. Faz kontrast mikroskopisi altındaki hücreleri 4X hedefiyle gözlemleyin ve yerinden çıkmaya başladıklarından emin olun.Daha sonra steril bir dokuz inç Pasteur pipet ile HC11 orta yaklaşık 1,5 mililitre aspire ve sıçramasını önlemek için emin yapmak çanak döndürerek hücrelere karşı dikey olarak fışkırtMak. HC11 orta ve girdap ile şişe ye tüm hücreleri aktarın şişe eşit dağıtmak için. Sonra 20 üç santimetre Petri yemekleri içine hücre süspansiyon aliquot her çan başına iki mililitre hücre pipetting tarafından.Hücreleri yaymak ve bir gecede 37 santigrat derece ve % 5 karbondioksit onları kuluçka yayılımı için Petri yemekleri Rock. Ertesi gün hücreler %90-100 konfluent olduğunda, ortamı aspire edin ve egf olmadan orta ile değiştirin. 24 saat EGF olmadan orta hücreleri büyüttükten sonra, 10 yemekler için farklılaşma orta ekleyin ve kontrol olarak diğer 10 yemekleri tutarak 10 güne kadar hücreleri büyümek.Hem KALÇA tedavi ve kontrol hücreleri ile her iki ila üç günde bir orta değiştirin. Farklılaşmayı izlemek için faz kontrastlı mikroskopile hücreleri gözlemleyin. Hücreler yeşil floresan protein ifade ediyorsanız floresan mikroskobu kullanın.Ayrıca, kalça tedavi ve kontrol hücreleri günde bir kez proteinleri ayıklayarak ve Batı Blot analizi gerçekleştirerek farklılaşma derecesini ölçmek. EpH4 büyüme ortamını, EHS matrisini ve buz üzerinde iki konik 50 mililitrelik tüpü toplayın ve yerleştirin. Eksi 20 santigrat derece pipet uçları ile doku kültür plakaları prechill ve iki 50 mililitrekonik tüpler 10 veya% 20 matris ile takviye EpH4 büyüme ortamı hazırlamak ve kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutmak.Eksi 20 santigrat derece önceden soğutulmuş doku kültür plakaları aldıktan sonra, bir pipet ile matris yayArak seyreltilmemiş matris 150 mikrolitre ile 24-iyi plaka 10 kuyu kat. Matris ilerlerken kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Daha sonra yavaşça plakanın kenarlarına dokunun ve matrisin katılaşabilmesi için plakayı 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın.Bu arada, eph4 hücrelerini daha önce açıklanan ve trypsed hücrelerin intibakı sonrası tek hücre süspansiyonları sağlayarak farklılaşmaya hazırlanın. Sonra, bir hemositometre ile süspansiyon hücreleri saymak. Kuyu başına dört hücreye beş kez 10 tane aktarın ve beş dakika boyunca 250 kez g'de döndürün.Dikkatle supernatant orta aspire ve buz üzerinde tüp yerleştirin. Bir mililitrelik pipet ucu kullanın eph4 büyüme ortamının 350 mikrolitre hücreleri yeniden askıya almak için kullanın 20% matris ile takviye ederken buz üzerinde tüpler kabarcıklar önlemek için emin tutmak. Alt tabaka katılaştırıldıktan sonra, her kaplanmış iyi kaplanmış hücre süspansiyon 350 mikrolitre ekleyin ve bir saat için 37 derece santigrat bir karbondioksit inkübatör yerleştirin% 20 matris tabakası katılaşmak için izin vermek.Tek hücrelerin görünür olduğundan emin olmak için faz kontrast mikroskopisi ile hücreleri gözlemleyin. Daha sonra 200 mikrolitre EpH4 orta ve %10 matris ekleyin ve plakayı 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Matristeki hücreleri kaplamaktan bir gün sonra farklılaşma indüksiyonuna başlayın.Dikkatle üst% 10 matris orta 150 mikrolitre çıkarın ve HIP ve% 10 matris içeren EpH4 orta 200 mikrolitre ekleyin ve kontroller için% 10 matris orta HIP olmadan ekleyin. Mamografi oluşumunu faz kontrastmikroskobu ile 10 güne kadar izleyerek ortamı iki günde bir değiştirin. Farklılaşmayı ölçmek için, %10 matris HIP ortamını kuyulardan dikkatlice inceleyin ve %20 matris katmanını 350 mikrolitre buz gibi pbs ile durulayın.Daha sonra 70 ila 100 mikrolitre buz gibi soğuk PBS ekleyin ve bir milimolar EDTA ile doğrudan kuyulara ve %100 matrisin alt tabakasını pipet ucuyla hafifçe ayırın. Tabağı 30 dakika boyunca dört santigrat derecede hafifçe sallayın. Spheroid süspansiyonu konik bir tüpe dikkatlice aktarın ve kalan küresel leri kurtarmak için kuyuları 500 mikrolitre PBS EDTA ile durulayın.Matrisin tamamen eridiğinden emin olmak için tüpü 30 dakika daha buz üzerinde sallayın. Görünür matris kümeleri görülürse, daha fazla PBS EDTA ekleyin veya daha uzun süre sallayın. Spheroidleri peletlemek için çözeltiyi 350 kez g'de santrifüj edin.Daha sonra supernatant aspire, küresel lyse, ve beta-kazein için hücreleri araştırmak, siklin D1, ve p120RasGAP Batı blotting tarafından. HC11 hücrelerinde Rac sinyalinin gücü üzerine farklılaşma çarpıcı bir bağımlılık vardır. Endojen CRAC1 farklılaşma için gerekli iken ve mutasyona aktive RacV12 düşük seviyelerde farklılaşma kapasitesinde bir artışa neden, yüksek RacV12 düzeyleri farklılaşma bir blok tetikler ve neoplazi neden.EpH4 hücrelerinin ayırım özellikleri 3Boyutlu matris kültüründe incelendiğinde, beta-kazein üretiminin 8-10 gün, siklin D1 ekspresyonunun ise HIP stimülasyonundan 4-6 gün sonra maksimum olduğu saptandı. Tek tek hücrelerin konumlandırılmasını belirlemek için DAPI ile boyanarak konfokal mikroskopi ile görüntülendiler. Memmosferlerde iç hücre ölümü ve içi boş lümen oluşumu gözlenirken, HGF eklenmesi tübüler yapıların oluşmasına neden oldu.Bu tekniği ilk kez yapan biri, HC11 hücrelerinin kaplamasının önemli olduğunu unutmamalıdır. Ayrıca eph4 hücrelerinin matristen doğru çıkarılması protein niceliği için çok önemlidir, çünkü herhangi bir kalıntı protein tayinini etkileyecektir. Bu teknik, benzer şekilde davranabilecek diğer sinyal dönüştürücülerini araştırmak için kullanılabilir.Bir kanser sürücü mutasyonları varsa, o zaman düşük seviyelerde kalan aslında farklılaşma neden olur bu yana onların tam inhibisyonu gerekli olmayacaktır.

differentiation-of-mouse-breast-epithelial-hc11-and-eph4-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

HC11 lactogenic farklılaşma mammospheres olarak anılacaktır kubbeli yapıların oluşumu ile karakterize edilebilir. Yapılar, faz kontrast mikroskobu ile numaralandırılan lactogenic farklılaşma niceleme yardımcı olabilir.

Fare Meme Epitel Hücreleri lactogenic Farklılaşma sırasında Mammospheres formu

Basit bir metodu ile ilişkili epitel hücreleri üzerindeki doku fibroblastlann etkileri analiz etmek için tarif edilmiştir. Bu yöntem, üç boyutlu bir doku kültürü kombinasyonu 3D izole sonra hücrelerin analizi kolaylaştırabilir. Tekniği tümör hücreleri üzerindeki tümör-stroma etkileri ile ilişkili sistematik çalışma izin veren, habis potansiyeli değişen hücreleri için de geçerlidir.

Üç boyutlu Karışık-hücre Sfero Co-kültürden Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Insan meme cerrahi ıskarta malzeme işlemek için bir yöntem tarif edilmiştir. Organoids şeklinde işlenmiş doku, süresiz olarak dondurulmuş ya da uzun süreli büyüme için kültür içinde yerleştirilmiş saklanabilir. Bu yöntem deneysel normal insan epitel hücre biyolojisi incelenmesi ve eksojen pertürbasyonların etkileri sağlar.

Hücre Kültürü İnsan Azaltma Meme Cerrahisi ve Mastektomi Doku İşleme

Time-lapse görüntüleme özgü davranışsal parametreler ve farklı genetik lezyonlar arasında bir korelasyon olup olmadığını belirlemek için meme kanseri riskinin genetik fare modelleri türetilmiştir birincil preneoplastic meme epitel hücrelerinin davranışlarını değerlendirmek için kullanılır.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Son yıllarda, in vitro kültür yöntemler kullanılarak germ hücre oluşumunu somatik kök hücrelerin birkaç farklı türde kullanılarak gösterilmiştir. Bu makale, görsel erken oosit benzeri hücrelere yeni doğan fare edilen kök hücrelerin farklılaşma sunacak.

Germ benzeri hücreler içine Yenidoğan Fare Cilt Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşma<em&gt; In vitro</em

Bu makalede açıklanan dolaylı immünfloresan protokol algılama ve fare meme bezinde proteinlerin yerelleştirme verir. Tam bir yöntem olup, meme bezi örnekleri hazırlamak için floresan mikroskobu ile görüntü, doku kesitlerinde immunhistokimya gerçekleştirmek için ve görüntüleri yeniden verilir.

Fare Meme Bezinin Dondurulmuş Bölümler Dolaylı İmmünofloresan

Yetişkin kök hücre biyolojisini incelemek için ideal bir model fare kılı folikülüdür. Burada, fare sırt derisinin enzimatik sindirimini ve ardından FACS analizini kullanarak farklı saç folikülleri kök hücre ve epidermal keratinosit popülasyonlarını izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Dorsal Fare Cilt Saç Folikül Kök Hücreler ve epidermal keratinositler Ayırma

Bu protokol, adherent / mezenkimal meme epitel hücrelerinden ekstraselüler veziküller (EV) / ekzozomların arıtılması, nicelendirilmesi ve karakterize edilmesine yönelik yöntemleri ve meme bezi oluşturma yeteneğini luminal meme epitel hücrelerine aktarmak için kullanmayı açıklamaktadır. Gövde benzeri meme epitel hücrelerinden türetilmiş EVs / eksozomlar, bu hücre özelliğini EV'leri / eksosomları emen hücrelere aktarabilir.

Membran Bazal Epitelyal Hücreler ile Membran Luminal Hücreler Arasındaki Meme Bezi Oluşturma Yeteneğinin Ekstraselüler Vesiküller / Ekzozomlar Yoluyla Transferi

Fare prostat organoidleri farklılaşmayı düzenleyen mekanizmaları değerlendirmek için umut verici bir bağlam temsil eder. Bu makalede prostat organoidleri kurmak için geliştirilmiş bir yaklaşım açıklanır ve (1) organoidlerden protein lysate toplamak için yöntemler tanıttı, ve (2) tam monte konfokal mikroskopi için düzeltve leke organoidler.

Organoid Kültürü Kullanarak Fare Prostat Epitel Hücrelerinin Ayırt Etme Kapasitesinin Değerlendirilmesi

Bu deneysel protokol, BCSC'lerin meme kanseri hücre ve doku örneklerinden izolasyonunun yanı sıra BCSC fenotipini ve fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilecek in vitro ve in vivo testleri tanımlamaktadır.

İnsan Meme Kanseri Kök Hücrelerinin Hücre ve Doku Örneklerinden İzolasyonu ve Fonksiyonel Değerlendirmesi

Bu çalışma, primer insan meme epitel hücrelerini (HMEC'ler) küçük miktarlarda meme dokusundan verimli bir şekilde izole etmek ve büyütmek için daha kolay, zaman kazandıran ve ekonomik bir protokol bildirmektedir. Bu protokol, hem laboratuvar hem de klinik uygulamalar için birincil HMEC'lerin hızlı bir şekilde üretilmesi için uygundur.

Primer İnsan Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Keşfedin fare meme epitel HC11 ve EpH4 hücrelerinin farklılaşmasını, üç boyutlu kültürde mammosfer oluşumu ve sinyal iletimi yoluyla kanser tedavisi hedeflerinin belirlenmesi için.

Fare Meme Epitel HC11 ve EpH4 Hücrelerinin Farklılaşması

Daha fazla video keşfet