Fiziksel ve İzotropik Genişleme Yoluyla İnsan Doku Bölümlerinin Nanoskobik Görüntülemesi

Nano ölçekli hassasiyetle, standart klinik doku bölümlerinde ilgi görüntü biyomolekülü için düşük maliyetli bir ölçüm, kısa genişleme patolojisi veya ExPath sıyoruz. ExPath, klinik doku bölümünü su yla şişme hidrojel ile kimyasal olarak aşılayarak ve daha sonra tedavi edilen numuneleri yaklaşık yüz kat genişleterek geleneksel ışık mikroskobunun kırınım sınırını aşarak, daha önce çakışan flüoressentetiketli biyomoleküllerin geleneksel optik mikroskopla ayrılmasını ve gözlemlemesine olanak sağlar. ExPath kullanıcıların yeni görüntüleme donanımyatırım gerek kalmadan, doku örneklerinde hastalık ile ilgili biyomoleküllerin nano ölçekli yapılandırmaları çalışma sağlar.

Böylece, hastalığın yeni anlayışlar sağlayan ve yeni tanı teşvik. Bu yöntem doku tipleri geniş bir dizi uygulanabilir ve kanser, beyin hastalığı, oto-immün hastalık gibi çeşitli karmaşık hastalıkların patogenezi içine yeni bir fikir sağlamak için kullanılabilir, ve diğerleri. Görsel gösteri, jelleme odasının inşası ve Proteinaz K sindiriminden önce ve sonra jellenmiş numunenin işlenmesi gibi kritik adımların doğru şekilde nasıl atılılabildiğini göstermek için önemlidir.

İlgi alan dokuyu ExPath uyumlu bir biçime dönüştürerek başlayın. FFPE klinik numuneleri ile çalışıyorsanız, 50ml konik bir tüp içinde örnek ile slayt yerleştirin ve Zylene 15ml ekleyin. Tüpü kaplayın ve yaklaşık 60rpm'de üç dakika boyunca yörüngesel bir çalkalayıcının üzerine yatay olarak yerleştirin.

Zylene başka bir 15 ml ile yıkama tekrarlayın. Sonra el yazması talimatlara göre, Etanol seyreltme bir dizi slayt yıkayın. Lekeli ve monte kalıcı slaytlar ile çalışıyorsanız, 50ml konik tüp her slayt yerleştirin, sonra Zylene ile kaplayın.

Bir jilet ile kapak fişini dikkatlice çıkarın. Daha sonra, ffpe klinik örnekleri ile aynı şekilde slayt süreci. OCT çözeltisinde sabitlenmemiş dondurulmuş doku slaytları ile çalışıyorsanız, aseton doku düzeltmek 20 santigrat on dakika, sonra yıkama başına on dakika boyunca 1X PBS çözeltisi ile üç kez 1X PBS çözeltisi ile yıkama.

Daha önce sabit ve dondurulmuş klinik numuneleri işliyorsanız, OTC çözeltisini eritmek için slaytları oda sıcaklığında iki dakika bekletin, ardından numuneyi yıkama başına beş dakika boyunca üç kez 1X PBS ile yıkayın. Biçim dönüştürmeden sonra, tüm örneklerde antijen alma gerçekleştirin. Isı 20 milimolar Sitrat çözeltisi 100 santigrat derece bir mikrodalga ve çözelti slayt yerleştirin.

Hemen bir kuluçka odasına konteyner aktarın ve otuz dakika boyunca 60 santigrat derece kuluçka. Örneği lekelemek için, slayttaki doku bölümünün etrafına bir sınır çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın. Bir petri kabına slayt yerleştirin, sonra 30 santigrat derece bir saat için tampon engelleme ile doku kuluçka.

Daha sonra, oda sıcaklığında veya 37 santigrat derece en az üç saat boyunca birincil antikor çözeltisi ile dokuları kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, bloke edici tampon ile üç kez doku yıkayın ve oda sıcaklığında en az bir saat veya 37 santigrat derece ikincil antikor çözeltisi içinde kuluçka. Engelleme tamponu ile yıkıntıları tekrarlayın, ardından geleneksel geniş alan mikroskobu veya tercih edilen diğer görüntüleme sistemini kullanarak floresan görüntüleme yapın.

El yazması talimatlarına göre demirleme çözümlerini hazırlayın. 100 ml petri kabına slaytlar yerleştirin, doku üzerinde demirleme çözeltisi pipet, ve oda sıcaklığında en az üç saat kuluçka. Daha sonra el yazması talimatlara göre jelleme çözeltisi hazırlayın.

Doku bölümünden fazla demirleme çözeltisini çıkarın ve kaydırağı petri kabına geri yerleştirin. Numuneye taze soğuk jelçözelti çözeltisi ekleyin ve karışımı 4 santigrat derecede otuz dakika kuluçkaya yatırın. Örnek etrafında slayt üzerinde bir oda inşa etmek için, ince bir elmas bıçak ile kapak cam parçaları keserek boşluk oluşturmak.

Su ile dokunun her iki tarafında spacers güvenli ve dikkatle slayt üzerine bir coverglass kapak yerleştirin, doku üzerinde hava kabarcıkları bindirme önlemek için emin olun. Daha sonra, iki saat boyunca nemli bir ortamda 37 santigrat derece örnek kuluçka. Bir jileti kapak kayması altında yavaşça kaydırarak ve jel yüzeyinden yavaşça kaldırarak jel haznesinin kapağını çıkarın.

Hacmi en aza indirmek için doku etrafında boş jel kırpın, oryantasyon izlemek için asimetrik jel kesmek için emin olun. Seyreltik Proteinaz K sindirim tampon bir ila iki yüz, tamamen jel batırmak için yeterli çözüm hazırlamak için emin olun. Daha sonra, 60 santigrat derece üç saat boyunca kapalı bir kapta çözelti ile örnek kuluçka.

Numune sindirim sırasında ayrışmazsa, yavaşça çıkarmak için bir jilet kullanın. Numuneyi istenilen görüntüleme sistemiyle uyumlu ve tamamen genişletilmiş jeli barındıracak kadar büyük bir kapta 1X PBS'ye aktarmak için yumuşak bir boya fırçası kullanın. Numuneyi PBS'de on dakika yıkayın ve istenirse 300 milimolar DAPI ile dinlendirin.

Numuneyi yıkama başına on dakika boyunca üç ila beş kez çift distile su hacmiyle yıkayarak numuneleri genişletin. Sonra floresan görüntüleme yapın. Bu protokol başarılı bir şekilde gerçekleştirilirse, numuneler mekanik homojenizasyondan sonra düz ve şeffaf bir jel olarak görünür ve suda 3 ila 4,5 kat daha genişleyebilir.

Beş mikrometre kalınlığındaff böbrek örneği 4.5 kez genişletildi ve 0.95 NA hedefi kullanılarak 63 nanometre çözünürlüğe ulaştı. Doku daha sonra bir genişleme patoloji uyumlu formatına dönüştürüldü ve Alfa Actinin 4 ve Vimentin için antikorlar ile lekeli, DAPI nükleer DNA görselleştirmek için, ve Buğday Germa Glutenin karbonhidrat etiketlemek için. Daha sonra numunenin görüntülanmasında iplik disk konfokal mikroskopisi kullanıldı.

Böbrek dokusu daha sonra tamamen suda genişletilmiş ve tekrar görüntülendi. Çatlama, bozulmalar ve etiketli hedeflerin kaybı yetersiz demirleme veya homojenizasyon sonucu olabilir. Hematoksilin ve eozin lekeli normal meme dokusu FFPE örneği olarak değerlendirildi, genişletildi, DAPI ile etiketlendi ve dönen disk konfokal mikroskobunda görüntülendi.

Düzeltilmemiş ve dondurulmuş böbrek dilimleri de bu protokol kullanılarak işlenmiştir. Doku soğuk aseton sabit ve Alpha Actinin 4, Vimentin, DAPI ve Buğday Germa Glutenin ile lekeli. Bu tekniği yaparken, jelleşme adımının zamanlamasının çok önemli olduğunu unutmamak önemlidir.

Erken jelleşme bozulmalara neden olabilir, genişlemeyi sınırlayabilir ve hedef moleküllerin kaybına neden olabilir. Bu işlemden sonra floresan görüntüleme, numunenin sindirimi ve genişlemesinden sonra mikroskop üzerinde yapılabilir. ExPath hem patolojilerde hem de ötesinde yaygın olarak uygulanabilir.

Araştırmacıların ilgi doku örneklerinde ince ayrıntıları görselleştirmelerini sağladığı için. Bu nedenle, araştırmacılarHastalıkların patogenezi veya biyolojik süreçlerin mekanizmaları yeni anlayışlar elde etmek için yardımcı olabilir.