Name: Primer Hepatosit Korunması için Dökme Damlacık Vitrifikasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Keşfedin, düşük kriyoprotektan konsantrasyonuyla büyük miktarlarda sıçan hepatositini buzsuz olarak vitrifiye etme yöntemini. Bu teknik, hücre canlılığını ve metabolik aktiviteyi koruyarak hepatosit transplantasyonu sonuçlarını iyileştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01DK096075, R01DK107875 ve R01DK114506) ve ABD Savunma Bakanlığı'ndan (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) gelen finansman büyük ölçüde kabul edilmektedir.

Bu protokol için birincil hepatosit izolasyonları Massachusetts General Hospital, Boston, Massachusetts, ABD'deki Hücre Kaynak Çekirdeği (CRC) tarafından gerçekleştirilmiştir. Hayvan protokolü (#2011N000111) Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Dökme damlacık vitrifikasyon
<ol><li>Vitrifikasyon çözümlerini hazırlayın.
	<ol>
<li>Vitrifikasyon solüsyonu 1 (V1) yapmak için Wisconsin Üniversitesi çözeltisi (UW) 17.0 mL sığır serum albumin (BSA) 40 mg ekleyin. Steril filtre V1 çözeltisi 0,22 μm filtre kullanarak ve 4 °C'de saklayın. NOT: UW yaygın olarak kullanılan bir organ koruma solüsyonudur. 50 g/L hidroksietil nişasta içerir, 35.83 g/L laktobiyonik asit, 3.4 g/L potasyum fosfat monobasic, 1.23 g/L magnezyum sülfat heptahidrat, 17.83 g/L raffinose pentahidrat, 1.34 g/L adenozin, 0.136 g/L allopurinol, 0.992 g/L toplam glutatyon, 51 g /L potasyum hidroksit ve sodyum hidroksit pH'ı 7.4'e ayarla.</li>
		<li>Vitrifikasyon solüsyonu 2 (V2) yapmak için 7.0 mL UW, 6.5 mL DMSO, 6.5 mL etilen glikol (EG), 40 mg BSA ve 5.48 g sakaroz birleştirin. Steril filtre V2 çözeltisi 0,22 μm filtre kullanarak. 3 mL şırıngada 3,5 mL steril filtrelenmiş V2 çözeltisi yükleyin ve 4 °C'de saklayın. NOT: EBM'lerin çözülmesini kolaylaştırmak için çözümler gerekenden daha büyük miktarlarda hazırlanır.</li>
	</ol></li>
	<li>Dökme damlacık vitrifikasyon aparatını hazırlayın.
	<ol>
<li>Karıştırma iğnesini hazırlamak için, önce karıştırma iğnesinin dış gri kolunun bir tarafını kesin ve sonra karıştırma iğnesinden çıkarmak için kılıfı açık bir şekilde bükün.</li>
		<li>Karıştırma iğnesinin girişlerinin üzerine iki adet 25 mm silikon boru kesiti kaydırın ve konumlarını tutkalla sabitleyin(Şekil 1A).</li>
		<li>İğneyi Şekil 1A'dagösterildiği gibi 20 mm (yani iç karıştırma sarlisinin uzunluğu) kesin. NOT: Karıştırma iğne uzunluğu iğne içindeki hacimle orantılıdır ve bu nedenle hepatositlerin yüksek EBM konsantrasyon çözeltisine maruz kalma süresini kontrol etmek için değiştirilebilir.</li>
		<li>Karıştırma iğnesinin kesme çıkışını 20 G enjeksiyon iğnesine yerleştirin(Şekil 1B). NOT: Enjeksiyon iğnesi boyutu damlacık boyutunu etkiler.</li>
		<li>Karıştırma iğnesi tertibatını otoklavlayarak sterilize edin.</li>
		<li>Steril bir Dewar'ı sıvı nitrojenle doldurun. Steril bir laminar akış hücre kültür başlık Dewar yerleştirmeden önce izopropanol ile Dewar dışında sterilize. NOT: Damlacıkların sıvı nitrojene doğrudan maruz kalmasında kontaminasyon önemli bir husustur. Mevcut protokolde sterilize edilmemiş sıvı azot kullanılarak herhangi bir kontaminasyon olmamasına rağmen, sıvı nitrojen16gerekirse steriliteyi sağlamak için filtrelenebilir veya ışınlanabilir.</li>
		<li>Damlacık toplama cihazını oluşturmak için sıvı nitrojen Dewar'ın iç çapı ile aynı dış çapa sahip bir huniyi 50 mL konik bir tüpe yerleştirin(Şekil 1C−E).</li>
		<li>Damlacık toplama cihazını büyük çömeçler kullanarak son dikey konumuna yavaşça bastırarak sıvı nitrojene batırın. Konik tüpün Dewar'ın alt kısmında dikey bir pozisyonda olduğundan emin olun (Şekil 1D−E). NOT: Huni konik tüpüzerinde takılı ve istirahat kalmalıdır. Sıvı azot seviyesi Şekil 1D'degösterildiği gibi hunin giriş yüksekliğinin 1 cm altında olmalıdır.</li>
		<li>Şırınga pompasının ayaklarından hücre kültürü başlık duvarından çıkan vidalara bir ip bağlayarak hücre kültürü başlığının duvarına dikey bir pozisyonda bir şırınga pompası monte edin.</li>
		<li>Sıvı nitrojen Dewar'ı damlacık toplama cihazıile dikey olarak monte edilmiş şırınga pompasının altına yerleştirin(Şekil 1E).</li>
	</ol></li>
	<li>EBM'lerle ön kuluçka.
	<ol>
<li>Taze izole sıçan hepatositleri elde ettikten sonra, Trypan mavi dışlama ile stok konsantrasyonu saymak ve almak 40 milyon canlı hepatosit. NOT: Süspansiyon içinde hepatositlerin nazik kullanımı hücre ölümünü önlemek için çok önemlidir.</li>
		<li>Frensiz 5 dk için 50 x g santrifüj.</li>
		<li>Süpernatant'ı aspire edin ve hepatositleri V1 çözeltisinin 3,4 mL'sinde yeniden askıya alın.</li>
		<li>3 dakika buz üzerinde kuluçka.</li>
		<li>Hepatositlere 150 μL DMSO ve 150 μL EG ekleyin ve hafifçe karıştırın.</li>
		<li>3 dakika buz üzerinde kuluçka.</li>
		<li>Yine hepatositlere 150 μL DMSO ve 150 μL EG ekleyin ve hafifçe karıştırın.</li>
		<li>3 mL şırıngada 3,5 mL yükleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Vitrifikasyon gerçekleştirin.
	<ol>
<li>Şırıngayı önceden kuluçkaya yatan hepatositler ve V2 solüsyonu ile şırınga pompası adaptörüne takın.</li>
		<li>Şırıngalar için iki kadın Luer kilit hortumu barb adaptörleri takın ve diken parçaları(Şekil 1F)üzerinde karıştırma iğne montaj silikon boru slayt.</li>
		<li>Tüm montajı şırınga pompasına yerleştirin (Şekil 1E).</li>
		<li>DMSO ve EG'nin hepatositlere son ilavesinden sonra üç dk, pompayı 2 mL/dk'dan başlatın.</li>
		<li>Sıvı nitrojene tüm hepatositler eklendikten sonra pompayı durdurun.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Kriyojenik depolama
<ol><li>Şekil1B'degösterildiği gibi, 20 G iğne kullanarak 50 mL konik bir tüpün kapağında 10 küçük delik açın ve kapağın dışını esnek bir filmle sarın. Bu artık sıvı azot buharlaşma kaçış sağlayan bir vana oluşturur.</li>
	<li>Vitrifiye hepatosit damlacıkları toplamak için, ilk sıvı azot Dewar hunisi çıkarın. Daha sonra, sıvı nitrojen damlacıkları içeren konik tüp almak ve yavaş yavaş konik tüp aşırı sıvı azot dökmek için uzun forceps kullanın.</li>
	<li>Konik tüpü delinmiş kapakla kapatın ve kapalı konik tüpü doğrudan sıvı nitrojen Dewar'a vitrifiye hepatosit damlacıklarıyla yerleştirin.</li>
	<li>Konik tüpü sıvı nitrojenden sıvı nitrojen buharı kriyotankına aktarın.</li>
</ol>3. Vitrifiye hepatosit damlacıklarının yeniden ısıtılmış
<ol><li>
Isınma çözeltisini hazırlayın.
	<ol>
<li>100 mL DMEM hepatosit kültür medyasında 17.13 g sakaroz çözünerek yeniden ısınma çözeltisi yapın. Steril filtre 0.22 μm filtre ve 37 °C sıcak kullanarak rewarming çözeltisi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hepatositleri ısıt.
	<ol>
<li>Konik tüpü kriyoktan vitrifiye hepatositlerle alın ve sıvı nitrojen Dewar ile hücre kültürüne taşıyın.</li>
		<li>Kapağı hafifçe gevşetin ve konik tüpü sıvı nitrojene geri koyun.</li>
		<li>Vitrifiye hepatosit damlacıklarını boş bir kabın üzerine ekleyin, anında sıcak (37 °C) yeniden ısınma solüsyonu ekleyin ve hemen 10 s'lik karıştırın. NOT: Isınma sırasında donma önlemek için hızlı bir şekilde çalışmakönemlidir. Çalışma gereksinimlerine bağlı olarak, tüm vitrifiye damlacıklar birkaç aynı anda yeniden ısıtılabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Yeniden ısınma çözeltisini boşaltın.
	<ol>
<li>Isınma çözeltisini hepatositlerle iki 50 mL konik tüpe bölün.</li>
		<li>Frensiz 4 °C'de 100 x g'de 2 dk'lık iki konik tüpü santrifüj edin.</li>
		<li>Konik tüpün mezuniyet işaretini referans olarak kullanarak toplam 12,5 mL hacim bırakmak için süpernatantı aspire edin ve yeniden ısınma çözeltisini %50'ye seyreltmek için konik tüp başına 12,5 mL buz gibi dMEM ekleyin.</li>
		<li>Hepatositleri yeniden askıya alın ve 3 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Isınma çözeltisini %25'e seyreltmek için konik tüp başına 25 mL buz gibi DMEM ekleyin.</li>
		<li>Frensiz 4 °C'de 50 x g'de 5 dk santrifüj.</li>
		<li>Supernatant aspire ve kullanım için istenilen kültür ortamı2 mL hepatositler resuspend. NOT: Yoğunluk gradyan santrifüj, istenirse hücre süspansiyonundaki ölü hepatositleri çıkarmak için kullanılabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+and+bioartificial+liver+devices%3A+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Artificial and bioartificial liver devices: present and future.</a> Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).</li>
<li>Fox, I. J., Chowdhury, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+transplantation%3A+Hepatocyte+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).</li>
<li>Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Status+of+Hepatocyte+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Current Status of Hepatocyte Transplantation.</a> Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).</li>
<li>Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+cryopreservation%3A+is+it+time+to+change+the+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy.</a> World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).</li>
<li>Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+cryopreservation+and+thawing+protocol+for+human+hepatocytes+for+use+in+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation.</a> Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).</li>
<li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles of cryopreservation.</a> Methods in Molecular Biology. 368, 39(2007).</li>
<li>Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation%3A+An+emerging+paradigm+change%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation: An emerging paradigm change.</a> Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).</li>
<li>Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+common+cryoprotectants+on+critical+warming+rates+and+ice+formation+in+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions.</a> Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).</li>
<li>Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+as+an+approach+to+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Vitrification as an approach to cryopreservation.</a> Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).</li>
<li>Demirci, U., Montesano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+encapsulating+droplet+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell encapsulating droplet vitrification.</a> Lab on a Chip. 7 (11), 1428(2007).</li>
<li>El Assal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-Inspired+Cryo-Ink+Preserves+Red+Blood+Cell+Phenotype+and+Function+During+Nanoliter+Vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification.</a> Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).</li>
<li>Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+cryopreservation+of+cells+by+rapid+freezing+of+sub-%CE%BCl+drops+using+inkjet+printing--cryoprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing--cryoprinting.</a> Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).</li>
<li>Samot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+banking+in+living+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Blood banking in living droplets.</a> PloS One. 6 (3), 17530(2011).</li>
<li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Non-Contact+Vitrification+of+Cell-Laden+Droplets+Based+on+Cell+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing.</a> Scientific Reports. 5 (1), (2016).</li>
<li>de Vries, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+Droplet+Vitrification%3A+An+Approach+to+Improve+Large-Scale+Hepatocyte+Cryopreservation+Outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome.</a> Langmuir. , (2019).</li>
<li>Parmegiani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterilization+of+liquid+nitrogen+with+ultraviolet+irradiation+for+safe+vitrification+of+human+oocytes+or+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos.</a> Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).</li>
<li>Best, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryoprotectant+Toxicity%3A+Facts%2C+Issues%2C+and+Questions%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions.</a> Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar rakip mali çıkarları beyan. Dr. de Vries, Weng, Toner, Tessier ve Uygun'un bu çalışmayla ilgili geçici patent başvuruları vardır. Dr. Uygun, organ koruma teknolojisini geliştirmeye odaklanmış organ çözümlerine finansal bir ilgi sahiptir. Tüm araştırmacının çıkarları, çıkar çatışması politikalarına uygun olarak MGH ve Partners HealthCare tarafından yönetilir.

Hepatositlerin yavaş donma sonucu ile kriyopreservation azaltılmış canlılık ve metabolik fonksiyon. Vitrifikasyon klasik kriyopreservation için umut verici bir alternatif sunuyor, dondurucu yaralanma tamamen kaçınılır gibi9. Ancak, kritik soğutma oranını düşürmekiçin EBM'ler ile kuluçka öncesi 8 gereklidir. Sonuç olarak, vitrifikasyon CpA toksisitesi17 tarafından engellenir ve küçük numune hacimleri ile sınırlıdır. Bu sınırlamaları aşma çabalarında, ...

Hepatositkriyat kriyopreservation sonra hücre canlılığı ve metabolik fonksiyon kaybı hala klinik uygulamaları sınırlayan önemli bir konudur1,2,3. Hepatosit kriyopatinin kriter yöntemi, hepatositlerin EBM (dimetil sülfoksit [DMSO], glikoz ve albumin) ile önceden kuluçkaya yatırılarak ve daha sonra kontrollü oranda dondurularak (yaklaşık 1 °C/dk) yavaş donma yöntemidir. kriyojenik sıcaklıklar4,5. Birçok bildirilen optimizasyonlar rağmen, Buz oluşumunun donma ve mekanik stres sırasında zararlı ozmotik dengesizlikler ile birlikte EBM toksisitesi yavaş donma temel sakıncaları kalır6,7.
Vitrifikasyon, buz oluşumu nedeniyle oluşan bu yaralanmada yavaş donma üzerinde bir avantaj sağlar tamamen cam durumuna su doğrudan faz geçiş ile kaçınılır6. Ancak, saf suyun cam geçiş sıcaklığına (-137 °C) ulaşmak için, su cam geçiş sıcaklığının üzerinde buz oluşumunu önlemek için saniyede bir milyon santigrat derece (yani kritik soğutma hızı) sırasına göre soğutulmalıdır8 . EBM'lerin eklenmesi kritik soğutma hızını düşürebilir ve sulu çözeltilerin cam geçiş sıcaklığını artırabilir9. Ancak, yüksek EBM konsantrasyonları ile bile (örneğin, 40% v / v DMSO veya daha yüksek) hızlı soğutma oranları yine de başarılı vitrifikasyon için gereklidir8,9.
Gerekli soğutma hızları ve yüksek EBM konsantrasyonları vitrifikasyon un iki büyük dezavantajına neden olmaktadır. İlk olarak, hızlı soğutma sağlamak için, örnekler düşük bir termal kütleye sahip olmalıdır. İkinci olarak, ozmotik yaralanmayı önlerken yüksek EBM konsantrasyonlarına ulaşmak için, EBM'ler yavaş yavaş tanıtılmalı ve hücre içi ve hücre dışı bölmeler arasında tam olarak dengelenmelidir6. Bu toksik EBM'lere hücrelerin maruz kalma süresini artırır. Birlikte, bu vitrifikasyon bir seferde birkaç küçük boyutlu örnekleri (mikrolitre) ile sınırlı hantal bir süreç yapar. Damlacık vitrifikasyon bu kısıtlamalar için potansiyel bir çözüm olarak önerilmiştir. Küçük hücre yüklü damlacıkları (nanolitreler) sıvı nitrojene maruz bırakarak soğutma hızı önemli ölçüde artar, bu da sonuç olarak EBM konsantrasyonunda önemli bir azalma sağlar10,11,12 ,13,14. Birden fazla yüksek frekanslı damlacık üreten nozullar potansiyel olarak aynı anda kullanılabilir olsa da, son derece küçük damlacık boyutu dakikada mikrolitre10için üretim sınırlar , hangi büyük hücre verimli vitrifikasyon engelleyen dakikada mililitre sırasına göre büyüklükleri daha yüksek işleme oranları ile hacimleri.
Son zamanlarda vitrifikasyon bu doğal sınırlamalar toplu damlacık vitrifikasyon15ile aşılabilir gösterilmiştir. Bu yeni yöntem, tüp bebekleşmeden hemen önce %7,5 v/v etilen glikol ve DMSO hücre içi CpA konsantrasyonunu yoğunlaştırmak için hızlı ozmotik dehidratasyondan yararlanarak toksik EBM konsantrasyonlarının tam dengelenmesi ihtiyacını ortadan kaldırır. Hücresel dehidratasyon, hepatositlerin yüksek hücre dışı CpA konsantrasyonuna kısa bir maruziyeti ile akışkan bir cihazda gerçekleştirilir. Bu maruz kalma hızlı ozmotik dehidratasyonneden olsa da, hücrelere yaymak için yüksek EBM konsantrasyonu için çok kısa. Dehidratasyondan hemen sonra hücreler sıvı nitrojenle doğrudan vitrifiye edilen damlacıklarla yüklenir. Bu yöntem yüksek hücre dışı EBM konsantrasyonlarının tam hücre içi alım ihtiyacını ortadan kaldırırken, yüksek hücre dışı EBM konsantrasyonu büyük boyutlu damlacıkların vitrifikasyonunu sağlar ve bu da minimum EBM toksisitesi ile yüksek üretim hacimleri sağlar.
Damlacık vitrifikasyon koruma dan sonra doğrudan ve uzun vadeli canlılık artırır, yanı sıra yavaş donma tarafından klasik kriyopreservation göre birincil sıçan hepatositlerin morfolojisi ve metabolik fonksiyonu15. Bu el yazması, birincil sıçan hepatositlerinin toplu damlacık vitrifikasyonu için metodolojik ayrıntıları sağlar.

<table><tbody><tr><td>BD Tek Kullanımlık Luer-Lok Uçlu 3 mL Şırınga</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>Beher</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS1000-250</td><td></td></tr><tr><td>Belzer UW Soğuk Hava Deposu Çözümü</td><td>Hayata Köprü</td><td>BUW-001</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Dişi Luer - 1/16 "düşük profilli yarı sert boru dikeni, PP</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45508-12</td><td></td></tr><tr><td>Kriyojenik depolama tankı / Kriyotank</td><td>Şeması Endüstriler</td><td>MVE 800</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, toz, yüksek glikoz, piruvat</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>Etilen Glikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107-21-1</td><td></td></tr><tr><td>Ekstra uzun forseps</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-316C</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Yüksek Hızlı Kolay Okuyucu Plastik Santrifüj Tüpleri - Düz üst kapatma</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-18</td><td></td></tr><tr><td>Olta</td><td>Stren</td><td>SOFS4-15</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen</td><td>Airgas</td><td>7727-37-9</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Platinle Kürlenmiş Silikon Boru, L/S 14</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-14</td><td></td></tr><tr><td>3HPW1</td><td>Grainger</td><td>3WRL7</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Polipropilen Toz Hunisi</td><td>ThermoFisher</td><td>4252-0100</td><td></td></tr><tr><td>İğne 20 ga</td><td>Becton Dickinson (BD)</td> ile Kullanım İçin Karışım İpuçları <td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M - Esnek film</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş Bıçağı</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06369-18</td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>Steriflip steril filtre</td><td>Fisher Scientific</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz (Kristal/Sertifikalı ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Pompası</td><td>Yeni Dönem Pompa Sistemleri A.Ş.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td>Termo-Şişe Tezgah Üstü Sıvı Nitrojen</td><td>Kabı ThermoFisher</td><td>2122</td><td></td></tr></tbody></table>

primer hepatosit korunması için dökme damlacık vitrifikasyon

Bulk Droplet Vitrification for Primary Hepatocyte Preservation

Vitrifikasyon, biyolojik numunelerin klasik yavaş donma (yaklaşık 1 °C/dk) kriyopreservation için umut verici bir buzsuz alternatiftir. Vitrifikasyon, zararlı buz oluşumunu önlerken suyun cam faza geçişini sağlamak için son derece hızlı soğutma hızları gerektirir. Kriyoprotektif ajanlar (CPA) ile pre-inkübasyon biyolojik numunelerin kritik soğutma hızını azaltabilir rağmen, yüksek konsantrasyonlarda genellikle vitrifikasyon ile buzsuz kriyopreservation sağlamak için gereklidir. Sonuç olarak, vitrifikasyon EBM toksisitesi tarafından engellenir ve hızlı soğutulabilen küçük numuneler ile sınırlıdır. Son zamanlarda bu doğal sınırlamalar toplu damlacık vitrifikasyon ile aşılabilir gösterilmiştir. Bu yeni yöntem kullanılarak, hücreler ilk olarak düşük hücre içi EBM konsantrasyonu ile ön kuluçkaya yatırılır. Hızlı ozmotik dehidratasyondan yararlanan hücre içi EBM, toksik EBM konsantrasyonlarını tam olarak dengelemeye gerek kalmadan vitrifikasyonun hemen öncesinde yoğunlaşmıştır. Hücresel dehidratasyon akışkan bir cihazda gerçekleştirilir ve sıvı nitrojen vitrifiye büyük boyutlu damlacıkların sürekli yüksek iş üretimi ile entegre. Minimum EBM toksisitesi ile bu buzsuz kriyopreservation yöntemi büyük hücre miktarları için uygundur ve klasik yavaş dondurucu kriyopreservation ile karşılaştırıldığında artmış hepatosit canlılık ve metabolik fonksiyon sonuçları. Bu el yazması, başarılı toplu damlacık vitrifikasyon yöntemlerini ayrıntılı olarak açıklamaktadır.

Beş farklı sıçan karaciğerinden taze izole primer hepatositler, literatürde bildirilen üstün yavaş dondurma protokolleri kullanılarak toplu damlacık vitrifikasyonunun klasik kriyopreservation ile doğrudan karşılaştırılması için kullanılmıştır4, 5. Kısacası, hepatositler UW'de BSA (2.2 mg/mL), glikoz (333 mM) ve DMSO ( v/v) ile takviye edildi ve kontrollü bir dondurucu kullanılarak donduruldu. -196 °C'de muhafaza edildikten sonra numuneler ılık su banyosunda çözü...

Bu el yazması, büyük miktarlarda sıçan hepatositleri için buzsuz kriyopreservation yöntemini açıklar ve böylece birincil hücreler düşük konsantrasyonda kriyoprotektif ajanlarla önceden kuluçkaya yatırılır ve büyük damlacıklarda vitrifiye edilir.

Primer Hepatosit Korunması için Dökme Damlacık Vitrifikasyon

Vitrification is a promising ice-free alternative for classic slow-freezing (at approximately 1 &#176;C/min) cryopreservation of biological samples. ...

Vitrifikasyon genellikle kriyoprotektif ajanların toksisitesi ile işlenir. Ve hızlı soğutulabilen küçük numunelere tekrar yerleştirilir. Bu protokol, kuluçka öncesi dönemde düşük EBM konsantrasyonu kullanırken büyük hücre limiktarlarının vitrifikasyonunu sağlar.Hızlı ozmotik dehidratasyon kullanılarak, düşük mahzenler arası CPA vitrifikasyon öncesinde sıvı cihazda yoğunlaşmıştır. Bu, toksik EBM konsantrasyonlarını tam olarak dengeleme ihtiyacını ortadan kaldırır. Toplu damlacık vitrifikasyon, kriyopreservation sonrası yetersiz sonuçlar la engellenen hepatosit transplantasyonu ve biyo-yapay karaciğer cihazlarının kullanımı için uygun ve metabolik olarak aktif hepatositler sağlayabilir.Bu yöntem potansiyel olarak büyük miktarlarda kriyo-korunması gereken diğer hücre tiplerinin vitrifikasyonu için uyarlanabilir;örneğin kan ürünleri veya kök hücreler gibi. Başlamak için, Wisconsin Üniversitesi Çözüm Üniversitesi 17.0 mililitre BSA 40 miligram ekleyerek vitrifikasyon Çözüm 1 olun. Çözeltiyi steril filtrelemek ve dört santigrat derecede depolamak için 0,22 mikrometre filtre kullanın.Protokolde açıklandığı gibi vitrifikasyon Çözüm 2 yapın. Ve steril filtre 0.22 mikrometre filtre ile. Üç mililitrelik şırıngada 3,5 mililitre steril filtrelenmiş V2 Solüsyonu yükleyin ve dört santigrat derecede saklayın.Toplu damlacık vitrifikasyon aparatını hazırlamak için, ilk olarak, karıştırma iğneleri dış gri kollu bir tarafı boyunca kesilmiş. Karıştırma iğnesinden çıkarmak için kılıfı açık bükün. Daha sonra, karıştırma iğnesini 20 milimetre uzunluğunda kesin ve kesme çıkışını 20 gauge enjeksiyon iğnesine takın.Karıştırma iğnesinin girişlerinin üzerine iki 25 milimetrelik silikon boru kesitlerini kaydırın. Ve pozisyonlarını tutkalla sabitleyin. Otoklavlayarak bu montajı sterilize edin.Steril bir Dewar şişeyi sıvı nitrojenle doldurun. Ve steril bir Laminer akış hücre kültürü başlık yerleştirmeden önce izopropanol ile dış sterilize. Sıvı nitrojen ciddi yanıklara neden olabilir gibi uygun kişisel koruyucu ekipman giymek emin olun.Damlacık toplama cihazı oluşturmak için 50 mililitre konik tüp içine, Dewar iç çapı ile aynı dış çapı ile bir huni ekleyin. Büyük forceps kullanarak, damlacık toplama cihazını son dikey pozisyonunda sıvı nitrojenle yavaşça aşağı doğru bastırın. Konik tüpün Dewar'ın alt kısmında dikey konumda olduğundan emin olun.Ve sıvı nitrojen seviyesi huninin kenarından bir santimetre daha düşüktür. Hücre kültürü başlık duvarında dikey bir pozisyonda bir şırınga pompası monte etmek için, hücre kültürü başlık duvardan çıkıntılı vidalar için şırınga pompası ayaklarından bir dize kravat. Daha sonra, dikey monte şırınga pompası altında damlacık toplama cihazı ile sıvı nitrojen Dewar yerleştirin.Taze izole sıçan hepatositler elde ettikten sonra, tri-pan mavi dışlama ile stok konsantrasyonu saymak. Ve 40 milyon canlı hepatositi 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hepatositleri 50 kez G'de beş dakika ara vermeden santrifüj edin.Süpernatant aspire. V1 Solution'ın 3,4 mililitresinde hepatositleri yeniden askıya alın. Ve üç dakika boyunca buzda kuluçkaya yat.Daha sonra, 150 mikrolitre DMSO ve 150 mikrolitre EG ekleyin;hafifçe karıştırın ve üç dakika boyunca tekrar buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Hepatositlere 150 mikrolitre DMSO ve 150 mikrolitre EG ekleyin ve hafifçe karıştırın. Üç mililitrelik şırınga bu karışımın 3,5 mililitre yükleyin.Şırıngayı önceden kuluçkaya yatan hepatositlerle ve V2 Solüsyonu ile şırınga pompa adaptörüne yerleştirin. Şırıngalara iki Dişi Luer Lock hortum-barb adaptörü takın. Ve karıştırma iğne montaj silikon boru diken parçaları üzerinde kaydırın.Tüm bu montajı şırınga pompasına yerleştirin. DMSO ve EG'nin hepatositlere son baskısından üç dakika sonra, pompayı dakikada iki mililitreden başlatın. Tüm hepatositler sıvı nitrojen pompa durdurmak eklenmiştir sonra.20 gauge iğne kullanarak, 50 mililitrelik konik bir tüpün kapağında 10 küçük delik açın. Ve esnek bir film ile kapağın dışında sarın, sol sıvı azot buharlaşma kaçış sağlayacak bir vana oluşturarak. Vitrifiye hepatosit damlacıkları toplamak için, ilk sıvı nitrojen ile Dewar hunisi çıkarın.Daha sonra, uzun forceps ile, sıvı nitrojen damlacıkları içeren konik tüp çıkarmak ve yavaş yavaş konik tüp aşırı sıvı nitrojen dökün. Konik tüpü delinmiş kapakla kapatın ve kapalı konik tüpü doğrudan sıvı nitrojenle Dewar'a vitrifiye hepatosit damlacıklarıyla yerleştirin. Son olarak, konik tüpü sıvı nitrojenden sıvı nitrojen kriyotanka aktarın.Sakaroz ve DMEM hepatosit kültür ortamı ile yeniden Isınma çözeltisi yaptıktan sonra steril filtre için 0,22 mikrometre filtre kullanın. Sonra 37 santigrat dereceye ısıtın. Hepatositleri yeniden ısıtmak için konik tüpü vitrifiye hepatositlerle kriyoktan çıkarın ve sıvı nitrojen Dewar ile alt kültür başlığına taşıyın.Kapağı hafifçe gevşetin ve konik tüpü sıvı nitrojene geri yerleştirin. Hızlı çalışma, boş bir kabın tüm vitrifiye hepatosit damlacıkları ekleyin, sonra hızlı bir şekilde 10 saniye karıştırarak 37 derece Santigrat sıcak ısınma çözeltisi 100 mililitre ekleyin. Damlacıklar sıvı nitrojenden çıkarıldığında en derin dondurucu soğuklar saniyeler içinde gerçekleşir, eğer damlacıklar hızla ısınmazsa.Bu nedenle, karıştırma sırasında damlacıklara yeniden ısınma ortamını doğrudan eklemek çok önemlidir. Hepatositlerle yeniden Isınma çözeltisini 50 mililitrelik konik tüplere bölün. Tüpleri 100 kez G'de dört santigrat derecede iki dakika santrifüj edin.Referans olarak tüpün mezuniyet işaretini kullanarak toplam 12,5 mililitre hacim bırakmak için süpernatants aspire. Isınma çözeltisini %50'ye seyreltmek için konik tüp başına 12,5 mililitre buz gibi donan DMEM ekleyin. Yeniden askıya alın ve üç dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yat.Isınma çözeltisini %25'e seyreltmek için konik tüp başına 25 mililitre buz gibi donan DMEM ekleyin. Mola vermeden 4 derece 50 kez G beş dakika santrifüj sonra, supernatant aspire ve istenilen kültür ortamının iki mililitre hepatosit yeniden askıya. Membran bütünlüğünü belirleyen üçlü mavi dışlama testi ile ölçüldüğünde, toplu damlacık vitrifikasyonu doğrudan koruma sonrası hepatosit canlılığı %79 sonuçlandı bu klasik optimize kriyopreservation sonrası %68'lik canlılıktan önemli ölçüde daha yüksekti.Toplu damlacık vitrifikasyon verimi% 56 olan% 10 daha yüksek ve klasik kriyopreservation daha tutarlı idi. Uzun süreli üniversite ve sandviç kültürlerinde presto-tutkal metabolizasyon teşheciliği kullanılarak, hepatositlerde metabolik aktivite, klasik kriyopreservation sonra toplu damlacık vitrifikasyon sonra önemli ölçüde daha yüksek olarak ölçüldü. Albumin sentezi, hepatositlerin sentetik fonksiyonunun en yaygın kullanılan parametresi olarak, toplu damlacık vitrifikasyon sonra yaklaşık iki kat daha büyük oldu, sonra klasik kriyopreservation sonra.Üre üretimi bir haftalık kültürde hepatosit detoksifikasyon fonksiyonunu ölçmek için kullanılmıştır. Dökme damlacık vitrifiye hepatositlerde üre üretimi klasik kriyotosit hepatositlerden önemli ölçüde daha yüksekti. Toplu damlacık vitrifikasyonundan sonra tutarlı sonuçlar elde etmek için, EBM'lerin kuluçka öncesi dönemdeki zamanlamanın ve bu protokolde ayrıntılı olarak belirtildiği şekilde yeniden ısınmanın tam olarak takip edilmesi önemlidir.Vitrifiye hepatosit damlacıkları yeniden ısıttıktan sonra, daha iyi bir boyutlandırma süspansiyonu ile sona erecek ve bu da sanki taze izole edilmiş gibi aynı şekilde kullanılabilir. Geliştirilmiş bir koruma yöntemi olarak, toplu damlacık vitrifikasyon araştırma ve klinik uygulamalar için kullanılabilirlik pri-ma artırabilir.

bulk-droplet-vitrification-for-primary-hepatocyte-preservation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

İnsan hepatositlerini ve parankimal olmayan karaciğer hücrelerini aynı donörden izole etmek için bir teknik tanımlanmıştır. Farklı karaciğer hücresi tipleri, fonksiyonel karaciğer modelleri ve doku mühendisliği için temel oluşturur. Bu yeni yöntem, karaciğer hücrelerini yüksek verim ve canlılıkta izole etmeyi amaçlamaktadır.

İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Bu iletişim kuralının amacı yüksek canlılık ve yüksek verim tetkikine ve sinüsoidal endotel hücreleri karaciğer elde etmektir. Bu bir tür IV collagenase eriyik yolu ile portal ven, hepatositlerin ve sinüsoidal endotel hücreleri elde etmek için farklı aralıklarla tarafından takip ile karaciğer Ventriküler tarafından gerçekleştirilir.

Arıtma tetkikine ve fare karaciğer sinüsoidal endotel hücrelerinden perfüzyon

Burada, sağlıklı ve fonksiyonel birincil fare tetkikine yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. Hepatik doğmakta olan protein sentezi tarafından radyoaktif olmayan etiketleme substrat algılamak için yönergeler protein sentezi karaciğer homeostazı enerji metabolizması bağlamında temel mekanizmaları anlamanıza yardımcı olmak için sağlanmıştır.

Birincil fare tetkikine yalıtım doğmakta olan Protein sentez analiz radyoaktif L-azidohomoalanine etiketleme yöntemi tarafından için

3-b "karaciğer-on-a-chip" enfeksiyon hepatit B virüs ile deneyler gerçekleştirmek için adım adım bir kılavuz sağlamak için bu protokolü hedefidir.

"Karaciğer-on-a-Chip" kültürleri birincil tetkikine ve Kupffer hücreleri için Hepatit B virüs enfeksiyonu

Burada sunulan değiştirilmiş bir kollajenaz perfüzyon tekniği kullanılarak yetişkin fare karaciğerlerinden fare hepatositizolasyon için bir protokoldür. Ayrıca açıklanan bir 3D kollajen sandviç ayarında hepatosituzun kültürü yanı sıra safra kanaliküler oluşumu ve tedaviye yanıt çalışma için sitoskeletal bileşenlerin immünetiketleme.

İzolasyon ve 3D Kollajen Sandviç Kültürü Birincil Fare Hepatositler Safra Canaliküler Oluşumunda Sitoskeleton Rolünü Çalışma In Vitro

Primer hepatositler, karaciğer yanıtını ve metabolizmasını in vitro olarak incelemek için değerli bir araçtır. Ticari olarak temin edilebilen reaktifler kullanılarak, fare primer hepatosit izolasyonu için geliştirilmiş bir zaman ve emek verimli protokol geliştirilmiştir.

Fare Primer Hepatosit İzolasyonu için Geliştirilmiş Zaman ve İş Gücü Verimli Protokolü

Bu protokol, özel bir intravenöz kateter, standartlaştırılmış steril tek kullanımlık tüp, gerçek zamanlı izleme ile tamamlanan sıcaklık kontrolü ve izole primer sıçan hepatositlerinin yaşayabilirliği, verimi ve işlevselliğindeki tutarlılığı artırmak için iki aşamalı kollajenaz perfüzyon prosedürü için bir alarm sisteminin kullanımını detaylandırmaktadır.

Primer Sıçan Hepatositlerinin Çok Parametreli Perfüzyon Kontrolü ile İzolasyonu

Yağ asidi β-oksidasyonu, hepatositler de dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipinde enerji üretmekten sorumlu önemli bir metabolik yoldur. Burada, 14C etiketli palmitik asit kullanarak taze izole edilmiş primer hepatositlerde yağ asidi β-oksidasyonunu ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Yeni İzole Edilmiş Fare Hepatositlerinin Süspansiyonunda Yağ Asidi β-Oksidasyonunun Ölçülmesi

Bu protokol, primer fare hepatositlerini karaciğerden izole etme ve karaciğerin kalıtsal bir metabolik hastalığı ile ilişkili terapötik bir hedef geni bozmak için CRISPR-Cas9'u ribonükleoproteinler ve mRNA olarak elektroporasyon tekniklerini açıklar. Tarif edilen yöntemler, elektroporasyondan sonra yüksek canlılık ve yüksek düzeyde gen modifikasyonu ile sonuçlanır.

Cas9 Ribonükleoproteinlerin ve mRNA'nın Yeni İzole Edilmiş Primer Fare Hepatositlerine Elektroporasyon Aracılı Verilmesi

Lipid yüklü hepatositler karaciğer rejenerasyonuna özgüdür, ancak genellikle yoğunluk gradyan santrifüjleme ile kaybolurlar. Burada, steatotik hepatositleri tutan ve farelerde parsiyel hepatektomi sonrası rejenere hepatositlerin temsili popülasyonlarını veren optimize edilmiş bir hücre izolasyon protokolü sunuyoruz.

Farelerde Parsiyel Hepatektomi Sonrası Rejenere Hepatositlerin İzolasyonu

Bu protokol, bir sıçan modelinde optimize edilmiş iki aşamalı kollajenaz karaciğer perfüzyon tekniği sunar ve in vitro uzun süreli 3D organoid kültürü için izole hepatositlerin kullanımını gösterir.

Sıçan Karaciğer Perfüzyonu ve Primer Hepatosit İzolasyonu: Son Teknoloji 3D Organoid Kültürü İçin Çok Önemli Eski Bir Prosedür

Keşfedin, düşük kriyoprotektan konsantrasyonuyla büyük miktarlarda sıçan hepatositini buzsuz olarak vitrifiye etme yöntemini. Bu teknik, hücre canlılığını ve metabolik aktiviteyi koruyarak hepatosit transplantasyonu sonuçlarını iyileştirir.

Primer Hepatosit Korunması için Dökme Damlacık Vitrifikasyon

Daha fazla video keşfet