SerbestÇe Hareket Eden Hayvanlarda Nöral AktiviteYi Kaydetmek Için Çoklu Fiber Fotometri
October 20th, 2019
Bu protokol, çok fiberli fotometri kayıtlarının nasıl uygulanacağını ve gerçekleştirildirilebildiğini, kalsiyumdan bağımsız eserlerin nasıl düzeltilebildiğini ve çift renkli fotometri görüntüleme için önemli hususları ayrıntılarıyla anlatır.
Fiber fotometri CSOM görüntüleme serbestçe hareket eden hayvan nöral aktiviteyi izlemek için genetik olarak kodlanmış özel gösterge ve optik lifleri birleştirir. Hangi nöronların belirli bir grup yönetmenlik veya bir eylem veya uyarıcı yanıt oynamak anlamak için önemlidir. Bu teknik, bağlantı veya genetik profilleri ile tanımlanan belirli beyin bölgelerinden kayıt için erişilebilir bir yoldur, gürültü ye sinyal ayırmak için kontrol yerleşik ile.
İşlemcinin, Laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Ekaterina Martianova olacağını gösteriyor. Beş eksenli çevirmendeki tüm vidaları gevşeterek başlayın. Yama kablosunu, beş eksenli çevirmene yapıştırılmış adaptöre vida.
Daha sonra 470 nanometre uyarma ışığını düşük güçte açın ve otomatik floresan plastik kaydırağa işaret eden lifin ucunu yerleştirin. Canlı modda ücretsiz metal oksit yarı iletken veya CMOS kamera sonraki kayıt. Görüntüyü hedefin odak noktasında görünene kadar kazancı artırın veya arama tablosunu ayarlayın.
Beş eksenli çevirmeni, 470 nanometrelik ışığın yama kablosunun SMA veya FC ucundaki lif üzerinde ortalanmasını sağlayan hedefe doğru ilerletin, ta ki kamerada bir görüntü çözülene kadar. Son olarak, görüntü ortalanana ve iyi çözülene kadar X ve Y eksenlerini ayarlayın. İzotropik bir daire olarak görünmesi gerektiği gibi, yama kablosunun variole ucundan yayılan ışığı görselleştirin.
Lifleri daha iyi görselleştirmek için tüm uyarma ışıklarını açarak başlayın. Ve kamera hiçbir piksel doymuş ve liflerin net bir görüntü mevcut olduğu gibi kazançlar ayarlayın. O zaman bir ön görüntü al.
Liflerin etrafına ilgi çekici bölgeler veya ROIS çizin. Ve kayıtlar sırasında ortalama yoğunluk değerlerinin ölçümü için saklayın. Birden fazla fiber kayıt için, tüm liflerden canlı kayıt yaparak bağımsızlar için test edin.
Bir lifi ışık kaynağına doğru işaretedin ve parmağınızla dokunun. Kanaldaki dalgalanmaları gözlemleyin. Daha sonra hangi YR'nin hangi fibere karşılık gelir etiketlemek için liflerin sonuna renkli bant uygulayın.
Son olarak, standları, kelepçeleri ve tutucuları kullanarak yama kablosunu arenanın üzerine asarak kayıt alanını ayarlayın. Son olarak, hayvan lif uzunluğu ile hareket sınırlı olmayacak ve serbestçe tüm arena boyunca hareket emin olun. Yama kablosunun liflerinin distal ucunu göz tarafından ve mini fiber mikroskobu ile inceleyerek başlayın.
Liflerin yüzeyi çizik ise, ince kum ile fiber parlatma filmi kullanarak lifleri yeniden parlatmak. Daha sonra yama kablosunun distal uçlarını %70 etanol ve pamuk uçlu aplikatör ile temizleyin. %70 etanol ve pamuk ucu aplikatörü kullanarak fiber optik kanülleri temizleyin.
Yama kablosunun variole ucunu, siyah bir shrink tüpüyle kaplanmış seramik bölünmüş bir kılıf kullanarak implante edilen elyafa bağlayın. Bağlantı sırasında, kılıfın sıkı olduğundan emin olun. Hayvanın birkaç dakika lığına iyileşmesini bekleyin.
Sonra optik sinyali kaydetmeye başlayın ve deneyi çalıştırın. Kayıt sırasında kaliteli kayıtları sağlamak için canlı izleme dikkatli bir göz tutmak. Ve kol yeterince sıkı olmadığını gösteren sinyal herhangi bir sıçramalar için izleyin.
Çift renkli kayıtlar için, kırmızı floresan kalsiyum sensörü ve uygun dikroik aynalar ve filtreler heyecanlandırmak için fotometri sistemine 516 nanometre LED ekleyin. Daha sonra yeşil ve kırmızı emisyon dalga uzunluklarını ayırmak için hedef ve CMOS kamera arasında bir görüntü ayırıcı ekleyin. Son olarak, kırmızı ve yeşil hem renk, tüm lifleretrafında ROIS çizin.
Her yatırım getirisini ilgili fiber ve kanalla net bir şekilde tanımladığından emin olun. 470 nanometre ve 560 nanometre LED ile eşzamanlı uyarma tetikleyin ve 410 nanometre LED ile değiştirin. Sonuçlar gösteriyor ki, ölçülen floresan lha-LHB yolunun aktivasyonu ile fareler için hava puffs uygulanması ile eş zamanlı olarak önemli ölçüde artmıştır.
Ancak, yeşil floresan protein veya GFP ifade farelerde, sinyal hiçbir değişiklik hava puffs uygulanması sırasında tespit edildi. Bu teknik, araştırmacıların farklı beyin bölgelerindeki belirli tipteki hücrelerden makul bir şekilde kayıt yapmasına olanak tanır. Bir hayvan özgürce davranırken.
Bu davranış ile ilgili olarak bu beyin bölgelerinin işlevlerini incelemek için yeteneği daha da ileri.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, kalsiyumdan bağımsız artefaktların düzeltilmesi ve çift renkli fotometri görüntüleme odaklanarak çok lifli fotometri kayıtlarının yapılması için bir protokol sunar. Bu teknik, davranışsal tepkiler sırasında belirli nöronal fonksiyonlara ilişkin bilgiler sağlayarak, serbestçe hareket eden hayvanlarda nöronal aktivitenin analizini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Görüntüleme Teknikleri
- Nöronal Aktivite İzleme
Arka Plan
- Fiber fotometri, genetik olarak tanımlanmış nöronal popülasyonların izlenmesini sağlar.
- Teknik, nöronal tepkilerin uyaranlara veya eylemlere tepkilerini incelemek için kritik öneme sahiptir.
- Ayrı sinyal işleme, arzu edilen sinyalleri gürültüden ayırmaya yardımcı olur.
Çalışmanın Amacı
- Çok lifli fotometri gerçekleştirmek için detaylı bir metodoloji belirlemektedir.
- Nöronal yolakların ve bunların davranışsal korelasyonlarının anlaşılmasını artırmak içindir.
- Fotometri kayıtlarında karşılaşılan yaygın artefaktlara çözümler sunmak içindir.
Kullanılan Yöntemler
- Protokol, görüntüleme teknikleri ile birleştirilmiş çok lifli fotometri kullanır.
- Hem yeşil hem de kırmızı floresan göstergeler için belirli kurulumlar açıklanmıştır.
- Önemli adımlar arasında lif konumlandırması, ışık ayarı ve ROI tanımlamaları yer alır.
- Yüksek kaliteli kayıtlar için fiber optik sistemin bakımı esastır.
Ana Sonuçlar
- Belirli yolaklara hava üflenmesi sırasında floresan seviyeleri artmıştır.
- Kontrol farelerinde sinyalde değişiklik gözlenmemiş, tekniğin özgüllüğü doğrulanmıştır.
- Fizyolojik koşullara göre nöronal tepkileri ayırt etme kapasitesi gösterilmiştir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, canlı hayvanlarda nöronal dinamikleri araştırmak için değerli bir metodoloji sağlar.
- Sinyalleri gürültüden ayırma kabiliyeti, kayıtların güvenilirliğini artırır.
- Davranış ve sinyal yollarındaki nöronal mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı geliştirmenin etkileri önemlidir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Multi-fiber photometry enables simultaneous monitoring of genetically defined neural populations across multiple brain regions in freely-moving animals, supporting target validation in neuroscience drug discovery. By correlating neural activity with behavioral responses, the technique provides mechanistic de-risking for CNS pathway modulation strategies. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking cellular activity to functional outputs in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring activity in genetically defined neuronal subpopulations during stimulus response.
- Operational Value: Enables functional target validation through real-time correlation of neural signaling with behavioral phenotypes.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by differentiating specific pathway activation from non-specific responses using control indicators.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated neural recording systems for downstream compound screening in behavioral paradigms.
- Quantitative Output: Generates fluorescence intensity measurements that serve as dependable readouts for neuronal activation states.
- Reproducibility: Standardizes signal acquisition through ROI definition and motion artifact correction, enabling cross-lab consistency.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Records from projection-defined and genetically isolated neurons to model human circuit dysfunction.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase target engagement with preclinical behavioral validation in freely-moving models.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by confirming on-target neural modulation prior to efficacy testing.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing dynamic neural activity readouts in intact behaving systems.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by isolating variable contributions of specific neural pathways to behavioral responses.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible neural activity measurements suitable for compound effect evaluation.
- Analytics: Enables quantitative comparison of conditions through fluorescence trajectory analysis and peak response metrics.
- Translational Research: Connects target modulation to functional outcomes in disease-relevant neural circuits.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for multi-site neural monitoring across therapeutic areas and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by reducing mechanistic ambiguity in CNS pathway interrogation.
- Operational Value: Ensures standardization and scalability through defined fiber labeling, ROI tracking, and artifact correction protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of biologically implausible targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through objective neural activity biomarkers linked to behavioral endpoints.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotactic surgery, viral vector delivery, and fiber optic implantation.
- Depends on stable light sources, filter cubes, CMOS cameras, and synchronized excitation control systems.
- Necessitates cross-team alignment between neuroscience, imaging, and behavioral science units for standardized ROI definition.
- Involves adaptation considerations for different brain regions, fiber lengths, and animal strains to maintain signal integrity.
- Includes practical limitations such as photobleaching over long recordings and signal attenuation in deep tissue, as noted in source material.
