C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti
29 Ekim 2019
Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.
C.elegans embriyogenez yaklaşık 13 saat sürer ve genellikle bir seferde bir embriyo filme tarafından izlenir. Ancak protokolümüz, 80-100 embriyonun eşzamanlı 3Boyutlu zaman atlamalı görüntülemesine olanak sağlıyor. Gelişmekte olan c.elegans embriyolarının çok sayıda için veri toplama yeteneği, gelişimsel olayların ve büyük ölçekli ekranların nicel analizi de dahil olmak üzere yeni bir deney yelpazesini ortaya çıkar.
Bu protokol, farklı gelişimsel süreçleri yakalamak veya ilgi dokularında belirteçlerin herhangi bir kombinasyonunu ifade eden görüntü embriyolarına kolayca uyarlanabilir. Embriyoları kuyuların içine düzgün bir şekilde dağıtmak zordur. Farklı Z düzlemlerinde kümelenmeden alan başına birden fazla embriyonun yakalanmasını sağlamak için birbirine yakın olmalıdırlar.
Yan yana diseksiyon, buz üzerinde iki araştırmacı kullanmanızı ve kullanılmayan kuyuları engellemenizi öneririz. Biz de hızlı bir şekilde iyi hazırlanmış 384-iyi plaka kurmak için bazı yararlı hileler gösterecektir. Kullanılmayan kuyuları maskelemek için PCR yapışkan folyo ile cam dipli 384 kuyulu bir plakayı mühürleyerek başlayın.
Kullanım için kuyuların bir alt kümesini ortaya çıkarmak için folyoyu kesmek için jilet veya neşter kullanın. Her kuyuya 70 mikrolitre taze hazırlanmış TMHC ekleyin ve plakayı buzüzerinde tutun. Kenar efektlerini önlemek için plakanın dış iki satırını hariç tonuyla.
Hızlı numune hazırlama için iki araştırmacı tarafından yan yana diseksiyon önerilir. Çözeltinin tamamı kaplandığında, her koşulda bir depresyon slaytı içinde yaklaşık 10 gravid yetişkini 150 mikrolitre buz gibi TMHC çözeltisine aktarmak için ince cımbız ve diseksiyon mikroskobu kullanın. Cımbız ve neşter kullanarak, embriyoları serbest bırakmak ve bir ağız aspiratör içine çekilen bir kılcal pipet yüklemek için solucanlar incelemek.
İki ila sekiz hücreli evre embriyoların tümünün hazırlanan plakanın ayrı kuyularına aktarılması için ağız pipetini kullanın ve herhangi bir kuyuda agrega bulunmadığını doğrulamak için plakayı inceleyin. Tüm embriyolar toplandığında, santrifüj ile örnekleri yerleştirin ve plakanın alt kısmından herhangi bir kalıntı kaldırmak için bir etanol ıslatılmış mendil kullanın. Plakayı sıcaklık kontrollü bir ortamla donatılmış bir konfokal mikroskobun plaka tutucusuna yerleştirin ve uygun embriyolara sahip alanları belirlemek için her kuyunun ön tayinini yapmak için 10X hedefini kullanın.
Tarayın sonunda, 60X hedefine geçin, her noktada odak düzlemini her kuyuda bir ila dört alana göre ayarlayın ve 10 saat boyunca her 20 dakikada bir iki mikrometre aralıklarla 18 Z-kesit elde edin. Tüm görüntüler elde edildiğinde, embriyonik öldürücülüğü değerlendirmek için gece görüntülemenin başlamasından yaklaşık 20 ila 24 saat sonra, düşük, bütün parlak alan taraması yapın. embriyoCropUI çalıştırılabilir kullanarak otomatik kırpma için, ilk Zenodo ve test dosyaları programı indirin.
zip programın platformda düzgün çalışıp çalışmadığını belirlemek için. Bir kez indirilen, unzip ve embriyoCropUI yürütülebilir dosyabulmak için gidin ve programı başlatmak için çift tıklayın. Kırpmak için ilk özel 4B görüş alanını yüklemek için açık'ı seçin.
Birden fazla boyutlu bir TIFF serisini kırpma yaparken, yalnızca klasör içindeki serideki ilk görüntüyü yükleyin. Tüm görüntüler yüklendiğinde görüntüleme parametrelerini belirtin, arka plan çıkarma ve zayıflatma düzeltmesini seçin ve görüntü toplama sırasını ve piksel başına mikronları ayarlayın. Ardından çalıştır'ı seçin, kırpılmamış klasörle aynı yolda yeni bir alt klasör etiketlenir ve kırpılan sürümler bu konuma kaydedilir.
Görselleştirme için, açık ve birleşik MSV2 ImageJ eklentisi ve grafik kullanıcı arabirimi talimatları Zenodorepov2 indirin. Zenodo docx ve IMageJ eklentisi açın. Üç ve dördüncü satırları bulun ve kırpmadan sonra resim klasörlerinin depolanacak konumu girdi.
İşlenecek koşulların görüntü klasörü adları ve her gecelik deneme için benzersiz alfasayısal tanımlayıcı. Tüm bilgiler girildiğinde çalıştır'ı tıklatın. Kırpılan resim klasörlerini içeren dış klasöre gitmek için bir istem başlatacak bir pencere görüntülenir.
Seçildikten sonra görüntüleme parametrelerinin belirtimine izin verecek başka bir pencere görüntülenir. Tamam'ı tıklatın. Bileşik dosya biraraya başlayacaktır.
Bileşik oluşturulduğunda, açık bırakılan dosyaları gözden geçirin. Birlikte görüntülendiğinde özel muhabir suşları en büyük gelişimsel olaylar için bilgilendirici okumalar sağlar. Sülfat belirtimi dahil, dorsal intercalation, epidermal muhafaza, uzama, ve nörogenez.
Enjeksiyondan 24 saat sonra görüntüleme için en uygun zaman noktasıdır. Bu süre itibariyle maternal protein tükenmesi ve zigotik gen ekspresyonunun inhibisyonu, sülfat belirtimi ve morfogenezde yer alan genlerin geniş bir spektrumu nda farklı, yüksek oranda tekrarlanabilir imza fenotipleri veren etkilidir. Diseksiyon ve embriyo seçimi adımları sırasında sabırlı olmak önemlidir.
Kümelenmeyi en aza indirmek ve uygun odak düzlemlerini seçmek de yüksek kaliteli veri sağlamak için gereklidir. Protokolümüz çeşitli floresan marker suşları ile ve RNAi veya mutantlar ile birlikte yapılabilir. İşleme araçlarımız, kolaylaştırılmış, otomatik leştirilmiş veya manuel veri analizine olanak sağlar.
Burada açıklanan suşları, yöntemleri ve araçları kullanarak grubumuz embriyonik gelişim için gerekli olan yaklaşık 2.000 geni hedefleyen RNAi tabanlı yüksek içerikli bir ekran gerçekleştirdi. Bu proje için yarı-yüksek iş metotları gerekliydi.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, tek bir gecelik çalışmada 80–100 C. elegans embriyosunun embriyogenezinin eşzamanlı 3D zaman-laps görüntülemesine izin veren yarı yüksek verimli bir protokol tanımlar. Çok sayıda gelişmekte olan C. elegans embriyosu için veri toplama yeteneği, gelişimsel olayların kantitatif analizi de dahil olmak üzere yeni bir deney yelpazesi açar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- C. elegans embriyogenezi yaklaşık 13 saat sürer.
- Geleneksel yöntemler, bir seferde bir embriyoyu çekmeyi içerir.
- Eşzamanlı görüntüleme, daha kapsamlı veri toplamayı sağlar.
- Ayrıntılı izleme için özel raportör suşları kullanılabilir.
Çalışmanın Amacı
- C. elegans embriyolarının yüksek verimli görüntülemesine yönelik bir protokol geliştirmek.
- Gelişimsel süreçlerin kantitatif analizini sağlamak.
- Embriyonik gelişimin geniş ölçekli taramasına olanak sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Yarı yüksek verimli 3D zaman-laps görüntüleme protokolü.
- Veri analizi için görüntü işleme ve görselleştirme araçları.
- Belirli gelişimsel belirteçleri izlemek için özel raportör suşları.
- Protokolün çeşitli gelişimsel süreçler için uyarlanması.
Ana Sonuçlar
- 80–100 embriyonun başarılı eşzamanlı görüntülemesinin sağlanması.
- Özel araçlarla veri analizi yoluyla verimlilik sağlanması.
- Embriyogenezi detaylı olarak izleme yeteneğinin artırılması.
- Farklı deneysel ihtiyaçlara uyarlanma potansiyeli.
Sonuçlar
- Protokol, embriyogenez çalışmalarının verimliliğini önemli ölçüde artırır.
- Gelişimsel biyolojideki kantitatif analizler için yeni yollar açar.
- Gelecekteki uygulamalar, çeşitli gelişimsel süreçleri ve belirteç kombinasyonlarını içerebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Semi-high-throughput 3D imaging of C. elegans embryogenesis enables quantitative, multiplexed analysis of developmental phenotypes across multiple genetic or experimental conditions. This capability accelerates early discovery by supporting large-scale, parallelized hypothesis testing and mechanistic de-risking in developmental biology. The approach enhances predictive confidence and portfolio triage for gene function and pathway interrogation in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of gene function during embryonic development.
- Supports mechanistic de-risking by visualizing phenotypic outcomes across diverse genetic perturbations.
- Facilitates high-content screening for target validation and pathway mapping.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiplexed biological systems for downstream screening workflows.
- Standardizes imaging and data processing for reproducible, quantitative outputs.
- Enables scalable, parallel evaluation of gene knockdowns or compound effects.
Translational & Preclinical Research
- Aligns phenotypic readouts with disease-relevant developmental processes when using informative reporter strains.
- Provides continuity from genetic discovery to preclinical model validation.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on robust, quantitative phenotyping.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging and analysis workflow bridges early discovery, screening, and preclinical validation by enabling multiplexed, quantitative phenotyping in a model organism system.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through high-content, parallelized imaging.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for large-scale genetic or compound screens.
- Analytics: Provides automated cropping, orientation, and visualization tools for standardized data analysis.
- Translational Research: Connects developmental phenotypes to disease-relevant biological processes when using appropriate markers.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable imaging and analysis platform adaptable to diverse experimental needs and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in developmental gene function studies.
- Operational Value: Streamlines data acquisition, processing, and visualization for high-throughput experiments.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by supporting robust, scalable phenotypic screening.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets and pathways for further development.
Implementation Considerations
- Requires microscopy infrastructure with point visiting and temperature control capabilities.
- Demands expertise in embryo handling, imaging, and data analysis workflows.
- Benefits from cross-team standardization of imaging parameters and data processing protocols.
- Adaptable to various fluorescent marker strains and genetic backgrounds.
- Dependent on careful sample preparation to avoid embryo clumping and ensure data quality.
