Name: Tüm Zebrabalığı Embriyolarının Uzun Zaman Atlamalı Konfokal Mikroskobu için Katmanlı Montaj Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Öğrenin, Danio rerio embriyoları için uzun zaman atlamalı konfokal mikroskopi görüntüleme yöntemini. Bu katmanlı montaj tekniği, embriyoların sabit kalmasını sağlarken sınırsız büyümelerine olanak tanır ve diğer küçük sucul modellere uyarlanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Albert Pan ve Arndt Sieakmann'a transgenik balık hediyeleri için teşekkür ederiz. Biz Genetik Ulusal Enstitüsü'nde Koichi Kawakami teşekkür, Eğitim Bakanlığı Ulusal BiyoKaynak Projesi, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Japonya transgenik zebra balığı HGn39bhediye için . Ayrıca Fatima Merchant ve Kathleen Gajewski'ye konfokal mikroskopi konusunda yardımcı lıkları için ve Tracey Theriault'a da fotoğraflar için teşekkür ederiz.
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü'nün (p30ES023512 hibe numarası ve HHSN2732015000010C) hibeleri ile desteklenmiştir. SU Keck Hesaplamalı Kanser Biyolojisi programı (Gulf Coast Consortia CPRIT hibe RP140113) ve Hugh Roy ve Lillie Bağış Fonu tarafından bir burs tarafından desteklendi. J-Å G, Robert A. Welch Vakfı (E-0004) tarafından desteklendi.

Burada sunulan hayvan çalışmaları Houston Üniversitesi ve Indiana Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (IACUCs) tarafından onaylanmıştır.
1. Balık yetiştiriciliği
NOT: Omurgalı modelleri ile çalışmak iACUC onaylı bir protokol gerektirir. İlgili ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak yürütülmelidir.
<ol><li>Daha önce yayınlanmış literatürde açıklandığı gibi yetişkin zebra balığı koruyun9.</li>
	<li>Öğleden sonra, üreme tankları yetişkin zebra balığı yerleştirin. Erkekleri dişilere 1:2 oranında yetiştirin.</li>
</ol>2. Çözümlerin hazırlanması
<ol><li>Embriyo medyasında %1 düşük erime agarose bir stok çözeltisi olun (E3: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4, pH 7.0 ayarlanır). Aliquot stok çözeltisi 1,5 mL tüpler halinde ve 4 °C'de saklayın.</li>
	<li>Distile suda %4 (w/v) Tricaine (MS-222) stok çözeltisi yapın. 4 °C'de koyu renkli bir şişede saklayın. DİkKAT: Triain toksiktir ve tartılmalı ve duman kaputunda çözülmelidir.</li>
	<li>Distile suda 20 mM N-fenilthiourea (PTU) stok çözeltisi yapın. -20 °C'de saklayın.</li>
</ol>3. Embriyoların hazırlanması
<ol><li>Miteledikten sonra, E3'teki embriyoları petri kabında hasat edin ve montajdan önce 26.5 °C'de yaklaşık 28 saat kuluçkaya yatırın. NOT: Bu embriyoların gelişimini yavaşlatar, böylece embriyolar görüntülemenin başlangıcında yaklaşık 30 somite evresindedir.</li>
	<li>E3'te %0.016-0.020 Trikaine embriyoları anestezi. Pigmentasyonu inhibe etmek için, 200 μM konsantrasyonuna PTU ekleyin.</li>
	<li>Embriyoları bir diseksiyon mikroskobu altında forceps kullanarak dechorionate. İki forceps kullanarak, kavrama ve yavaşça ayrı embriyo serbest bırakmak için chorion çekin.</li>
</ol>4. Agarose montaj
NOT: Geliştirilen montaj yöntemi, gerektiğinde %0,02 Tricaine ve PTU ile E3'te iki farklı düşük erime agarose konsantrasyonu gerektirir. İlk agarose çözeltisi distorsiyon ve hareketliliğin en az olduğu optimal agarose konsantrasyonu içerir. Optimizasyon aşağıdaki adım 5'te açıklanmıştır.
<ol><li>Isı iki tabaka için agarose çözeltileri (konsantrasyon aşağıda adım 5 ve% 1 tanımlanan) 65 °C'ye kadar. Agarose'un montajdan hemen önce yaklaşık 30 °C'ye soğumasını bekleyin ki embriyo ısıdan zarar görmesin. Montaj için, No. 0 kapaklı cam alt 35 mm cam alt tabaklar kullanın. Yemeğin dibine takılan kapak camı, embriyonun yerleştirilmeye devam edilebilecek 10 mm sığ (yaklaşık 1,2 mm derinliğinde) bir kuyu oluşturur. NOT: Bu durumda en az hareketlilik ve distorsiyoniçeren konsantrasyon %0,025 ile %0,040 arasında ydı.</li>
	<li>Yavaşça bir cam pipet veya mikropipet kullanarak yemeğin altına doğru onun yanal yanlarından biri ile dechorionated embriyo yerleştirin. Bir mikropipet kullanıyorsanız, embriyoya uyacak şekilde açıklığın boyutunu artırmak için ucun dış kısmını kesin(Şekil 1A). Kalan E3'leri mikropipetle dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Embriyoyu (Katman 1) kapsayacak şekilde yemeğin altına bağlı kapak camı tarafından oluşturulan küçük kuyuya ilk agarose çözeltisini ekleyin(Şekil 1B). Agarose küçük kuyuyu kapladığından emin olun ama taşmaz.</li>
	<li>İki kapak gözlüğü arasında embriyo ile dar bir agarose dolu alan oluşturmak için bir kapak camı (22 mm x 22 mm)(Şekil 1C)ile küçük kuyukapağı.</li>
	<li>Yemeğin alt kısmında ki kapak camı nın üzerine%1'likagarose çözeltisi katmanı yerleştirin (Katman 2) (Şekil 1D). Bu tabaka katılanınca kapak camı yerinde tutar.</li>
	<li>Sistemin sulu kalmasını sağlamak için yemeğin kalan kısmını %0,02 Trikain içeren E3 ile doldurun (Katman 3)(Şekil 1E). NOT: Bu kurulumda, kapak camı ve %1 agarose alt katmanı seyreltmekten korur.</li>
</ol>5. Katman 1 için agarose çözeltisinin optimizasyonu
<ol><li>Katman 1 için agarose'un en uygun konsantrasyonunu belirlemek için çok ölçekli ızgara arama yaklaşımını kullanın. Agarose artan konsantrasyonlarda Montaj embriyolar% 0.01 ile% 1 arasında değişen embriyo büyüme kısıtlaması ve görüş alanında hareketlilik zaman atlamalı görüntüleme izledi. Hem distorsiyon hem de hareketliliğin minimum olduğu konsantrasyonları belirleyin.</li>
	<li>Agarose konsantrasyonunu daha da optimize etmek için, embriyoları adım 5.1'de en iyi olduğu tespit edilen konsantrasyona bağlı olarak (örn. 0.025 ile %0.040 arasında) daha ince bir agarose konsantrasyonaralığı (örn. 0.025 ile %0.040 agarose) kullanarak monte edin (örn. %0.025, %0.028, %0.031, vb.). NOT: Laboratuvarımızda optimal agarose konsantrasyonu %0.03 civarındaydı.</li>
</ol>6. Hızlandırılmış görüntüleme
NOT: Bu montaj yöntemi floresan ve parlak alan görüntüleme için zaman atlamalı işlevselliği ile herhangi bir ters mikroskop için çalışır.
<ol><li>55 saate kadar tüm embriyo veya parçaları için hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirin. Birkaç embriyo görüntüleme için, çanak başına monte edilmiş bir embriyo ile çeşitli yemekler tutan bir sahne adaptörü kullanın. Embriyolar yaklaşık yatay olarak göz tarafından belirlenen konumlandırılmış böylece bulaşıkları tek tek döndürün. Optimal embriyo büyümesi ve gelişimi için, 28,5 °C'de ayarlanmış bir kuvözlü mikroskop aşaması kullanın.</li>
	<li>Mikroskop yazılımında düşük büyütme hedefi seçin. Göz parçasının altında, parlak alan aydınlatması kullanarak yemekleri yatay olarak embriyoları bulun ve ince bir şekilde hizalayarak ve konumlarını yazılıma kaydedin. Verilerin otomatik olarak kaydedilmesi için bir dosya adı oluşturun. NOT: Bu deneyde, embriyoların yerlerini kaydetmek için bir apo λ 4x 0.2 NA hedefi ve ND kazanım penceresi içindeki XY sekmesi kullanılmıştır. Veriler .nd2 biçiminde kaydedildi. Amaç, Ti Pad sekmesindeki simgelerine tıklayarak seçildi.</li>
	<li>İğne deliği boyutunu, tarayıp hızını, görüntü boyutunu ve yakınlaştırmayı ayarlayın. Ardından, görüntüleri yakalamak için daha yüksek bir büyütme hedefi seçin. NOT: Bu deneyde, tüm embriyoların görüntülenmesi için bir plan-apo 10x 0.45 NA hedefi, embriyoparçalarının daha yüksek büyütme görüntülemesi için süper flor 20x 0.75 NA hedefi kullanılmıştır. İğne deliği 1,2 AU (10x lens için 19,2 m) olarak ayarlanmış, taramaya hız 2,4 μs piksel çalışma süresi için ayarlanmış ve görüntü boyutu 10x lens için 1,24 μm piksel boyutu vererek, bir tazyik yakınlaştırma ile 1024 x 1024 piksel olarak ayarlanmışve 20x lens için 0,62 m.</li>
	<li>Floresan için görüntülenecek kanalları seçin. Görüntü yakalama ayarlarını her seferinde bir kanalda ayarlayın. Her floresan kanalı için lazer gücünü ve dedektör yüksek voltajını ayarlayın, doygunluğu önlerken ve fotobeyazrlamayı sınırlandırırken mümkün olan en iyi dinamik aralığı topladığızdan emin olun. NOT: Bu deneyde, GFP 488 yeşil kanal ile görüntülendi , (488 nm lazer ve emisyon arasında 500 ve 550 nm), ve RFP 561 kırmızı kanal (561 nm lazer ve emisyon arasında 570 ve 600 nm), ve iletim görüntü 561 nm lazer ve iletilen ışık dedektörü(TD kanalı)kullanılarak toplandı.</li>
	<li>10x hedefi ile tüm embriyo görüntü için, örtüşme ile görüş çeşitli alanlarda görüntü ve mikroskop yazılımı kullanarak onları bir araya dikiş. NOT: Embriyolar görüntüleme sırasında önemli ölçüde büyüyeceğinden, görme ön ve embriyo posterior alanında yer olduğundan emin olun. ND edinme penceresinin Büyük Görüntü Takını sekmesini kullanın ve dört bitişik görüş alanını yakalamak için %10 çakışan 4 x 1 deseni seçin.</li>
	<li>Mikroskop yazılımını kullanarak Z-yığınlarını yakalamak için ayarları yapılandırın. NOT: Embriyo cam kabın dibine yakın monte olduğundan, merkezi büyüdükçe alttan uzaklaşacaktır. ND edinme penceresinin Z sekmesini kullanın ve Asimetrik göreli aralığıseçin. Bu yöntemle, mevcut odak düzlemi Referans düzlemi olarak kullanılır ve uçakların geri kalanı asimetrik olarak z-yığın hacmi içinde tüm embriyo dahil etmek için yukarıda ve aşağıda dağıtılır, numunenin büyümesini hesaba katmak için yeterli alan ile. Tüm deneylerde, aralık 11 μm ve yaklaşık 45 düzlemler için toplam aralığı ayarlandı.</li>
	<li>Uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme sırasında birden fazla embriyonun odak noktasını korumak için otomatik bir odak kullanın. Birkaç embriyo görüntüleseniz, her embriyo için ayrı ofset düzeylerini Referans düzlemineodaklanmak için ayarlayın. NOT: Bu deneyde lazer tabanlı odak sabitleme sistemi kullanılmıştır.</li>
	<li>Mikroskop yazılımında ve görüntüde yaklaşık 1 saat aralıklarla 55 saat süreyle hızlandırılmış parametreler ayarlayın. Her döngüde, iki embriyo veri kümesini sırayla yakalayın ve her döngüden sonra verileri otomatik olarak kaydedin.</li>
	<li>Mikroskop yazılımının çevrimiçi veya çevrimdışı sürümünü kullanarak görüntüleri işleyin. Birden fazla embriyo görüntülenmişse, görüntüleme nin konumuna göre veri kümesini bölerek her embriyo için bağımsız dosyalar oluşturun. 3B zaman veri kümelerini 2B zaman veri kümelerine dönüştürmek için maksimum yoğunlukprojeksiyonlarını veya benzer bir aracı kullanın. Dosya biçimi olarak .avi'yi seçerek menü olarak Kaydet seçeneğini kullanarak film dosyaları oluşturun. 5 kare /s oynatma hızı için 200 ms aralıklı Sıkıştırma Yok seçeneğini seçin. NOT: Bu deneydeki iki embriyonun orijinal veri kümesi, yazılımdaki Split konumları işlevi kullanılarak bölündü (Dosya | İthalat /İhracat | Çok Noktaları Böl). 3B zaman veri kümeleri Maksimum yoğunluklu projeksiyon işlevi kullanılarak 2B zaman veri kümelerine dönüştürüldü (Resim | ND İşleme| Z'de Maksimum Yoğunluklu Projeksiyon Görüntüsü Oluşturun).</li>
</ol>

<ol><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+mounting+enables+long-term+imaging+of+zebrafish+development+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope.</a> Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).</li>
<li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nature Communications. 4, 2207(2013).</li>
<li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).</li>
<li>Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+silicone+imaging+casts+for+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae.</a> Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).</li>
<li>Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+orientation+tools+for+automated+zebrafish+screening+assays+using+desktop+3D+printing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing.</a> BMC Biotechnology. 14, 36(2014).</li>
<li>Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Four-Well+Dish+for+High-Resolution+Longitudinal+Imaging+of+the+Tail+and+Posterior+Trunk+of+Larval+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish.</a> Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).</li>
<li>Hirsinger, E., Steventon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Mounting+Method+for+Long+Term+Imaging+of+Zebrafish+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development.</a> Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> Journal of Visualized Experiment. (69), e4196(2012).</li>
<li>McCollum, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+exposure+to+sodium+arsenite+perturbs+vascular+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).</li>
<li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrabow%3A+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).</li>
<li>Asakawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits+by+Tol2+transposon-mediated+Gal4+gene+and+enhancer+trapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).</li>
<li>Nagayoshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+by+the+Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+approach+generated+mutations+in+two+developmental+genes%3A+tcf7+and+synembryn-like%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like.</a> Development. 135 (1), 159-169 (2008).</li>
<li>Huang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+use+of+MS-222+%28tricaine%29+and+isoflurane+extends+anesthesia+time+and+minimizes+cardiac+rhythm+side+effects+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).</li>
<li>Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+effects+of+chemical+immobilization+on+the+heart+rate+of+embryonic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animal+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish.</a> Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).</li>
<li>Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Long-Term+Imaging+of+Embryos+with+Genetically+Encoded+alpha-Bungarotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin.</a> PLoS One. 10 (8), 0134005(2015).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Tüm zebra balığı embriyolarının uzun süreli konfokal mikroskopisi için bir montaj yöntemi burada açıklanmıştır. Montaj yöntemi için en kritik adım sınırsız zebra balığı embriyo büyümesi için izin verecek agarose optimal konsantrasyonu belirlemek için, ve aynı zamanda konfokal görüntüleme için tamamen sabit bir konumda embriyotutmak. Agarose'un optimum konsantrasyonu çok dar olduğundan, bu değer çözeltinin hazırlanması sırasında agarose'un ağırlığının ve E3 hacminin ölçülmesindeki hatalara karşı çok hassastır. Optimal kon...

Zebra balığı uzun gelişimbiyolojisi için örnek bir organizma olmuştur ve mikroskopi embriyonik gelişimi görselleştirmek için önemli bir yöntemdir. Gelişimsel çalışmalar için zebra balığı embriyoları kullanmanın avantajları küçük boyut, optik netlik, hızlı gelişme ve yetişkin balıkların yüksek fecundity içerir. Bazı doku veya hücrelerde floresans ifade transgenik zebra balığı hatları nesil büyük omurgalı hayvanlar ile mümkün olmayan şekillerde doku gelişiminin doğrudan görselleştirilmesi için izin verdi. Zaman atlamalı mikroskopi ile birlikte doku gelişiminin ayrıntıları ve dinamikleri kolayca incelenebilir.
Zebra balığı gelişimini görüntülemede bir zorluk, embriyoların uzunluklarının önemli ölçüde büyümesidir; embriyo yaşamın ilk 3 gün içinde dört kez uzunluğunu uzatır1. Ayrıca, erken embriyo vücut yumuşak, ve büyüme sınırlı ise kolayca deforme olur. Ancak, konfokal mikroskopi yapmak için, embriyo immobilize edilmelidir. Konfokal zaman atlamalı görüntüleme için embriyoları sabit bir pozisyonda tutmak için düzenli olarak anestezi edilir ve %0.3-1 düşük erime li agarose monte edilirler. Bu embriyo hareketlerini kısıtlarken, belirli bir süre için görüntüleme sırasında bazı büyüme için izin avantajı vardır. Embriyonun bazı bölümleri verimli bir şekilde bu şekilde görüntülenebilir. Ancak, uzun süre tüm embriyo görüntüleme için bu yöntem kullanılarak, bozulmalar nedeniyle sınırlı büyüme nedeniyle agarose neden görülür. Bu nedenle, diğer montaj yöntemleri gereklidir. Kaufmann ve arkadaşları hafif levha mikroskopisi için zebra balığı embriyolarının alternatif montaj tarif var, seçici düzlem aydınlatma mikroskopisi gibi (SPIM), florlu etilen propilen embriyolar embriyolar monte ederek (FEP) agarose veya metilselüloz düşük konsantrasyonlarda içeren tüpler2. Bu teknik zaman içinde embriyogenezin mükemmel bir görselleştirme üretir. Schmid ve ark. bir görüntüleme seansında çeşitli embriyoların görselleştirilmesini sağlayan ışık sayfası mikroskopisi3 için FEB tüplerinde agarose'da altı embriyonun montajını tanımlar. Kalıplar embriyoların daha büyük sayıda verimli montaj için embriyo dizileri oluşturmak için kullanılmıştır4. Masselkink ve ark. farklı aşamalarında zebrabalığı embriyoları yerleştirilebilir silikon dökümleri yapmak için kullanılabilecek 3D baskılı plastik kalıplar inşa etmiş, görüntüleme için sabit bir konumda montaj sağlayan, confocalgörüntülemedahil 5 . 3D baskı da 96-iyiformat6zebra balığı embriyolarının tutarlı konumlandırma için kalıp yapmak için kullanılmıştır. Bazı kalıplar belirli aşamalar için özelleştirilmiştir ve uzun süreler boyunca sınırsız büyümeye izin vermezken, diğer kalıplar daha esnektir. Son zamanlarda, Weijts ve ark. zebrabalığı embriyolarının canlı görüntüleme için dört kuyulu bir çanak tasarım ve imalat yayınlandı7. Bu çanak, kuyruk ve anestezi balık embriyolarının gövde bir cep oluşturmak için bir kapak cam hemen üzerinde bağlı net bir silikon çatı altında manuel olarak yerleştirilir. Embriyo daha sonra % 0.4 agarose ilavesi ile bu pozisyonda sabitlenir. Bu montaj embriyonun yaklaşık 2 mm uzunluğundaki arka kısmının (gövde ve kuyruk) görüntülenmesine olanak sağlar ve her kuyuya 12 embriyo monte edilebildiği için, yöntem birden fazla numunenin görüntülenmesine olanak sağlar. Benzer şekilde, Hirsinger ve Steventon son zamanlarda balık başı agarose monte edildiği bir yöntem sundu, kuyruk serbestçe büyüyebilir iken, ve bu yöntem de verimli embriyo gövde ve kuyruk bölgesinin görüntüleme kolaylaştırır8.
Bu makalede, sınırsız büyüme için izin verirken embriyoların hareketlerini kısıtlayan zebra balığı embriyoları için katmanlı bir montaj yöntemi açıklanmaktadır. Bu montaj yönteminin avantajları, herhangi bir ters mikroskop kullanarak görüntüleme için çeşitli aşamalarda embriyomonte etmek için düşük maliyetli, hızlı ve kolay bir yöntem olmasıdır. Montaj embriyo gelişimi sırasında tüm vücudun uzun süreli görüntüleme izin verir (baş, gövde ve kuyruk). Bu yöntemin kullanılabilirliğini göstermek için transgenik balıklarda tüm embriyo vasküler, nöronal ve kas gelişimi görüntülendi. Seans başına iki embriyo, 3Boyutlu iki dalga boyunda, doku gelişimi filmlerini işlemek için 55 saat üst üste hızlandırılmış mikroskopi ile görüntülendi.

<table><tbody><tr><td>Düşük erime noktalı agaroz</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>A9414</td><td>Çözünmüş çözeltiyi 4 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>35 mm cam tabanlı tabaklar, No. 0 lamel ve 10 mm çapında cam taban</td><td>MatTek Corporation, MA</td><td>P35GCOL-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Trikain (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>E10521</td><td>Çözünmüş çözeltiyi 4 &°C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>N-feniltiyoüre (PTU)</td> <td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P7629</td><td>Çözünmüş çözeltiyi -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Mikro kapak camı 22x22 mm</td><td>VWR</td><td>48366 067</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMi8 floresan mikroskobu</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>LAS X yazılımı</td><td>Leica</td><td>NA</td><td>Mikroskop yazılımı</td></tr><tr><td>DMC4500 dijital mikroskop kamerası</td><td>Leica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1S konfokal mikroskop</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Nikon NIS AR Sürüm 4.40</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>NA</td><td>Mikroskop yazılımı</td></tr></tbody></table>

tüm zebrabalığı embriyolarının uzun zaman atlamalı konfokal mikroskobu için katmanlı montaj yöntemi

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Gelişim dinamikleri, belirli doku veya hücrelerde floresans ifade canlı transgenik zebra balığı embriyolarının konfokal zaman atlamalı mikroskobu ile takip edilebilir. Tüm embriyo gelişimini görüntülemede bir zorluk zebra balığı embriyolarının uzunlukları önemli ölçüde büyümek olduğunu. Düzenli olarak% 0.3-1 düşük erime agarose yapılır monte edildiğinde, agarose yumuşak embriyo vücudunda bozulmalara yol açan, büyüme kısıtlaması uygular. Ancak, konfokal zaman atlamalı mikroskopi yapmak için, embriyo immobilize edilmelidir. Bu makalede, sınırsız büyüme için izin verirken embriyoların hareketliliğini kısıtlayan zebra balığı embriyoları için katmanlı bir montaj yöntemi açıklanmaktadır. Montaj farklı konsantrasyonlarda agarose katmanları yapılır. Bu yöntemin kullanılabilirliğini göstermek için, tüm embriyo vasküler, nöronal ve kas gelişimi transgenik balıklarda 55 saat üst üste görüntülendi. Bu montaj yöntemi kalıp veya özel ekipman gereksinimleri olmadan ters mikroskoplar kullanarak tüm zebra balığı embriyolarının kolay, düşük maliyetli görüntüleme için kullanılabilir.

Montaj yönteminin geliştirilmesi Bu çalışmanın temel amacı, zebra balığı gelişiminin uzun süreler boyunca hızlandırılmış görüntülemesi için düşük maliyetli bir montaj tekniği geliştirmektir. Katmanlı montaj yöntemi kırılgan zebra balığı embriyo vücudunun tam büyümesini sağlamak için geliştirilmiştir, hareketlerini kısıtlarken. 1. tabakanın agarose konsantrasyonu çok yüksekse, embriyolar bozulur ve eğrileşir (Şekil 2). %0.1 ve %0.5 agarose'da yetişen embriyolar kuyrukları,...

Bu makalede, uzun zaman atlamalı konfokal mikroskopi için kırılgan zebra balığı embriyoları monte etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu düşük maliyetli yöntem herhangi bir ters mikroskop görüntüleme için düzenli cam alt mikroskopi yemekleri kullanarak gerçekleştirmek kolaydır. Montaj farklı konsantrasyonlarda agarose katmanları yapılır.

Tüm Zebrabalığı Embriyolarının Uzun Zaman Atlamalı Konfokal Mikroskobu için Katmanlı Montaj Yöntemi

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Kırılgan zebra balığı embriyolarının sınırsız büyümesine olanak tanıyan ve aynı zamanda onları tamamen sabit bir konumda tutan hızlandırılmış görüntüleme için bir montaj yöntemi geliştirdik. Bu montaj yöntemi hızlı, kolay ve ucuzdur ve herhangi bir ters mikroskop üzerinde laboratuvar görüntüleme için çalışır. Bu yöntemi canlı zebra balığı embriyolarının görüntülemesi için geliştirdik, ancak diğer küçük su hayvanı modellerinin görüntülenmesi için değiştirilebilir.Yetişkin zebra balıklarını yetiştirerek başlayın. Öğleden sonra, bir-iki erkek-kadın oranı ile üreme tankları içine balık yerleştirin. Sonra embriyo ortamda% 1 düşük erime agarose bir stok çözüm hazırlamak ve bir mikrodalga fırında ısıtarak eritin.Aliquot 1.5 mililitre tüpler içine agarose çözeltisi. Distile suda %4'lük triain bir stok çözeltisi yapın ve agarose ve tricaine'i dört santigrat derecede saklayın. Tricaine toksik tir ve tartılması ve duman kaputunda hazırlanması gerekir.Çiftlaştıktan sonra, E3'teki zebra balığı embriyolarını petri kabında hasat edin ve montajdan önce yaklaşık 28 saat boyunca 26,5 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Embriyoları %0.02 tricaine ile anestezi altına alayın ve embriyoyu serbest bıra

a-layered-mounting-method-for-extended-time-lapse-confocal-microscopy

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Burada, uzun vadeli görüntüleme, iki foton görüntüleme ve doku hasarı teknikleri ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme zebrafish embriyolar montaj için bir yöntem açıklanmaktadır.

İki foton axotomy ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme canlı zebrafish embriyolar

Bu makalede, uzun süreli görüntüleme için canlı zebra balığı embriyolarını monte etmenin bir yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem uygun maliyetlidir ve Ters Mikroskopta görüntüleme için normal cam tabanlı mikroskopi kapları kullanılarak gerçekleştirilmesi kolaydır. Montaj, farklı konsantrasyonlarda agaroz katmanları halinde gerçekleştirilir.

Katmanlı Agar Montajı: Canlı Zebra Balığı Embriyolarının Ters Mikroskop ile Uzun Süreli Görüntüleme İçin Hazırlanması

Bu videoda, canlı zebra balığı embriyolarının düşük eriyik agaroz kullanılarak 6 oyuklu plakaya monte edilmesine ilişkin adım adım talimatlar açıklanmaktadır. Ayrıca canlı embriyoların görüntülerini elde etme ve yazılım kullanarak analiz etme sürecini de sağlar.

Agar Montajı: Uzun Süreli Görüntüleme için Canlı Zebra Balığı Embriyolarını Monte Etmenin Temel Bir Yöntemi

Çoğalma, desenleme, farklılaşma ve akson rehberlik gibi gelişimsel süreçleri kolaylıkla Zebrafish omurilikte örnek alınabilir. Bu yazıda, bu olayların görselleştirme optimize eden, zebra balığı embriyolarının için bir montaj prosedürü açıklar.

Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

Zebrabalıkları gelişimi embriyo düşük konsantrasyonlu agaroz ile optik bakımdan saydam bir plastik hortumlar gömülür ışık mikroskobu ile levha gün boyunca takip edilebilir.

Çok katmanlı Zebra balığı uzun vadeli Işık Sayfalık Mikroskopi için Montaj

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Burada, normal gelişimi bozmadan canlı zebra balığı embriyolarının arka vücut gelişiminin uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesine izin veren çok yönlü bir montaj yöntemi sunuyoruz.

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Lazer ile uzun dalga boyu çok foton Floresans uyarma mikroskobu tarama gelişmiş optik teknikleri bir arada Tg (sox10:EGFP) ve Tg (foxd3:GFP) Zebra balığı embriyo nöral crest göçün yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu, gerçek zamanlı görüntüleme yakalamak için uygulanmıştır.

Geliştirme gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için çoklu foton zaman atlamalı görüntüleme: nöral Crest hücrelerde geçirme Zebra balığı embriyo görselleştirme

In vivo görüntüleme sinir sistemi gelişiminin altında yatan hücresel mekanizmaları araştırmak için kullanılabilecek güçlü bir araçtır. Burada, gelişmekte olan zebra balığı sinir sistemi içinde çok renkli Brainbow etiketli çok sayıda hücreyi gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için zaman atlamalı konfokal mikroskopiyi kullanma tekniğini açıklıyoruz.

Brainbow ve Time-lapse Konfokal Görüntüleme kullanarak Yaşayan Zebrabalıklarında Gelişen Beyni Görselleştirme

Bu protokol, zebra balığının erken göz gelişiminin toto etiketlemesi ve çok boyutlu görüntülenmesi için bir yaklaşımı açıklar. Lazer tarama konfokal mikroskopisi kullanarak etiketleme, gömme ve dört boyutlu (4D) görüntülemeyi ve optik bardak morfogenezinin diseksiyon mekanizmaları için veri kümelerinin alımını optimize etmek için dikkat edilmesi gereken noktaları açıklıyoruz.

Zebra Balığı Optik Kupası Morfogenezinin 4 Boyutlu Görüntülenmesi

Erken zebra balığı embriyolarının bir ışık tabakası mikroskobu kullanılarak bozulmamış bir koryon içinde görüntülenmesi için bir örnek hazırlama stratejisi açıklanmaktadır. Embriyoların %70 epiboli ve tomurcuk aşamalarında koryon içinde edindiği farklı yönelimleri analiz eder ve ışık tabakası sistemini kullanarak embriyo boyunca hücresel ölçekte çözünürlük elde etmek için görüntüleme stratejilerini detaylandırır.

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Öğrenin, Danio rerio embriyoları için uzun zaman atlamalı konfokal mikroskopi görüntüleme yöntemini. Bu katmanlı montaj tekniği, embriyoların sabit kalmasını sağlarken sınırsız büyümelerine olanak tanır ve diğer küçük sucul modellere uyarlanabilir.

Tüm Zebrabalığı Embriyolarının Uzun Zaman Atlamalı Konfokal Mikroskobu için Katmanlı Montaj Yöntemi

Daha fazla video keşfet