Yetişkin Farede Koklear Yüzey Hazırlama
6 Kasım 2019
Bu makalede, yetişkin fare kokleae immünohistokimya için 10 mm yuvarlak kapak fişleri koklear epitel parçaları yapıştırmak için bir hücre ve doku yapıştırıcı kullanımı ve kireçlenme gerektiren değiştirilmiş bir koklear yüzey hazırlama yöntemi sunar.
Koklear yüzey preparatları immünohistokimya ve konfokal görüntüleme kullanarak Corti organının tüm lens görselleştirme sağlar. Bu geniş ilgi belirli koklear patolojilerin araştırılması için kullanılmıştır. Koklear mikrodiseksiyon yöntemini değiştireceğiz.
Bu tekniğin en büyük avantajı, birden fazla yıkama adımı sırasında doku kaybını önlerken immünetiketleme işlemi için koklear epitel in 10 milimetre lik yuvarlak kapaklara yapışmasidir. Buna ek olarak koklear patolojiler, koklear yüzey hazırlama da değerlendirme ekspresyonu ve saç hücre rejenerasyonu için kullanılabilir. Bu teknik için temel mikroskop becerileri gereklidir ve yöntemin görsel gösterimi her adımın doğru şekilde gerçekleştirilmesini sağlamaya yardımcı olabilir.
Prosedürü gösteren Qiaojun Fang, benim laboratuvar bir yüksek lisans öğrencisi olacaktır. Temporal kemik çıkarma için, hemen post-mortem kafatası kemik ortaya çıkarmak için ön deri çekin ve kafatasının orta hattı boyunca ileri arka açıdan kemik kesmek için makas kullanın. Başparmak ve işaret parmağını kullanmadan önce beyin dokusunu çıkarmak için pratisyen hekimler kullanın ve üç aylık veya daha büyük farelerden zamansal kemikleri elle çıkarın.
Kemikleri bir diseksiyon mikroskobu altında taze buz soğuk% 4 PFA ve PBS içeren 30 milimetre çapında Petri çanak içine yerleştirin ve oval pencereden stapes kaldırın. Beş numaralı forsepsile yuvarlak pencere zarını delin ve kokleanın doruk larına küçük bir delik açmak için taze %4 PFA içeren bir mililitreşşile bağlı 27 kalibrelik bir iğne kullanın. Çözelti tepedeki küçük delikten yıkana kadar yuvarlak ve oval pencereler aracılığıyla kokleayı yavaşça ve yavaşça fiksatif bir çözümle perfitleyin.
Daha sonra iki perfüzyon kokleae'yi şişe başına 10 mililitre lik %4'lük PFA içeren tek tek 20 mililitrelik sintillasyon şişelerine aktarın ve numuneleri oda sıcaklığında iki saat boyunca hafifçe çalkalayın ve ardından bir rotatörde dört santigrat derecede geceleme işlemini takip edin. Ertesi sabah kokleayı yıkama başına taze PBS ile üç beş dakikalık yıkar ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, her şişeye %4 EDTA'dan 20 mililitre ekleyin ve numuneleri 48 saat boyunca dört derece santigrat derecede hafif bir ajitasyonla döndürün.
Kuluçka sonunda, numunelerin elastikiyetini değerlendirmek için her kokleanın kemikli vestibüler kısmına forceplerle dokunun. Kemikler sert yerine elastik ise, koklea dekalcified edilmiştir. Her numune için EDTA'yı taze PBS ile değiştirin.
Koklear epitelin mikrodiseksiyonu için temporal kemiğin vestibüler kısmını forsepslerle tutarak ve apikal dönüşü 45 derecelik açıyla kesmek için neşter kullanın. Vestibüler kısımdan kokleayı ayırmak için yuvarlak pencere ile oval pencere arasındaki soluk çizgi boyunca dikey olarak kesin ve koklear kısmı alt ve orta kısıma doğru çeviren koklear kısmı Petri kabının tepesine doğru çevirin. Bu konumdan, apikal bölüm kaldırıldı sonuna doğru orta dönüş kemikkapsül ve lateral duvar kesilmiş ve bazal ve kanca bölgelerinden tamamen orta kısmını ayırmak için kesme ye devam.
Çanak altına doğru yönlendirilmiş bazal ve kanca kısmı basilar membran site ile yerleştirerek, dikey medialis kaldırmak için kanca bölgeden medialis kesip ve kanca kısmını ayırmak için bazal ve kanca bölgeleri kesti. Doku bozulmasını önlemek için, bazal dönüş ve kanca bölge ayırmadan önce kanca bölgeden medialis kesti. Orta dönüş kemikkapsül ve lateral duvar dokusunun nispeten büyük bölümlerini kesip ve Petri kabının alt kemik kapsül ve lateral duvar hizalamak için forceps ile lateral duvar tutarak, baziler membran tarafında bu dokuları kesti.
Daha sonra, duyusal saç hücresi yüzeyi yan yönlendirmek ve kemik kapsülü ve lateral duvarın geri kalanını kırpmak için örnek düzleştirmek. Sonra tamamen orta bölge ayırmak ve kemik kapsülü kaldırmak için tektorial membran kaldırmak için forceps kullanın, lateral duvar dokusu, ve sadece gösterildiği gibi kalan döner tektorial bölgeleri. Koklear dönüşlerin tamamı incelendiğinde, 0,5 mikrolitre hücre ve doku yapıştırıcısını bir yuvarlak 10 milimetrelik kapak lının ortasına yayın ve yapıştırıcının oda sıcaklığında 3-5 dakika kurumasını bekleyin.
Kurutulmuş kapakları Petri kabına yerleştirin ve her duyusal epitel örneğinin dört parçasını da bir kapak içine yerleştirin. Daha sonra her örtünün bir kenarını kavramak için forseps kullanın ve numuneleri immünetiketleme için dört kuyulu bir hücre kültür yemeğinin ayrı kuyularına aktarın. Yüzey koklear sinaps preparatlarının immünetiketlemesi için, her duyusal epiteli her bir taze PBS'de beş dakika boyunca üç kez yıkayın ve ardından her numunenin iki mililitre 2%2 iyonik olmayan yüzey aktif madde ile bir rotatörde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca tedavi edin.
Kuluçka sonunda, her kuyudan sürfaktan çözeltisi aspire ve oda sıcaklığında nazik ajitasyon ile rotator üzerinde bir saat boyunca kuyu başına bloklama çözeltisi 100 mikrolitre ile herhangi bir nonspesifik bağlama blok. Engelleme kuluçka sonunda, 37 santigrat derece ışıktan korunan 24 saat boyunca ilgi birincil antikorların 100 mikrolitre ile etiketleme den önce nazik ajitasyon altında gösterildiği gibi PBS ile üç kez örnekleri yıkayın. Ertesi gün, numuneleri taze PBS ve yıkama başına hafif ajitasyon ile üç kez yıkayın ve numuneleri ışıktan korunan 37 santigrat derecede iki saat boyunca uygun ikincil antikorlardan 100 mikrolitre ile etiketleyin.
Kuluçka sonunda, numuneleri her bir kapak kapağını tek tek cam mikroskop slaytlarına yerleştirmeden önce yıkama başına taze PBS'de üç beş dakikalık yıkama ile yıkayın. Daha sonra, her coverslip'in ortasına uygun bir montaj ortamının sekiz mikrolitresini dikkatlice ekleyin ve her numunenin üzerine 10 milimetrelik bir kapak daha takmak için forceps kullanın. Sonra net oje ile her coverslip sandviç kenarları mühür, bir karton slayt klasörüne örnekleri yerleştirin ve dört derece santigrat slaytlar saklayın.
Yüzey preparatları için yetişkin fare koklealarının diseksiyonu basit olmasa da, teknikte yeni olan araştırmacılar 10-15 kulakla pratik yaptıktan sonra yöntemi öğrenebilmelidir. Tedavi edilmeyen 10-12 haftalık CBAJ farelerin CTBP2 ve GluA2 ile yüzey preparatlarının immünetiketlemesi, hem presinaptik şeritlerin hem de postsinaptik terminallerin sırasıyla iç saç hücre çekirdeklerinin altında yer alan ve fonksiyonel sinapsları gösteren yan yana olduğunu göstermektedir. Miyozin 7A için immünetiketleme ve phalloidin ve DAPI ile karşı boyama dış saç hücreleri ve iç saç hücreleri ve çekirdekleri de dahil olmak üzere duyusal saç hücrelerinin varlığını ortaya koymaktadır.
Miyozin 7A için immünetiketleme ve phalloidin ile karşı boyama hücre ve doku yapıştırıcısı kullanımı ile veya olmadan immünoreaktivite veya tekdüzelik hiçbir fark gösterir. Buna ek olarak, tedavi edilmeyen altı ila sekiz haftalık C57 siyah 6 farelerden yüzey preparatlarının taramaelektron mikroskobu, numunenin üç sıra içinde dış saç hücrelerinin iyi organize edilmiş V şeklinde bir stereosilya sını göstermektedir. Çözelti tepedeki küçük delikten yıkana kadar koklearı yuvarlak ve oval pencerelerden hafifçe ve yavaşça sabitleştirici solüsyonla doldurmayı unutmayın.
Kanca bölgesini bazal dönüşten ayırmadan önce, medialis'in kaldırılmasını kolaylaştırmak için medialis'i kanca bölgesinden kesmeye özen.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, yetişkin fare koklealarında immünohistokimya için dekalsifikasyon ile hücre ve doku yapıştırıcısı kullanan modifiye edilmiş bir koklear yüzey hazırlama tekniğini tanıtmaktadır. Bu yöntem, koklear patolojilerin ve tüy hücresi rejenerasyonunun incelenmesini kolaylaştırmayı amaçlayarak Corti organının görselleştirilmesini geliştirmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Histoloji
Arka Plan
- Koklear yüzey preparatları, Corti organının tamamen görüntülenmesini sağlar.
- Bu teknik, koklear patolojilerin incelenmesi için temel öneme sahiptir.
- Yapılan modifikasyon, immünlebelama işlemi sırasındaki doku kaybını azaltmayı amaçlamaktadır.
- Bu preparatların anlaşılması, tüy hücresi ekspresyonu ve rejenerasyonu üzerine yapılan çalışmaları geliştirmektedir.
Çalışmanın Amacı
- Koklea yüzey hazırlığı için geliştirilmiş bir metodoloji sunmak.
- Koklea kesitlerinin lamellere tutunmasını artırmak.
- Çeşitli koklear durumların ve tedavilerin değerlendirilme potansiyelini belirlemek.
Kullanılan Yöntemler
- Kullanılan ana platform, ex vivo koklear preparasyon yöntemidir.
- Biyolojik model, post-mortem olarak işlenen yetişkin fare koklealarını içerir.
- Adımlar, EDTA kullanılarak dekalsifikasyon ve koklear bölgelerin dikkatli bir şekilde mikrodiseksiyonunu kapsar.
- İmmünlekelemenin artırılması için koklear parçalar, özel bir yapıştırıcı kullanılarak lamellere yapıştırılır.
- İmmünohistokimya; yıkama, sürfaktan uygulaması, bloklama ve antikor lekeleme adımlarını içerir.
Temel Sonuçlar
- Modifiye edilmiş yöntem, koklear dokuların etkili bir şekilde yapışmasını sağlayarak daha iyi görüntüleme imkanı sunar.
- Başarılı immünlekeleme, koklear yapıların detaylı görselleştirilmesini sağlar.
- Bu teknik, koklear fonksiyon ve patoloji üzerine geliştirilmiş çalışmalar yapılmasına olanak tanır.
- Sonuçlar, tüy hücresi rejenerasyonunun dinamiklerinin anlaşılmasına yardımcı olur.
Sonuçlar
- Bu çalışma, detaylı histolojik analizler için koklea örneklerinin hazırlanmasına yönelik güvenilir bir yaklaşım sunmaktadır.
- Uygulanan metodoloji, koklea sağlığı ve hastalık mekanizmalarıyla ilgili gelecekteki çalışmalara yardımcı olacaktır.
- Elde edilen bilgiler, işitme kaybı ve tüy hücresi hasarını hedefleyen terapötik stratejilere katkı sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
Koklea yüzey hazırlığı, Corti organının detaylı histolojik analizine olanak tanıyarak işitsel araştırmalarda hedef doğrulamasını destekler. Bu yöntem, ototoksik bileşiklerin ve rejeneratif tedavilerin değerlendirilmesi için kritik olan tüy hücresi bütünlüğünün ve sinaptik yapıların görselleştirilmesine imkan vererek mekanistik risklerin azaltılmasını kolaylaştırır. Bu yaklaşım, koklear patolojinin kantitatif ve tekrarlanabilir çıktılarını sağlayarak, işitme kaybının preklinik modellerindeki öngörü güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Tüy hücresi sağkalımı ve ribbon sinaps korumasıyla ilgili terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Presinaptik (CTBP2) ve postsinaptik (GluA2) belirteçlerin immünohistokimyasal değerlendirmesi yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Öngörücü Değer: Bileşik maruziyetini, sinaptik protein seviyelerindeki ve tüy hücresi yoğunluğundaki ölçülebilir değişikliklerle ilişkilendirerek mekanistik risk azaltma sağlar.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve çoklu etiketlemeye uygun, lamel camlar üzerinde standartlaştırılmış, yapışık koklear epitel üretir.
- Tekrarlanabilirlik: Hücre ve doku yapıştırıcısı aracılığıyla yıkama basamakları sırasındaki doku kaybını en aza indirerek tekrarlar arasındaki analiz tutarlılığını artırır.
- Ölçeklenebilirlik: Çok kuyucuklu formatlarla uyumludur ve bileşik taraması için birden fazla koşulun paralel olarak işlenmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlişkisi: Nicelendirilebilir tüy hücresi ve sinaps kaybı aracılığıyla, gürültü maruziyeti ve ototoksisite gibi işitme kaybı etiyolojilerini modeller.
- Translasyonel Süreklilik: Rejenerasyonun ve protein ekspresyon değişimlerinin boylamsal değerlendirmesine olanak tanıyarak, keşif bulgularını preklinik doğrulamaya bağlar.
- Riske Göre Ayarlanmış Kararlar: Corti organındaki yapısal ve moleküler sonlanım noktalarına dayalı olarak devam/durdurma kriterlerini belirler.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulamadan öncü bileşik optimizasyonuna kadar olan keşif iş akışına entegre olarak, işitsel güvenlik farmakolojisinde mekanizma ve toksisitenin histolojik onayını sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Deneysel koşullar altında tüy hücreleri ve destek hücrelerindeki protein lokalizasyonunu görselleştirerek yolakların netleştirilmesini destekler.
- Tarama: İmmünlebelenmiş yapıların konfokal görüntülemesi yoluyla nicel çıktılar sağlayarak tedavi grupları arasında karşılaştırma yapılmasına olanak tanır.
- Analitikler: İstatistiki karşılaştırma için şerit sinaps sayıları ve tüy hücresi floresans yoğunluğu gibi ölçülebilir okumalar üretir.
- Translasyonel Araştırma: Rejenerasyon belirteçlerinin ve fonksiyonel iyileşme göstergelerinin değerlendirilmesi yoluyla preklinik süreklilikle bağ kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla terapötik modalite genelinde işitsel güvenlik değerlendirmesi için yeniden kullanılabilir bir histoloji platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Bileşikler ile koklear sonuçlar arasındaki mekanistik bağlantılardaki belirsizliği azaltarak hedef güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Yapıştırıcı tabanlı doku fiksasyonu ve optimize edilmiş yıkama protokolleri aracılığıyla standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Ototoksik riskin erken tespitini sağlayarak geç aşama kayıplarını azaltır ve sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Corti organının yapısal korunmasına dayalı olarak bileşiklerin riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Yetişkin farelerden mikrosirürjikal diseksiyon ve temporal kemik ekstraksiyonu konusunda uzmanlık gerektirir.
- Dekalsifikasyon reaktiflerine (EDTA), tespit ajanlarına (PFA) ve immünohistokimya altyapısına erişime bağlıdır.
- Diseksiyon zamanlaması, yapıştırıcı uygulaması ve görüntüleme parametrelerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Tekniğin farklı fare suşlarına veya gelişimsel yaşlara uygulanması sırasında adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Yeterlilik için 10–15 kulaklık bir öğrenme eğrisinde belirtildiği üzere, tutarlı mikrodiseksiyon ve doku işleme için gereken teknik beceri ile sınırlıdır.
