Frekans-Etki Alanı Tabanlı Kamera Sistemi ile O_2'nin Lüminesans Yaşam Boyu Görüntülemesi

En iyi elektron kabul edicisi olarak oksijen biyolojik sistemlerde çok önemli bir rol oynar. Bu protokol ile, bir optod kullanarak 2D oksijen dağılımı görüntüleyebilirsiniz. Yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğe ek olarak, bu yöntem ek bir referans boya gerektirmez, son derece sağlamdır ve yapısal görüntü nün kazanılmasını sağlar.

Bu yöntem, oksijenin ekoloji, tıbbi araştırmalar, biyobaskı ve basınca duyarlı baskı gibi önemli bir rol oynadığı çeşitli araştırma alanlarına uygulanabilir. Destek folyosu ve bıçak kaplama cihazı sürükleme hızına eklenen kokteyl miktarı optimizasyon ve uygulama gerektirdiğinden, optode imalatı zor olabilir. Bu video katkısı ile, bu güçlü tekniği diğer çalışma alanlarından araştırmacılar için erişilebilir hale getirmek istiyoruz.

Düzlemsel bir oksijen optodu hazırlamak için, temiz bir cam plaka üzerinde temiz bir tozsuz PET folyo düzeltmek için ilk su veya% 70 etanol bir film kullanın. Folyo üzerine temiz bir 120 mikrometre bıçak kaplama cihazı yerleştirin ve cihazın önünde sensör kokteyl bir çizgi uygulamak için cam bir pipet kullanın. Daha sonra, kokteyli eşit olarak yaymak için bıçak kaplama cihazını PET folyoüzerinde yavaşça ve düzgün bir şekilde sürükleyin.

Daha sonra bitmiş düzlemsel oksijene duyarlı optode'yi bir saat boyunca ortam havasında kurutun ve bir gecede 50 ila 60 santigrat derecede ısıtılmış bir dolapta kurulayın. Ertesi sabah yaklaşık 12 mikrometre kalınlığında bir tabaka elde edilecektir. Daha fazla kullanıma kadar ışıktan korunan optode saklayın.

Bir rhizo-sandviç odası hazırlamak için, bir uzun kenarı açık bırakarak bir cam plaka kenarları boyunca mikroskop slaytlar tutkal hafif kürebilir akrilik tabanlı anlık yapıştırıcı kullanın. Yapıştırılmış mikroskop slaytlar arasındaki boşluğa sığacak şekilde gerekli şekil ve boyuta düzlemsel optode kesin ve kaplamalı tarafı yukarı ile ön cam plaka nın içine optode yerleştirin. Optod folyobir kenarını cam plakaya bantlayın ve cam plaka ile optode folyo arasına musluk suyu ekleyin.

Yavaş yavaş optod cam yüzeyinde kendini düzeltmek için izin su damlacıkları üzerine folyo indirin ve dikkatle optode ve plaka arasında sıkışmış bir hava kabarcıkları kaldırmak için yumuşak bir doku kullanın. Daha sonra cam plakayı kurutun ve folyonun kalan kenarlarını tabağa bantlayın. Daha sonra, 0,5 milimetrelik elek tortusunu plaka boyunca mikroskop slayt boşlukları ile aynı kalınlığa eşit olarak dağıtmak için düz bir cam plaka kullanın.

İkinci cam plakanın hazneyi düzgün bir şekilde mühürlediğinden ve mikroskop slayt yüzeyine silikon gres uyguladığından emin olmak için mikroskop kaydırağının üst yüzeyini dikkatlice temizleyin. Daha sonra dikkatlice hava kabarcıkları oluşumunu kaçınarak su ince bir film ile tortu kapağı. Tortu üzerine bir örnek yerleştirmeden önce, littorella uniflora tek bir ateş dikkatlice yıkayın ve yaprakları üst açık taraftan dışarı yapışan bir tortu üzerinde ateş konumlandırın.

Numune yerinde yken, optodlu cam plakayı tortuüzerine yerleştirin ve optodu bitki kökleri ve çevresindeki tortuile yakın temas ta getirmek için hafif basınç uygulayın. Plakaları birbirine bağlamak ve dış kenarları kağıt mendille kurutmak için kelepçeler kullanın. Tekrar tekrar rhizo-sandviç montaj boyunca bitki sulu tutmak ve rizo-sandviç odası sıkmak için vinil elektrik bandı kullanmak için yapraklarına su birkaç damla ekleyin.

Sonra modelleme kil ve ek elektrik bandı ile kenarları mühür. Görüntülemeye hazırlanmak için, kuluçka sonrası kaplama folyoyu optod alanından çıkarın ve rhizo-sandwich odasını, optode ile cam duvarla akvaryum duvarına dik olarak yerleştirin. Rhizo-sandviç odasını duvara bastırmak için bir boşluk kullanın.

Akvaryum ve ilgi alanı önünde bir amaç ile donatılmış frekans etki alanı tabanlı parlaklık ömür boyu kamera yerleştirin. Gösterge boyasını kamera hedefine görüntülemek için uygun bir emisyon filtresi takın ve LED uyarma kaynağındaki ışık kılavuzunu düzeltin. Daha sonra kılavuzu, ilgi alanını kaplayan düzlemsel optode folyoyu eşit olarak aydınlatacak şekilde yerleştirin.

Görüntüleme yazılımında kamerayı seçin ve LED kontrol yazılımındaki LED'i seçin. LED'in dış transistör-transistör mantığı tarafından tetiklediğini doğrulamak için LED yoğunluğunu gerektiği gibi ayarlayın ve analog ve senkronize yi işaretleyin. Kamerayı manuel olarak odakla ve nesnel diyaframaçıklığını ayarlayın ve dahili modülasyon kaynağını, çıkış dalga formu için sinüs dalgasını, ek faz örneklemesini, sekiz fazlı örnekleri, faz sırası karşısında, A B okumasına dokunun ve beş kilohertz modülasyon frekansını ayarlayın.

Normalleştirilmiş parlaklık yoğunluğu görüntüsü için ilgi istatistikleri nin okunduğu bölge 0,68 ile 0,72 aralığında olana kadar pozlama süresini ayarlayın. Ardından, bir referans ölçüm serisinin edinimini başlatmak için yakalama referansını tıklatın. Optode kalibre etmek için, bilinen bir oksijen konsantrasyonu ile bilinen bir oksijen konsantrasyonu ile bir kalibrasyon akvaryumda su floş bir gaz karıştırma cihazı kullanın bir oksijen sensörü ile harici bir prob ile oksijen konsantrasyonu izleme.

Daha sonra, elde edilen kalibrasyon verilerine uygun bir eğri elde etmek için kalibrasyon odasındaki farklı oksijen konsantrasyonlarında bir dizi görüntü elde edin. Sistem kalibre edildiğinde, tesise ve diğer tüm ışık kaynaklarına ışınlama uygulayan ışıkları kapatın ve sinyalin yaşam boyu belirlenmesinde iyi bir sinyal-gürültü oranı için aşırı doymamış veya çok zayıf olduğundan emin olmak için görüntünün yoğunluğuna göre edinme süresini ayarlayın. Tüm oksijen ömrü görüntüleri elde edildiğinde, yapısal bir görüntü elde etmek için ışıkları geri açın ve elde edilen görüntülerin sonraki ölçekleme sağlamak için görüş alanında bir cetvel ile bir görüntü elde.

Numune görüntülenmeden önce, optod kalibre edilmelidir. Yarı-üstel çürümenin ardından, oksijen konsantrasyonu arttıkça ölçülen parlaklık ömrü azalır. Bu ilişki, basitleştirilmiş iki site modeli kullanılarak da tanımlanabilir.

Optod kalibre edildikten sonra, Littorella uniflora rizosferindeki oksijen konsantrasyonunun dağılımının 12 saat boyunca saniyede 500 mikromol foton kare ışık maruziyetinden sonra ve karanlıkta 12 saat sonra görüntülendiği bu görüntülerde gözlendiği gibi, ışıltı ömrünü görüntüleyerek oksijen konsantrasyonunun belirlenmesi mümkündür. Yaşam boyu görüntülere ek olarak, oksijen görüntülemenin yapısal görüntüyle tam olarak ilişkilendirilebilmesi için görüntüleme geometrisi sabit tutarken, yapısal görüntüler de dış aydınlatma altında elde edilebilir. Örneğin tek bir kök teki oksijen konsantrasyonprofilleri daha sonra karanlık ve ışıkta elde edilen görüntülerden çıkarılabilir.

Gereksiz yapıları önlemek için örnek matris ve optod arasında iyi bir temas olması çok önemlidir. Eğer şüphen varsa, sandviçi yeniden yap. Bir görüntünün zararsız bir şekilde anlık olarak elde edilmesi oksijen ortamının izlenmesini sağlar.

Yöntem de pH veya diğer analitler için diğer optodes ile kombine edilebilir. Sensör kokteyl kloroform içerdiğinden bir duman kaputunda optode imalatı gerçekleştirmek için emin olun. Düzlemsel optodes tortu mikrobiyal toplulukları tanımlamak için kullanılabilir.

Ve görüntülemeden sonra, sandviç mikrobiyal toplum analizi için bu sıcak noktalar örnek açılabilir.