Formalin-sabit Parafin gömülü Hydatidiform Molar Dokuların Mikrouydu DNA Genotipleme ve Akış Sitometri Ploidy Analizleri

Genotipleme protokolümüzün en önemli avantajı, formalin-sabit, parafin gömülü molar dokuları genotipleme de ana sorun olan anne DNA ile kontaminasyonu en aza indirmektir. Akış sitometri büyük ölçüde hydatidiform benlerin tanısını kolaylaştıran hızlı ve ucuz bir yöntemdir. Her formalin-sabit parafin gömülü, veya FFPE, gebe ürünü için, mikroskopi ile morfolojik değerlendirme için bu videoda ayrıntılı olarak dört mikron kalınlığında hematoksin ve eozin leke bölümü hazırlamak.

Kesiti kolaylaştırmak için FFPE bloklarını 15 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Mikrotomu mikroskobik morfolojik değerlendirme için dört mikron kalınlığında kesecek şekilde ayarlayın. Soğuk bloğu mikrotome yerleştirin ve H&E boyama için her bloktan bir kesin.

Forceps kullanarak, 45 santigrat derece su banyosu için her bölümü aktarın. Daha önce bir kalem kullanarak örnek kimlik numarası ile etiketlenmiş pozitif yüklü bir slayt ile su banyosundan bölümü alın. Bölümleri içeren slaytları 65 derece lik bir fırına yerleştirin ve bölümlerin slaytlara yapışmasını bekleyin.

Slaytları 25 dakika fırında bekletin. Slaytları metin protokolünde tablolu olarak doğru zaman dilimi için uygun boyama kavanozlarına batırarak H&E boyama gerçekleştirin. Morfolojik analiz için dört mikronluk bölümleri montaj ortamı ile monte edin.

Ve cam kapak fişleri ile kaplayın. H&E slaytları ve hafif mikroskobu kullanarak, en fazla koryonik villi miktarına sahip FFPE bloğunu seçin. Ve mümkünse, koryonik villi olan blok ayrı ve anne dokuları ile iç içe değil.

MIKROtomu, DNA ekstraksiyonu için 10 mikron kalınlığında ki kesitleri kesecek şekilde ayarlayın. Bloktaki koryonik villi miktarına bağlı olarak 10 ila 30 kesit kesin. Daha önce olduğu gibi slaytlı bölümleri aldıktan sonra, bölümlerin slaytlara yapışmasını sağlamak için bölümleri içeren slaytları 65 derece lik bir fırına yerleştirin.

Slaytları 20 dakika fırında bekletin. Slaytları metin protokolünde tablolu olarak doğru zaman dilimi için uygun boyama kavanozlarına batırarak H&E boyama gerçekleştirin. Zehirli ksilen kokularının dağılabilmesi için slaytları en az üç saat duman kaputunun altına bırakın.

Forceps kullanarak, nemlendirilmiş bir kağıt mendil küçük bir kağıt parçası gözyaşı. Hafif stereo mikroskop altında, H & E lekeleri 10 mikron kalınlığında bölümlerden tüm istenmeyen anne dokuları kazımak için forseps ve su nemlendirilmiş kağıt mendil küçük parçalar kullanın. Bu adımIçin anahtar sabır, özellikle zorlu bloklar için.

Ayrıca başka birinin hiçbir anne dokuları cevapsız olduğundan emin olmak için bir göz atın olması önemlidir. Şimdi, nemlendirilmiş kağıt mendil yeni bir parça yırtmak ve koryonik villi toplamak için kullanabilirsiniz. Kağıt mendil parçalarını, bağlı koryonik villi ile etiketlenmiş 1,5 ml'lik bir tüpe yerleştirin.

Bu adımda kullanılan kağıt mendil miktarını en aza indirin, çünkü DNA çıkarma sütununu çok fazla tıkayabilir ve dolayısıyla toplanan DNA'nın son miktarını azaltabilir. DNA ekstraksiyonu gerçekleştirmek için FFPE kitinden DNA çıkarma protokolünü uygulayın. Laboratuvar spektrofotometresini kullanarak, 1 mikrolitre DNA yükleyin ve ölçüm ölçümü için 216 nm'de absorbans ölçün.

1 mikrolitre DNA'yı %2'lik agarose jele yükleyin ve nitel değerlendirme için 80 ila 100 voltluk bir voltajla jel elektroforezini çalıştırın. DNA değerlendirme sonuçlarına göre, multipleks kısa tandem tekrar PCR amplifikasyon kullanılacak DNA hacmini seçin. En az 1000 nanogram DNA kullanmayı hedefleyin.

Metin protokolünde açıklandığı gibi PCR amplifikasyonuna, kılcal elektroforeze ve veri analizine devam edin. İdeal FFPE bloğunu seçmek için, koryonik villi'den oluşan dokularının yaklaşık %50-70'ine sahip bir FFPE bloğu seçmek için ışık mikroskobundaki H&E slaytlarını kullanın. Koryonik villi ideal miktarda olmayan bloklar için, kesit yapılır gibi koryonik villi için zenginleştirmek.

Bunu yapmak için, yeni kesilmiş bölümlerin hangi tarafında daha koryonik villi içerdiğini ilgili H&E slaytına göre belirleyin. Sonra, koryonik villi için zenginleştirmek için atılması gereken diğer yarısı kesmek için bir bıçak kullanın. Mümkün olan en iyi FFPE bloğunun kesitini gerçekleştirmek için, bir mikrotom kullanarak 50 mikron kalınlığında dört kesin.

İdeal bir FFPE bloğu mevcut olmaması durumunda, koryonik villi oranını yine de anne dokusuna kadar korumayı amaçlamaktadır. Örneğin, bloğun sadece %30'u koryonik villi'den oluşuyorsa, geri kalanı anne dokuları varsa, anne dokularını içeren bölümün en az yarısını çıkarın ve telafi etmek için daha fazla kesit kullanın. Bölümleri etiketli 15 mL tüplere yerleştirin.

Deparafinizasyon ve rehidrasyon için, her reaktifeklemek ve metin protokolünde tablolu olarak uygun bir süre beklemek için bir duman başlık içinde çalışmak. Sonra, bir Pasteur pipet ile vakum emme ile reaktif çıkarın. Ardından, 15 mL tüplere dört santigrat santikül çözeltisi ekleyin.

İki saat boyunca 80 derece su banyosu yerleştirdikten sonra, çözelti oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Vakum emme ile sitrat çözeltisi çıkarın. 1x PBS, girdap altı mililitre ekleyin ve dokuların dibe yerleşmek için izin vermek için 1-2 dakika bekleyin.

Gerekirse, örnekleri 1000 RPM'de 30 saniye santrifüj edin. 1X PBS'yi vakum emme ile çıkarın. Şimdi önceden ısıtılmış pepsin çözeltisi bir mL ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 derece santigrat kuru banyo yerleştirin.

Her 10 dakikada bir girdap. Propidium iyodür ribonükleaz Bu kuluçka son 10 dakika içinde bir çözüm hazırlayın. 1x PBS, girdap başka bir altı mL ekleyin ve dokuların dibe yerleşmek için izin vermek için 1-2 dakika bekleyin.

Yine, vakum emme ile 1x PBS kaldırın. Propidium iyodür ribonükle a çözeltisi 550 mikrolitre ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 derece santigrat kuru banyo örnekleri yerleştirin. Akış sitometresi ile kullanmak için polistiren yuvarlak alt tüplerin üst kısmına 48 mikron filtrasyon örgü beş cm beş cm beş cm parça yerleştirmek için forseps kullanın.

Sıvıyı kafesten ve tüpe boruyla karıştırarak çözeltiyi filtreleyin. Örnekler akış sitometresi üzerinde çalıştırılmaya hazır. Onlar çalıştırılmak için hazır olana kadar folyo sarılmış tutun.

Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi akış sitometrisi ve veri analizi gerçekleştirin. Kısmi hidatidiform köstebeğin mikrouydu genotipleme, hastanın ve eşinin DNA'sı ile birlikte hastanın köstebeğinin triploid dispermik olduğunu ortaya koymaktadır. İlk 1.

İlk zirve anneden kaynaklanır, çünkü sadece anne bu büyüklükte bir tepeye sahiptir. Aynı mantıktaki ikinci zirve, aynı alelleri paylaştığı için babadan kaynaklanır. İkinci tepenin ilkinden çok daha yüksek olduğuna dikkat edin, bu da muhtemelen o tepede aynı baba alelinin iki dozolduğunu gösteriyor.

Maternal kontaminasyon bu gebe üründe çok azdır çünkü ikinci maternal alel pozisyonunda çok küçük bir tepe gösterir. İkinci işaret, gebe kalma ürününde üç tepe gösterir. Bu zirvelerden ikisi babadan, biri de anneden geliyor.

Üçüncü ve dördüncü belirteçler ilk işarete benzer ve babadan gelen iki alel, anneden de bir tane gösterir. Dört belirteç de sürekli olarak babadan, biri anneden kaynaklanan üç alel gösterdiğinden, bu döllenme nin bu ürününün triploid dispermik olduğu sonucuna varılabilir ve kısmi mol tanısını doğrulayabilir. Genotipleme sonuçlarının yorumlanması için, temizleme adımları sırasında alınan notlara göre kontaminasyon seviyesinin farkında olmak önemlidir.

Bazı durumlarda, bu iki yöntemden sonra bir sonuca varamıyoruz. Bu gibi durumlarda, gerçek genotipleri ortaya çıkarmak için FISH gibi diğer yöntemleri kullanırız. Mikrouydu genotipleme doğru molar tanısı için izin verdi ve daha iyi hydatidiform benlerin çeşitli özellikleri ile ilişkili genotipler anlamak için yol açtı.