Name: Mitotik Mil Pertürbasyonları Sonrası Metafaz Zamanlaması ve Hücre KaderiniN Dinamiği Nin Dinamiği Nin Dinamitini Değerlendirmek Için Canlı Hücre Görüntülemesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Öğrenin, canlı hücre görüntüleme ile mitotik mil dinamiklerini ve hücre bölünme sürecini analiz edin. Bu yöntem, anti-mitotik ilaçların iğne oluşumu üzerindeki etkilerini değerlendirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DLM bir NSF GRFP tarafından desteklenir. ALM, Smith Aile Biyomedikal Araştırmada Mükemmellik Ödülü'nden gelen fonla desteklenmiştir.

1. RFP-Histon 2B (RFP-H2B) ve α-tubulin-EGFP (tub-EGFP) ifade eden hTERT-RPE-1 hücrelerinin üretimi
NOT: Tüm adımlar aseptik teknikleri takip eder ve biyogüvenlik seviyesi II+ (BSL2+) güvenlik kabininde gerçekleşir.
<ol><li>293T hücrelerinin uygun lentiviral plazmidlerle lipid bazlı transfeksiyon dağıtım sisteminin üretici talimatlarına göre transfeksiyonu ile ilgi genlerini (α-tubulin-EGFP ve RFP-H2B) taşıyan retrovirüs üretin.<ol>
<li>1. Gün: Hücre kültürünün orta sını alt-confluent 293T hücrelerinden aspire etmek için tek kullanımlık cam Pasteur pipetkullanın ve 5 mL PBS ekleyerek artık orta sıyrıklı salin (PBS) ile artık ortayı yıkayın. PBS'yi plaka alt kısmında dağıtmak için girdap, ardından PBS'yi steril tek kullanımlık cam Pasteur pipetiyle aspire edin.</li>
		<li>37 °C'ye önceden ısıtılmış 2 mL 0,05 tripsin ekleyin ve kabı 37 °C'de %5 CO2 ile 2 ila 5 dk boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesine geri getirin ve yapışık hücrelerin hücre kültürü yüzeyinden salınmasını bekleyin.</li>
		<li>Tripsin içeren tabağa %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin ile desteklenen 8 mL taze Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortası (DMEM) ekleyin.</li>
		<li>Hücreleri hafifçe boruhaline vererek yeniden askıya alın ve süspansiyonu steril 15 mL konik bir tüpe aktarın. Konik tüpü dengeli bir santrifüje yerleştirin ve hücreleri yavaşça peletlemek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 161 x g'de döndürün.</li>
		<li>DMEM'in 10 mL'sinde peletli hücrelerden orta/tripsin çözeltisini aspire edin ve %10 FBS ve %1 penisilin/streptomisin ile desteklendi. 293T hücre süspansiyonu ve 6 kuyu plakasının kuyusu başına 2 x 106 293T hücreleri saymak için hemositometre kullanın.</li>
		<li>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) toplam hacmi 2 mL kültür hücreleri% 10 fetal sığır serum (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye ve% 5 CO2ile 37 °C nemlendirilmiş bir kuvöz de korumak .</li>
		<li>2. Gün: Pipet 7 μL lipid bazlı transfeksiyon dağıtım reaktifi ve 100 μL azaltılmış serum ortamı 1,5 mL mikrosantrifüj tüpiçine ve oda sıcaklığında 5 dakika (tüp #1) kuluçkaya yatmaktadır.</li>
		<li>Ayrı bir 1,5 mL mikrosentrifüge tüpte, pipet 1 μg RFP-H2B ifade vektörü (veya 1 μg α-tubulin-EGFP ifade vektörü), 5 μL arttırıcı reaktifi (üreticinin yönergelerine göre gerekli olduğu gibi), 0,5 μg pMD2.G ve 1 μg psPAX2 ve 100 μL azaltılmış serum orta (tüp #2).</li>
		<li>Adım 1.1.7 ve adım 1.1.8 içeriğini dikkatlice tüp #1 içine tüp #2 boru ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka boru ile birleştirin. NOT: Reaksiyon ek kuyularda hücrelerin transfeksiyonu için gerektiği gibi ölçeklenebilir.</li>
		<li>Pipet transfeksiyon reaksiyonu istenilen kuyuya 2 mL orta 293T hücreleri içeren damla ve 37 °C'de % 5 CO2ile nemlendirilmiş kuvöze çanak geri dönün. NOT: Hem RFP-H2B hem de α-tubulin-EGFP ifade eden hücreler oluşturmak için her ifade yapısı için ayrı virüs oluşturur (adım 1.1.7- 1.1.9).</li>
		<li>3. Gün: Orta yı %10 FBS ve %1 penisilin/streptomisin ile takviye edilmiş 2 mL taze DMEM ile değiştirin. Yemeği %5 CO2ile 37 °C'de nemlendirilmiş kuluçka makinesine geri döndürün.</li>
	</ol></li>
	<li>4. Gün: 293T hücrelerini bozmamak veya çıkarmamak için dikkatli davranarak ifade edilen virüs parçacıklarını içeren ortamı toplayın. Virüs partikülleri içeren ortamı, 5 mL'lik bir şırıngaya bağlı 0,45 μM'lik bir filtreden geçirerek filtreleyin. Aliquot virüsü 4 °C'de kısa süreli depolama için veya -80 °C'de uzun süreli depolama için. NOT: Bu şekilde elde edilen viral parçacıklar ~1 x 107 ila 1 x 108 Transducing Birimleri/mL aralığında bulunacaktır. Enfekte edilecek viral üreten hücreler ve hücreler aynı ortamda kültürlendirildik, ortamın yerini almak için viral konsantrasyon gerekli değildir ve filtrelenmiş viral partiküller doğrudan hücreleri enfekte etmek için kullanılabilir.</li>
	<li>Tohum 2 x 105 hTERT-RPE-1 hücreleri viral enfeksiyon için hazırlık 6-iyi çanak iyi başına. DMEM'in 2 mL'lik kültür hücreleri %10 FBS ve %1 penisilin/streptomisin ile desteklenir ve %5 CO2ile 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde muhafaza edilir.</li>
	<li>5. Gün: HTERT-RPE-1 hücrelerine hexadimethrine bromür (örn. polibren) ekleyin ve 8 μg/mL'lik son konsantrasyona ekleyin. Hücre kültürü ortamının 500 μL'sinde seyreltilmiş 500 μL'lik bir virüs karışımı ile hücreleri enfekte edin. NOT: Hexadimethrine bromür çözeltisi steril distile suda hazırlanır ve 0,45 μm filtreden geçirilir.</li>
	<li>6. Gün: Tek kullanımlık cam pasteur pipet kullanarak, virüs enfekte hücreleri içeren kuyulardan orta aspire. Hücre kültürü ortamını %10 FBS, %1 penisilin/streptomisin içeren 2 mL DMEM ve plazmid entegrasyonu ve ekspresyonu için uygun antibiyotik konsantrasyonları ile değiştirin. NOT: Açıklanan deneylerde kullanılan α-tubulin-EGFP ekspresyonu plazmidpuromisin direnci geni, RFP-H2B ekspresyonu plazmid ise blastisdin direnci geni taşır. Bu nedenle α-tubulin-EGFP, RFP-H2B ve hTERT RPE-1 hücrelerinin seçiminde 10 μg/mL puromisin ve 2 μg/mL blasticidin kullanılır. Seçim için kullanılan antibiyotik konsantrasyonları kullanılan çeşitli hücre hatları için farklı olabilir.</li>
	<li>5-7 gün antibiyotik seçimi altında hücreleri korumak, uygun seçim reaktifler içeren taze orta ile her 3 günde bir orta değiştirerek. NOT: Hücreler seçim sırasında alt kesişme noktasında tutulmalıdır ve 1.1.1 ile 1.1.4 adımlarında açıklandığı gibi gerektiğinde genişletilmelidir.</li>
	<li>Etiketli yapılar ifade onaylamak için immünofloresan görüntüleme kullanın. NOT: İstenirse, hücre popülasyonu içinde tek tip ifade düzeylerini elde etmek için tek hücreli klonlar türetilebilir. Bir kez istikrarlı klonlar teyit edilir, hücreler antibiyotik seçimi yokluğunda standart kültür koşulları altında muhafaza edilebilir.</li>
</ol>2. Mitotik mil tedirginlikleri sonrasında canlı hücre görüntülemesi için hücrelerin hazırlanması
NOT: Aseptik teknikleri kullanın ve bir BSL2 güvenlik kabininde adımları gerçekleştirin.
<ol><li>Steril tek kullanımlık cam Pasteur pipeti kullanarak, yapı(lar) ifadesini taşıyan hücre hattını içeren kültür plakasından ortayı aspire edin (adım 1.7'den). Hücreleri 10 mL steril PBS ile kısaca yıkayın. PBS'yi plaka alt kısmında dağıtmak için girdap, ardından pbs'yi steril tek kullanımlık cam Pasteur pipetiyle aspire edin.</li>
	<li>10 cm plakaya %0,05 tripsin 2 mL ekleyin. Plakayı 37 °C'de 2-5 dakika veya hücreler plaka yüzeyinden ayrılana kadar kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tripsin içeren tabağa 8 mL taze orta ekleyin. Hücreleri hafifçe boruhaline vererek yeniden askıya alın ve süspansiyonu steril 15 mL konik bir tüpe aktarın. Konik tüpü dengeli bir santrifüje yerleştirin ve hücreleri yavaşça peletlemek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 161 x g'de döndürün.</li>
	<li>10 mL serolojik pipetle hafifçe boru haline vererek 10 mL PBS'de süpernatantı dikkatlice aspire edin ve yeniden askıya alın. Konik tüpü dengeli bir santrifüje yerleştirin ve hücreleri yavaşça peletlemek için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 161 x g'de döndürün.</li>
	<li>Supernatant'ı dikkatlice aspire edin ve 10 mL serolojik pipetle hafifçe boru haline vererek taze ortamın 10 mL'inde yeniden askıya alın.</li>
	<li>Hücreleri sayın, daha sonra bir hemacytometer kullanarak hücre numarasını hesaplayın ve hücre kültürü ortamda 1-2 x 105 hücre/mL konsantrasyonuna seyreltin. Steril 12 kuyulu bir alt plakanın her kuyuya hücre süspansiyonunun 500°L'sini tohumlayın. Plakayı hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin ve hücrelerin plaka yüzeyine yapışmasını bekleyin. NOT: Canlı hücre görüntüleme, hücrelerin görüntü edinimi sırasında görüntüleme düzlemi ile ilişkili kalması için iyi yapışmasını gerektirir. Kaplamayı takiben hücrelerin yapışması için gereken süre bir hücre hattından diğerine farklılık görebilir ve çalışılan hücre hattı için optimize edilmelidir.</li>
	<li>Hızlandırılmış görüntülemeyi başlatmadan önce 30 dakikaya kadar, hücrelerle tohumlanan kuyulardan birine veya daha fazlasına ilgili bir mitotik ilaç konsantrasyonu ekleyin. Organik çözücünün hücresel davranış üzerindeki potansiyel etkisini hesaba katmak için, inhibitörün dilüentinin eşit hacimli liğini kontrol olarak hücrelere ekleyin. Örneğin, mitotik kiaz Aurora A'nın spesifik inhibitörüolan 100 nM'nin eklenmesinin hücrelerin kontrol kuyusu olan bu ilacın dilüenti olan DMSO'nun eşit hacmiyle paralel olduğundan emin olun. NOT: Mitotik progresyondaki dinamik değişikliklerin karşılaştırmalı analizi, deneysel koşullara paralel olarak normal mitozların görüntülenebilmesi için pertürbasyonların yokluğunda hazırlanacak hücre kuyularının hazırlanmasını gerektirir.</li>
</ol>3. Mikroskop, RFP-H2B, α-tubulin-GFP ifade eden hücrelerin hızlandırılmış görüntülemesi için ayarlanmıştır (Şekil 1, Şekil 2)
<ol><li>RFP-H2B, α-tubulin-GFP içeren hücre kültür plakasını, hTERT RPE-1 hücrelerini ifade eden hücre kültür plakasını, yüksek çözünürlüklü bir kamera (piksel boyutu 20x) ile donatılmış ters epifloresan mikroskopüzerinde uygun bir aşama kesici uçta görüntülenecek şekilde yerleştirin. 37 °C'ye kadar önceden ısıtılmış çevre odası ve nemlendirilmiş %5 CO2için bir dağıtım sistemi. NOT: Kapalı çevre odaları veya sıcaklık kontrollü sahne uçları, nemlendirilmiş %5 CO2'nin teslim edilmesi ve stabil sıcaklık kontrolü sağlanması koşuluyla uygun olabilir.</li>
	<li>0,5 sayısal diyafram açıklığı ile 20x hava hedefi kullanın ve yüksek kontrastfloresan ve faz kontrastı veya brightfield görüntüleme için donatılmıştır. Faz kontrastı veya parlaklık alanı ile hücreleri görüntüleyin ve hücreleri odak haline getirmek için rotayı ve mikroskobu ince odak ayarlayın.</li>
	<li>Brightfield, GFP ve RFP görüntü edinimi için en uygun pozlama sürelerini, görüntülenecek floroforlar için uygun uyarma ve emisyonla ilgili filtre küpünü seçerek belirleyin ve ayarlayın. Alternatif olarak, önceden belirlenmiş bir pozlama süresi girdirmek için otomatik pozlama düğmesini tıklatın. Sinyal yeterince yoğun değilse, binning sekmesine tıklayarak ve açılan menüden 2 x 2 piksel binning seçerek daha kısa pozlama sürelerini etkinleştirmek için piksel binning'i seçin. NOT: Fototoksisite mitotik progresyon ve hücre canlılığını bozabilir. Kontrol popülasyonlarında bulunan mitotik hücrelerin normal mitozları tamamlayamamaları, maruz kalma sürelerinin ve/veya görüntüleme süresinin daha da optimize edilmesi gerektiğinin bir göstergesi olabilir.</li>
	<li>Çok eşgüdümlü, çok iyi görüntülemenin aynı anda elde edilmesini sağlayan ve görüntü edinimi parametrelerini tanımlayan bir satın alma ve analiz yazılımı kullanın.<ol>
<li>Üreticinin talimatlarına göre mikroskop aşamasını çok kuyulu çanağa seçin ve kalibre edin. Kullanılan plaka biçiminin diyagramındaki ilgili kuyulara tıklayarak görüntülenecek kuyuları vurgulamak veya başka bir şekilde seçmek için görüntü edinme yazılımını kullanın.</li>
		<li>Oluşturulan Puanlar kontrol paneli altında(Şekil 2), Nokta Yerleştirme sekmesine tıklayarak ve önceden tanımlanmış veya rasgele koordinat yerleşimi seçerek görüntülenecek her kuyunun içindeki koordinatları tanımlar açılan menü. Çalışma Alanı sekmesini seçin ve kuyunun sınırlarını dışlamak için koordinat seçim alanını kısıtlamak için açılır menüden sınırlı seçeneğini belirleyin. Her kuyuda yakalanacak noktaların sayısını ve dağıtımını seçmek için Sayım ve Dağıtım sekmelerini tıklatın. NOT: 5 dk'lık zaman dilimi içinde her kuyu da görüntülenebilen koordinat sayısı, görüntülenecek kuyu sayısı ve her kanalın pozlama süresiyle sınırlı olacaktır. Tipik olarak, kuyu başına 5-8 koordinatlar 4 saat içinde mitoz bölünme yoluyla her durumda en az 50 hücre gözlemlemek için yeterlidir.</li>
		<li>Zaman Sırası kontrol paneline tıklayıp içeri sokarak görüntüleri toplamak için zaman aralığını ve süresini seçin ve girdi. NOT: Görüntülerin her 1 ila 5 dakikada bir elde edilmesi mitotik ilerleme dinamiklerini izlemek için uygundur. Görüntülemenin toplam süresi, hücre hattının istenilen uç nokta ve çoğalma oranını yansıtmalıdır. Örneğin, 4 saat mitoz bölünme yoluyla birçok hücre ilerleme görmek için yeterli, 16 saat mitoz yoluyla bir asynchronous popülasyon ilerleme en RPE-1 hücreleri görmek için yeterlidir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Mitotik mil tedirginlikleri sonrasında metafaz zamanlaması ve mitotik hücre kaderini belirlemek için hızlandırılmış görüntü analizi
NOT: Görüntü analizini bir görüntü edinme yazılımı(Tablo Malzemeler), ImageJ veya karşılaştırılabilir görüntü analizi yazılımı kullanarak gerçekleştirin.
<ol><li>RFP filtre küpü yle çekilen görüntüleri yerinde seçerek RFP-H2B etiketli kromatini görselleştirin. Mitoz girilen bir hücreyi ilk kromatin sıkıştırmasında belirtildiği gibi(Şekil 2C, mavi ok ucu) ve nükleer zarf ın parçalanması (α-tubulin-EGFP artık nükleer sınır tarafından dışlanmadığında) tanımlayın.</li>
	<li>Tek tek hücrelerde metafaz hizalama ve anafaz başlangıcının mitotik zamanlamasını belirleyin: RFP-H2B etiketli kromatine kadar mitotik girişten zaman puanlarını/dakika sayısını belirlemek için edinilmiş filmde ardışık zaman noktaları üzerinden hücreyi izleyin metafaz sırasında hücre ekvatorundaki hizalamayı tamamlar(Şekil 2C, sarı ok ucu).</li>
	<li>Mitotik zamanlamayı, mitotik sadakati ve hücre kaderini izlemek için, anafaz kromozom ayrımının belirgin olduğu zaman koordinatını belirlemek için hücreyi ardışık zaman noktalarından izlemeye devam edin(Şekil 2C, beyaz ok ucu) ve/veya kromatin decompaction ve nükleer zarf reformasyon (çekirdekten tubulin dışlanması ile belirtildiği gibi) meydana gelmiştir. NOT: Mil montajı veya mitotik progresyonpertasyonları, bipolar mitotik mil elde etmek ve tam kromozom hizalaması veya anafaz kromozom segregasyonunu tamamlamak için gereken zamanın bir fonksiyonu olarak değerlendirilebilir.</li>
	<li>Anafaz kromozom ayrımı sırasında gecikmeli kromozomlar ve kromatin köprüleri de dahil olmak üzere mitotik bozukluklar sergileyen her popülasyondaki hücreleri tanımlamak için RFP-H2B'yi görselleştirin. NOT: Tehlikeye mitotik sadakat de multinucleated veya mikronükleli kız hücreleri neden olabilir ve hücrelerde mitotik çıkış sonrası görselleştirilmiş olabilir, Şekil 3'teolduğu gibi .</li>
</ol>

<ol><li>Szuts, D., Krude, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+arrest+at+the+initiation+step+of+human+chromosomal+DNA+replication+causes+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cell cycle arrest at the initiation step of human chromosomal DNA replication causes DNA damage.</a> Journal of Cell Science. 117, 4897-4908 (2004).</li>
<li>Gayek, A. S., Ohi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDK-1+Inhibition+in+G2+Stabilizes+Kinetochore-Microtubules+in+the+following+Mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CDK-1 Inhibition in G2 Stabilizes Kinetochore-Microtubules in the following Mitosis.</a> PLoS One. 11, e0157491(2016).</li>
<li>Mackay, D. R., Makise, M., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defects+in+nuclear+pore+assembly+lead+to+activation+of+an+Aurora+B-mediated+abscission+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Defects in nuclear pore assembly lead to activation of an Aurora B-mediated abscission checkpoint.</a> The Journal of Cell Biology. 191, 923-931 (2010).</li>
<li>Cimini, D., Fioravanti, D., Salmon, E. D., Degrassi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merotelic+kinetochore+orientation+versus+chromosome+mono-orientation+in+the+origin+of+lagging+chromosomes+in+human+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Merotelic kinetochore orientation versus chromosome mono-orientation in the origin of lagging chromosomes in human primary cells.</a> Journal of Cell Science. 115, 507-515 (2002).</li>
<li>Kwon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+to+suppress+multipolar+divisions+in+cancer+cells+with+extra+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes.</a> Genes & Development. 22, 2189-2203 (2008).</li>
<li>Khodjakov, A., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+division+process+in+living+tissue+culture+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging the division process in living tissue culture cells.</a> Methods. 38, 2-16 (2006).</li>
<li>Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+anti-mitotic+drugs+kill+cancer+cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?</a> Journal of Cell Science. 122, 2579-2585 (2009).</li>
<li>van Vuuren, R. J., Visagie, M. H., Theron, A. E., Joubert, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimitotic+drugs+in+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemotherapy+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Antimitotic drugs in the treatment of cancer.</a> Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 76, 1101-1112 (2015).</li>
<li>Chan, K. S., Koh, C. G., Li, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis-targeted+anti-cancer+therapies%3A+where+they+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Diseases%22%5BJournal%5D)">Mitosis-targeted anti-cancer therapies: where they stand.</a> Cell Death and Diseases. 3, 411(2012).</li>
<li>Martin, M., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+into+Focus%3A+Mechanisms+of+Microtubule+Minus-End+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coming into Focus: Mechanisms of Microtubule Minus-End Organization.</a> Trends in Cell Biology. 28, 574-588 (2018).</li>
<li>Maiato, H., Logarinho, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+multipolarity+without+centrosome+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification.</a> Nature Cell Biology. 16, 386-394 (2014).</li>
<li>Vitre, B. D., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomes%2C+chromosome+instability+%28CIN%29+and+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Centrosomes, chromosome instability (CIN) and aneuploidy.</a> Current Opinion in Cell Biology. 24, 809-815 (2012).</li>
<li>Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+centrosome+abnormalities+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of centrosome abnormalities in cancer.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369, (2014).</li>
<li>Navarro-Serer, B., Childers, E. P., Hermance, N. M., Mercadante, D., Manning, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+A+inhibition+limits+centrosome+clustering+and+promotes+mitotic+catastrophe+in+cells+with+supernumerary+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Aurora A inhibition limits centrosome clustering and promotes mitotic catastrophe in cells with supernumerary centrosomes.</a> Oncotarget. 10, 1649-1659 (2019).</li>
<li>Conte, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TACC1-chTOG-Aurora+A+protein+complex+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">TACC1-chTOG-Aurora A protein complex in breast cancer.</a> Oncogene. 22, 8102-8116 (2003).</li>
<li>Schumacher, J. M., Ashcroft, N., Donovan, P. J., Golden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+conserved+centrosomal+kinase%2C+AIR-1%2C+is+required+for+accurate+cell+cycle+progression+and+segregation+of+developmental+factors+in+Caenorhabditis+elegans+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A highly conserved centrosomal kinase, AIR-1, is required for accurate cell cycle progression and segregation of developmental factors in Caenorhabditis elegans embryos.</a> Development. 125, 4391-4402 (1998).</li>
<li>Asteriti, I. A., Giubettini, M., Lavia, P., Guarguaglini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora-A+inactivation+causes+mitotic+spindle+pole+fragmentation+by+unbalancing+microtubule-generated+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Aurora-A inactivation causes mitotic spindle pole fragmentation by unbalancing microtubule-generated forces.</a> Molecular Cancer. 10, 131(2011).</li>
<li>Chan, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+overview+of+centrosome+amplification+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A clinical overview of centrosome amplification in human cancers.</a> International Journal of Biological Sciences. 7, 1122-1144 (2011).</li>
<li>Kramer, A., Maier, B., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+clustering+and+chromosomal+%28in%29stability%3A+a+matter+of+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Centrosome clustering and chromosomal (in)stability: a matter of life and death.</a> Molecular Oncology. 5, 324-335 (2011).</li>
<li>Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+linking+extra+centrosomes+to+chromosomal+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability.</a> Nature. 460, 278-282 (2009).</li>
<li>Silkworth, W. T., Nardi, I. K., Scholl, L. M., Cimini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipolar+spindle+pole+coalescence+is+a+major+source+of+kinetochore+mis-attachment+and+chromosome+mis-segregation+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multipolar spindle pole coalescence is a major source of kinetochore mis-attachment and chromosome mis-segregation in cancer cells.</a> PLoS One. 4, e6564(2009).</li>
<li>Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+aberrations%3A+cause+or+consequence+of+cancer+progression%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%2C+Cancer%22%5BJournal%5D)">Centrosome aberrations: cause or consequence of cancer progression?</a> Nature reviews, Cancer. 2, 815-825 (2002).</li>
<li>Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosomes+and+cancer%3A+how+cancer+cells+divide+with+too+many+centrosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes.</a> Cancer Metastasis Reviews. 28, 85-98 (2009).</li>
<li>Quintyne, N. J., Reing, J. E., Hoffelder, D. R., Gollin, S. M., Saunders, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+multipolarity+is+prevented+by+centrosomal+clustering%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spindle multipolarity is prevented by centrosomal clustering.</a> Science. 307, 127-129 (2005).</li>
<li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Zaman atlamalı görüntüleme tarafından sağlanan zamansal çözünürlük, tek hücre içindeki ardışık hücresel olayların görselleştirilmesini ve değerlendirilmesini sağlar. Hücre senkronizasyonunu ve ardından hücrelerin ardışık zaman noktalarında toplanması ve fiksasyonundan yararlanan yaklaşımlar, sonuçta hücre popülasyonları arasında karşılaştırmalar yapılmasıyla sınırlıdır. Pertürbasyonlara hücresel yanıtın tekdüze olmadığı veya görselleştirilen sürecin dinamik olduğu bağlamlarda, canlı hücre zaman atlamalı görüntüleme, hem ...

Sabit hücrelerin görüntü tabanlı analizi genellikle çeşitli tedirginliklere yanıt olarak hücre popülasyon düzeyi değişikliklerini değerlendirmek için kullanılır. Hücre senkronizasyonu ile birleştirildiğinde, seri zaman noktalarının toplanması ve görüntülenmesi takip edildiğinde, bu tür yaklaşımlar olayların hücresel bir dizi önermek için kullanılabilir. Bununla birlikte, sabit hücre görüntüleme zamansal ilişkiler bir nüfus için ima ve bireysel hücrelerin düzeyinde gösterilmiştir sınırlıdır. Bu şekilde, sabit hücre görüntüleme ve analizi sağlam fenotipleri ve sabit durum değişikliklerini gözlemlemek için yeterli olmakla birlikte, zaman içinde geçici değişiklikleri algılama ve hücrelerin sadece bir alt popülasyonunu etkileyen değişiklikleri algılama yeteneği kusurludur. Buna karşılık, canlı hücre görüntüleme tek bir hücre içinde hücresel ve hücre altı süreçleri gözlemlemek için kullanılabilecek anlamlı bir araçtır, ya da hücresel nüfus, zaman içinde ve kendilerini hücresel davranışı etkileyebilir senkronizasyon yaklaşımları yardımı olmadan 1.1.2 , 2.000 , 3.2.2 , 4.2.2 , 5.000 , 6 .
Bipolar mitotik mil oluşumu hücre bölünmesi sırasında uygun kromozom ayrımı için gereklidir, iki genetik olarak özdeş kız hücreleri sonuçlanan. Mitotik mil yapısındaki, mitotik progresyonun bozulmasıve kromozom ayrımının doğruluğunu tehlikeye sokan kusurlar, hücre bölünmelerinin azalmasına ve hücre canlılığının azalmasına neden olabilir. Bu nedenle, mil oluşumunu değiştirmek mitotik zehirler kanser hücrelerinin hızlı çoğalmasını sınırlamak için umut verici terapötik ler vardır7,8,9. Bununla birlikte, mitotik zehirlerin eklenmesinden sonra mil yapısının sabit hücre analizi, mil oluşumunun dinamik sürecini değerlendirme yeteneği ile sınırlıdır ve mil yapısında gözlenen değişikliklerin kalıcı olup olmadığını veya bunun yerine geçici ve başarılı hücre bölünmesi izin üstesinden gelebilir.
Bu protokolde, canlı hücre görüntüleme ile mil pertürbasyonlarını takiben mitoz dinamiklerini değerlendirmek için bir yaklaşım açıklıyoruz. Mikrotübülleri görselleştirmek için EGFP etiketli α-tubulin ile birlikte, mikrotübülleri görselleştirmek için RFP etiketli Histon 2B'yi ifade etmek üzere tasarlanmış hTERT ölümsüzleştirilmiş RPE-1 hücre hattını kullanarak metafaz kromozom hizalamasının zamanlaması, anafaz başlangıcı ve nihayetinde mitotik hücre kaderi kromozom hareketi, sıkıştırma ve nükleer morfolojigörsel ipuçları kullanılarak değerlendirilir.

<table><tbody><tr><td>% 0.05 Tripsin</td><td>Gibo-Yaşam bilimleri</td><td>25-510</td><td>Kültür kaplarından yapışkan hücreleri serbest bırakmak için kullanılan bir serin proteaz</td></tr><tr><td>15ml santrifüj tüpleri</td><td>Olympus Plastics</td><td>28-101</td><td></td></tr><tr><td>20x CFI Plan Fluor objektifi&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>Hem parlak alanı hem de floresanı görselleştirmek için Canlı hücre görüntülemede kullanım için</td></tr><tr><td>293T Hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>Retroviral transfeksiyonda kullanım için; adım 1.1'de kullanılır</td></tr><tr><td>a-tubulin-EGFP&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>çeşitli sayılar</td><td>Yeşil bir floresan protein etiketine kaynaşmış alfa tübülin için ekspresyon vektörü; canlı hücre görüntülemede tübülinin görselleştirilmesinde kullanım için: Addgene ve diğer satıcılar aracılığıyla ticari olarak temin edilebilir</td></tr><tr><td>Alisertib</td><td>Selleckchem</td><td>S1133</td><td>Mitotik kinaz Aurora A'nın küçük molekül inhibitörü Stok konsantrasyonu DMSO'da 10mM'de hazırlanır ve 100nM'lik bir nihai konsantrasyonda kullanılır.</td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invitrogen</td><td>A11139-03</td><td>Antibiyotik seçim ajanı; A-tub-EGFP eksprese eden hücreleri seçmek için kullanılır</td></tr><tr><td>C02</td><td>Hava Gazı</td><td></td><td>Hücre kültürü ve canlı hücre görüntülemede kullanım için</td></tr><tr><td>Chroma ET-DS Kırmızı (TRITC/Cy3)</td><td>Chroma</td><td>49005</td><td>Tek bantlı filtre seti; uyarma dalga boyu 25nm bant genişliği ile 545nm ve 70nm bant genişliği ile 605nm dalga boyunda emisyon; H2B-RFP'nin</td></tr> <tr><td>görselleştirilmesi içinChroma ET-EGFP (FITC/Cy2)</td><td>Chroma</td><td>49002</td><td>Tek bantlı filtre seti; 40nm bant genişliğine sahip uyarma dalga boyu 470nm ve 50nm bant genişliğine sahip 525nm dalga boyunda emisyon; GFP-tubulin</td></tr><tr><td>tek kullanımlık cam Pastüer pipetlerinin görselleştirilmesi için, sterilize edilmiş ve nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-6A</td><td>Aspirasyon hücrelerinde kullanım için&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>11965-084</td><td>RPE-1 ve 293T hücrelerinin büyümesi için hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>10438-026</td><td>Hücre kültürü ortamı takviyesi</td></tr><tr><td>Lipofektamin 3000 ve p3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000-015</td><td>Plazmitlerin transfeksiyonu için lipid bazlı transfeksiyon reaktifi; 1.1.4</td></tr><tr><td>Çok kuyulu Doku Kültürü tabaklarında</td> kullanılır<td>Hücre kültürü, transfeksiyon / enfeksiyon ve canlı hücre görüntülemede kullanım için</td><td>çeşitli</td> <td>Corning</td></tr><tr><td>Nikon Ti-E mikroskobu</td><td>Canlı</td><td>hücre görüntülemede kullanım için</td>Nikon <td></td> Ters epifloresan mikroskobu</tr><tr><td>NIS Elemanları HC&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Sürüm 4.51</td><td>Görüntü elde etme ve analiz yazılımı; bölüm 3 ve 4'te kullanılır</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Gibo-Yaşam bilimleri</td><td>31985-070</td><td>Hücre transfeksiyonu için indirgenmiş serum ortamı; adım 1.1.3'te kullanılır</td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin&nbsp;</td><td>Gibo-Life sciences</td><td>15140-122</td><td>hücre kültürü ortamında kullanılan antibiyotik</td></tr><tr><td>fosfat tamponlu salin (PBS)</td> <td>Keson laboratuvarları</td><td>PBP06-10X1LT</td><td>hücre kültürü ile kullanım için steril salin çözeltisi</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Lentiviral VSV-G zarf ekspresyon yapısı; adım 1.1.4'te kullanılır</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>Viral enfeksiyon etkinliğini artırmak için kullanılan katyonik polimer; adım 1.1.10'da kullanılır</td></tr><tr><td>psPAX</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>2. nesil lentiviral ambalaj plazmidi; adım 1.1.4'te kullanılır</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-pr-1</td><td>Antibiyotik seçim ajanı; RFP-H2B eksprese eden hücreleri seçmek için kullanılır</td></tr><tr><td>RFP-Histon 2B (H2B)</td> <td>Gen</td><td>çeşitli numaralar</td> <td>ekleyinKırmızı floresan proteini etiketli histon 2B için ekspresyon vektörü; canlı hücre görüntülemede kromatinin görselleştirilmesinde kullanım için: Addgene ve diğer satıcılar aracılığıyla ticari olarak temin edilebilir</td></tr><tr><td>RNAi Max</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td>siRNA'nın transfeksiyonu için lipid bazlı transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>RPE-1 hücreleri</td><td>oluşturur ATCC</td><td>CRL-4000</td><td>İnsan retinal pigment epitel hücre hattı</td></tr><tr><td>Doku kültürü kabı 100x20mm</td><td>Corning&nbsp;</td><td>Yapışık hücrelerin kültürlenmesinde kullanım için</td> <td>353003</td></tr><tr><td>Zyla sCMOS kamera&nbsp;</td><td>Hücrelerin görüntülerini yakalamak için kullanılan mikroskoba bağlı</td> <td>Nikon</td><td></td> Fotoğraf Makinesi</tr></tbody></table>

mitotik mil pertürbasyonları sonrası metafaz zamanlaması ve hücre kaderinin dinamiği nin dinamiği nin dinamitini değerlendirmek için canlı hücre görüntülemesi

Live Cell Imaging to Assess the Dynamics of Metaphase Timing and Cell Fate Following Mitotic Spindle Perturbations

Canlı hücre zaman atlamalı görüntüleme, hücre biyolojisinde, sabit hücre analizi yle gözden kaçmış, yanlış anlaşılabilecek veya yanlış yorumlanabilecek hücresel süreçler hakkında bilgi sağlayan önemli bir araçtır. Sabit hücre görüntüleme ve analizi sağlam ve hücresel sabit durumu gözlemlemek için yeterli olmakla birlikte, hücresel düzeyde olayların zamansal bir sıratanımlayan sınırlı olabilir ve dahil olmak üzere dinamik süreçlerin geçici doğasını değerlendirmek için yetersiz donanımlı mitotik ilerleme. Buna karşılık, canlı hücre görüntüleme zaman içinde tek hücre düzeyinde hücresel süreçleri gözlemlemek için kullanılabilir ve aksi takdirde sabit hücre görüntüleme kötü temsil edilecek süreçlerin dinamiklerini yakalamak için kapasiteye sahip anlamlı bir araçtır. Burada, kromatin ve mikrotübüllerin floresan etiketli belirteçlerini taşıyan hücreler ve bunların metafaz kromozom hizasını ve mitotik çıkışı izlemek için canlı hücre görüntüleme yaklaşımlarında kullanılmasına yönelik bir yaklaşım açıklıyoruz. Mitoz bölünmede çeşitli evrelerde hücrelerin tanımlanması, mitotik defektlerin tanımlanması ve izlenmesi, mil dinamiğinin analizi ve mitotik inhibitörleri ile tedavi sonrasında mitotik hücre kaderi.

Mil pertürbasyonları varlığında mitotik progresyonun değerlendirilmesi Mil direk odaklama nın düzenlenmesi uygun bipolar mil oluşumunda önemli bir adımdır. Protein tükenmeleri yoluyla bu süreçte bozulma, ilaç inhibisyonu, veya centrozom numarası bozuk mil yapısı nda değişiklikler ve gecikme veya mitotik ilerlemesini durdurmak10,11,12,13. Bunu...

Burada mil oluşumu ve mitotik progresyon dinamiklerini değerlendirmek için bir protokol sıyoruz. Hızlandırılmış görüntüleme uygulamamız, kullanıcının mitozbölünmenin çeşitli aşamalarındaki hücreleri belirlemesini, mitotik defektleri izlemesini ve tanımlamasını ve anti-mitotik ilaçlara maruz kalındığında mil dinamiği ve mitotik hücre kaderini analiz etmesini sağlar.

Mitotik Mil Pertürbasyonları Sonrası Metafaz Zamanlaması ve Hücre KaderiniN Dinamiği Nin Dinamiği Nin Dinamitini Değerlendirmek Için Canlı Hücre Görüntülemesi

Live cell time-lapse imaging is an important tool in cell biology that provides insight into cellular processes that might otherwise be overlooked, ...

Canlı hücre görüntüleme, dinamik hücresel süreçlerin zaman içinde tek bir hücre içinde gözlemlemesini sağlar. Bu yaklaşımlar, hücre bölünmesinin dinamik sürecini etkileyen koşulları değerlendirmek ve mitoz bölünmedeki kusurların kız hücre çoğalması ve canlılığı üzerindeki etkilerini ortaya çıkarmak için güçlüdür. Görüntüleme sırasında ışığa maruz kalma sonucu fototoksisite bu protokol ile ilişkili önemli bir sorun temsil eder.Bu nedenle, maruz kalma süreleri ve görüntüleme aralığı ve süresi optimize edilmelidir. Aseptik tekniği ve biyogüvenlik seviyesi iki güvenlik kabini kullanarak, ilgi ifadesi yapı taşıyan hücre hattı içeren kültür plakası orta aspire steril tek kullanımlık cam Pasteur pipet kullanın. Kısaca girdap ile steril PBS 10 mililitre ile hücreleri yıkayın ve 0.05% tripsin iki mililitre ile hücreleri tedavi.37 santigrat derece de iki ila beş dakika sonra, reaksiyonu durdurmak ve nazik pipetleme ile müstakil hücreleri yeniden askıya plaka ya santigrat sekiz mililitre ekleyin. Hücre çözeltisini steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve santrifüj ile hücreleri toplayın. PBS 10 mililitre pelet resuspend ve hücreleri tekrar santrifüj.Toplama için orta 10 mililitre pelet resuspend ve hücre kültürü orta konsantrasyon mililitre başına 5 hücreleri bir ila iki kez 10 seyreltmek. Daha sonra steril 12-iyi görüntüleme alt plaka her kuyuiçine hücrelerin 500 mikrolitre tohum ve hücrelerin plaka yüzeyine uymak için izin vermek için hücre kültürü kuluçka plaka yerleştirin. Görüntülemeden en fazla 30 dakika önce, bir veya daha fazla kuyuya ilgili bir mitotik ilaç konsantrasyonu ekleyin ve kontrollerle aynı sayıda kuyuya inhibitör diluent eşit miktarda ekleyin.Mikroskobu görüntülemeye hazırlamak için plakayı yüksek çözünürlüklü bir kamera, 37 santigrat dereceye önceden ısıtılmış bir çevre odası ve nemlendirilmiş %5 karbondioksit için bir dağıtım sistemi ile donatılmış ters epifloresans mikroskobunun aşamasına yerleştirin. 0,5 sayısal diyafram açıklığı ile 20 kez hava hedefi seçin ve yüksek kontrastlı floresan ve faz kontrastı için donatılmıştır veya parlak alan görüntüleme ve dersi ayarlamak ve hücreleri odak haline getirmek için odak bulmak için hücreleri görüntüleyin. Parlak alan, GFP ve RFP görüntü edinimi için en uygun pozlama sürelerini ayarlamak için, görüntülenecek floroforlar için uygun uyarma ve emisyona sahip ilgili filtre küplerini seçin ve Oynat'ı tıklatın.Sinyal yeterince yoğun değilse, otomatik pozlamayı ayarlayın ve her florofor kanalında Biçim açılır menüsünden uygun binning'i seçin. Mikroskop aşamasını üreticinin talimatlarına göre çok kuyulu çanağa kalibre edin ve görüntülenecek kuyuları vurgulamak veya başka bir şekilde seçmek için görüntü edinme yazılımını kullanın. Oluşturulan puan kontrol panelini açın ve Çalışma Alanı altında, kuyunun sınırlarını dışlamak için koordinat seçim alanını kısıtlamak için Kısıtlı ve Kenarlık'ı seçin.Alan Kısıtlaması açılır menüsünde, Tüm Alan'ı seçin ve rasgele bir nokta yerleşimi seçin. Sayısı altıya ayarlayın ve sırasıyla kuyu başına yakalanacak noktaların sayısını ve dağıtımını seçmek için Randomize'yi tıklatın. Ardından, zaman aralığını ve görüntüleri toplama süresini seçmek ve girmek için zaman sırası kontrol panelindeki değerleri tıklatın ve girin.RFP-H2B etiketli kromatini görselleştirmek için, RFP filtre küpüyle yakalanan görüntüleri yerinde seçin ve metafaz hizalamasının mitotik zamanlamasını belirlemek için ilk kromatin sıkıştırma ve nükleer zarf dökümünde belirtildiği gibi mitoz girilen bir hücreyi tanımlayın ve tek tek hücrelerde anafaz başlangıcını belirleyin. RFP-H2B etiketli kromatin metafaz sırasında hücre ekvator hizasını tamamlayana kadar mitotik girişten zaman noktaları veya dakika sayısını belirlemek için satın alınan filmde ardışık zaman noktaları ile ilgi hücresini izleyin. Mitotik zamanlamayı, mitotik sadakati ve hücre kaderini izlemek için, anafaz kromozom ayrımının belirgin olduğu ve/veya kromatin ayrıştırma ve nükleer zarf reformasyonu meydana geldiğinde zaman koordinatını belirlemek için hücreyi ardışık zaman noktaları üzerinden izlemeye devam edin.Daha sonra, anafaz kromozom ayrımı sırasında gecikmeli kromozomlar ve kromatin köprüleri de dahil olmak üzere mitotik bozukluklar sergileyen her popülasyondaki hücreleri tanımlamak için RFP-H2B'yi görselleştirin. Alfa tubulin-EGFP görselleştirilerek, mil çekme odaklama elde edilir ken ve hücre bölünmesine hazırlık olarak bipolar mitotik mil oluşturulduğu için mil bozulması yaşayan hücrelerin dinamik değişikliklere maruz kaçtığı gözlenebilir. Mil montajı ile eşzamanlı olarak kromozom hareketi RFP-H2B ile görüntülenarak kromozom hizalamasını ve ayırma doğrusunu değerlendirebilir.Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları kullanılarak, bu temsili sonuçlar normal bir centrozsome içeriğe sahip hücrelerin metafaz hizalama ve anafaz başlangıçlı metafaz hizalama yoluyla nükleer zarf arıza yoluyla devam edebiliyoruz göstermektedir 30 dakika altında bir bipolar bölünme elde etmek için. Ekstra centrozomların varlığında, hücrelerin yaklaşık%50'si geçici çok kutuplu mitotik milin üstesinden gelebiliyor ve tam hücre bölünmesinde bipolar bir mil oluşturabiliyor. Kalan hücreler bipolar iğ elde edemez ler ve sonuç olarak mitoz bölünmeden çok kutuplu bir bölünme ile çıkarlar.Mil bipolaritesinin sağlanıp sağlanmadığına bakılmaksızın, ekstra centrozomlu hücreler iki sentrozomlu hücrelere göre mitoz süresinde önemli ölçüde artış sergilerler. Mitotik sonuçlardaki değişiklikler belirgin olmasa bile mitotik progresyon dinamiğinin değişebileceğini gösterir. Floresan kanallar için maruz kalma sürelerini tanımlarken, fototoksisiteyi sınırlamak için pozlama sürelerini optimize edin.Ayrıca kamera piksel binning daha düşük pozlama süreleri kullanılmak üzere izin vermek için seçilebilir. Bu işlem farmakolojik taramalar, invazyon ve göç analizi uygulamaları vardır. Bu yaklaşımlar aynı zamanda ilaç tedavilerinin etkinliğini veya hücresel hareketlilik dinamiklerini incelemek için de kullanılabilir.

live-cell-imaging-to-assess-dynamics-metaphase-timing-cell-fate

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İşte biz görüntüye bir temel protokolü açıklamak ve siRNA transfeksiyon sonra canlı memeli doku kültürü hücrelerinde mitoz zamanlama ölçmek.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

SAC kardeş kromatidler arasında mitotik segregasyon izlenmesi, sinyali başlatır nerede kinetochore olduğunu. A metodunda kromozom hareketi ile kinetochore proteinler ve koordinasyon birinin seçilmesi ve devir görselleştirme tarif...

Living Görselleştirilmesi Dinamik Kinetochore Protein Davranış ve Kromozom Hareket tarafından Mitotik Checkpoint incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Sinsityal Embriyolar

Geçiş anafaz-teşvik kompleksi (APC / C)-bağımlı ubikuitinasyon ve burada siklin B. sonraki yıkım, biz, darbe-kovalamaca etiketleme sonrasında, bir sistem kurulmuş tüm hücre popülasyonlarında siklin B proteoliz izleme sağlar ve tetiklenir anafaz için metafaz mitotik geçiş noktasından müdahale tespitini kolaylaştırır.

Tüm Cep Populasyonlarının Tek Hücre Düzeyinde Siklin B Proteoliz incelenmesi

Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Biz bir protokol yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu kullanılarak analiz tarafından takip HeLa hücreleri Çift Kişilik timidin eşitlenmesi için mevcut. Bu yöntem de interfaz işlevleri sahip çok fonksiyonlu proteinlerin Mitotik rolleri üzerinde çalışmalar etkinleştirme mitoz, zaman uyumlu olarak S faz geçin hücreleri çok sayıda elde anahtarıdır.

Mitotik hücre eşitleme ve yüksek çözünürlüklü Confocal mikroskobu mitoz sırasında çok fonksiyonlu hücre döngüsü proteinlerin rolü çalışmaya birleştirme

Canlı hücre görüntüleme bilgi hazinesi tek hücreler veya tüm nüfus üzerinde ulaşılamaz olan sabit hücre tek başına Imaging tarafından sağlar. Burada, hücre kader kararlar tedavi Anti-Mitotik uyuşturucu Paklitaksel ile aşağıdaki değerlendirmek için canlı hücre görüntüleme iletişim kuralları açıklanır.

Uzun vadeli canlı hücre kader Paklitaksel karşılık olarak değerlendirmek için Imaging hücreli

Bu iletişim kuralı etiket ve canlı kromozomlar Mitotik hücre Histone2B-GFP BacMam 2.0 etiket ve bir iplik kaset confocal mikroskobu sistemi kullanarak görselleştirmek için basit ve uygun bir yöntem açıklanır.

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Burada, araştırmacıların mitoz ve Meiosis sırasında yaşayan fisyon Maya hücrelerinde protein davranışları ve nükleer dinamikleri incelemesini sağlayan toksik olmayan bir mikroskopi yöntemi olan canlı hücreli görüntüleme sunuyoruz.

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Hücre bölünmeleri floresan etiketli proteinler ve zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir. Burada sunulan protokolü kullanarak, kullanıcılar hücre bölünmesi zamanlama dinamiklerini, mitotik mil montajını ve kromozom kongresini ve segregasyonlarını analiz edebilirler. RNA girişimini (RNAi) aracılı gen nakavtı sonrası bu olaylardaki kusurlar değerlendirilebilir ve ölçülebilir.

Hücre Bölünmesi Canlı Görüntüleme için Drosophila S2 Hücrelerinin Kullanımı

Burada canlı hücre dönen disk konfokal mikroskopisi ve MATLAB tabanlı görüntü işleme kullanarak prometafazda senkronize hücrelerde mikrotübül dinamiği analizinin sağlam ve ayrıntılı bir yöntemini sıyoruz.

Monopolar Mitotik İğlerde Dönen Disk Mikroskobu ile Mikrotübül Dinamiğinin Ölçülmesi

Öğrenin, canlı hücre görüntüleme ile mitotik mil dinamiklerini ve hücre bölünme sürecini analiz edin. Bu yöntem, anti-mitotik ilaçların iğne oluşumu üzerindeki etkilerini değerlendirmeye yardımcı olur.

Mitotik Mil Pertürbasyonları Sonrası Metafaz Zamanlaması ve Hücre KaderiniN Dinamiği Nin Dinamiği Nin Dinamitini Değerlendirmek Için Canlı Hücre Görüntülemesi (Video) | JoVE Journal

Mitotik Mil Pertürbasyonları Sonrası Metafaz Zamanlaması ve Hücre KaderiniN Dinamiği Nin Dinamiği Nin Dinamitini Değerlendirmek Için Canlı Hücre Görüntülemesi

Daha fazla video keşfet