Name: Microwell Kültürü kullanılarak Testise Özgü Mimariye Sahip Domuz Testis Organoidlerinin Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Öğrenin, mikro kuyu kültür sistemi kullanarak domuz testis organoidleri üretmeyi. Bu yöntem, testis morfojenezi ve ilaç toksisitesi taramaları için güvenilir bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH/NICHD HD091068-01 tarafından Dr. Ina Dobrinski tarafından desteklenmiştir.

NOT: 1 haftalık domuz yavrularından alınan testisler, ticari domuzların hadım edilmesinden elde edilen yan ürün olarak ticari bir domuz çiftliğinden elde edilebildi. Testislerin kaynak Calgary Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı.
1. Doku sindirimi için enzim çözeltilerinin hazırlanması
NOT: İki farklı kollajenaz IV çözeltisi (A, B çözeltisi) ve deoksiribonükle I (DNase I) çözeltisi içeren üç farklı enzimatik çözüm gereklidir.
<ol><li>A çözeltisi hazırlamak için, 20 mg kollajenaz IV S(Malzeme Tablosu)ve 40 mg kollajenaz IV W(Malzeme Tablosu)25 mL yüksek glikozLu Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) olarak çözünür. Daha sonra 0,22 μm filtre ile sterilize filtre. Trypsin aktivitesini inhibe etmek için A solüsyonuna 0,4 mL fetal sığır serumu (FBS) ekleyin.</li>
	<li>B çözeltisini hazırlamak için, DMEM'in 40 mL'sinde 80 mg kollajenaz IV W(Malzeme Tablosu)çözün. Daha sonra 0,22 μm filtre ile sterilize filtre.</li>
	<li>DNase I çözeltisi (7 mg/mL) hazırlamak için, 70 mg DNase I'i 10 mL DMEM'de çözün. Daha sonra 0,22 μm filtre ile sterilize filtre. NOT: Burada özetlenen kollajenaz IV çözeltilerinin enzim konsantrasyonu, orijinal madde14'tebelirtilen konsantrasyonlara (2 mg/mL) göre değişir. Geçerli protokol, biraz daha yüksek canlılığa sahip hücreler verir. Ancak, her iki protokol tarafından izole hücreler aynı doku mimarisi ile organoidler üretirler.</li>
</ol>2. Testis doku enzimatik sindirim
<ol><li>Testisleri steril bir kabın içine toplayın ve %1 penisilin/streptomisin (P/S) içeren fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Yıkadıktan sonra testisleri %1 P/S içeren PBS içeren 100 mm'lik doku kültür kabına aktarın ve otoklavlı makas ve forseps kullanarak tunica vaginalis ve epididimleri çıkarın. İzole testislerini yeni bir 100 mm'lik tabağa aktarın ve %1 P/S içeren PBS ile iyice yıkayın.</li>
	<li>Kısırlığı korumak için, tunica albuginea testis parenkim soymak için steril makas ve forseps başka bir dizi kullanın. Doğrudan tunica altında uzunlamasına eksen boyunca testisler kesin. Daha sonra iki forsep sinerek testisleri tunicadan soyun ve %1 P/S ile 1 mL DMEM içeren 100 mm'lik yeni bir tabağa yerleştirin.</li>
	<li>1-2 mm doku parçaları halinde steril makas ile soyulmuş testisler kıyma. Doğrama sonra, bağ dokusunun beyaz parçaları kaldırmak için steril forceps kullanın.</li>
	<li>Kolajenaz IV S(Malzeme Tablosu)için 0,4 mg/mL konsantrasyon ve kollajenaz IV W (Malzeme Tablosu)için 0,8 mg/mL konsantrasyon elde etmek için kıymalı doku parçalarını A solüsyonuna aktarın ve DMEM ile 50 mL'ye kadar yükseltin. ÇözeltiSi Doku parçalarını içeren 37 °C'lik su banyosuna 30 dakika yerleştirin, tüpleri her 5 dakikada bir hafifçe ters çevirin ve DNA salınımını görsel olarak kontrol edin.<ol>
<li>Serbest yüzen DNA gözlenirse 500 μL DNase I ekleyin. 30 dk sonra tüpü 90 x g'de 25 °C'de 1,5 dk frenle santrifüj edin ve süpernatantatın. NOT: DNA bulutlu bir madde olarak görünür. Tüpler sarsıldığında doku parçaları durulunca DNA su üstünde kalır.</li>
	</ol></li>
	<li>1.2 mg/mL kollajenaz IV W konsantrasyonu elde etmek için tüpe B çözeltisi ekleyin ve DMEM ile 50 mL'ye kadar kontör ekleyin (Malzeme Tablosu). Tüpü 30 dakika boyunca 37 °C su banyosuna yerleştirin ve her 5 dakikada bir tüpü hafifçe ters çevirin. Serbest yüzen DNA gözlemlenirse 500 μL DNase I ekleyin.</li>
	<li>30 dk sonra tüpü 90 x g'de 25 °C'de 1,5 dk santrifüj edin. Bundan sonra supernatant atın ve% 1 P / S ile PBS ile bir kez yıkayın. NOT: Hem A hem de B çözeltisinden atılan süpernatantlar öncelikle interstisyel hücreler içerir.</li>
	<li>50 mL'ye kadar PBS ile tüpü toplayın. Tübülleri üstten dikkatlice toplayın ve yeni bir 50 mL tüpe yerleştirin. NOT: Sindirilmemiş büyük doku parçaları hızla alt yerleşmek, sindirilmiş seminiferous tübüller süspansiyon kalır. Büyük doku parçaları toplanmamalıdır. Bu işlem, orijinal tüpteki çözelti neredeyse net olana ve sadece sindirilmemiş doku parçaları kalana kadar birkaç kez tekrarlanabilir.</li>
	<li>25 °C'de 90 x g'de tübülleri 1,5 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantatın. Taze PBS ve santrifüj tekrar ekleyin. Bu yıkama adımLarını iki kez tekrarlayın.</li>
	<li>Son PBS yıkadıktan sonra, supernatant çıkarın ve PBS 5 mL seminiferous tübüller resuspend. Daha sonra tübüllere %0,25 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 15 mL ekleyin. Tüpü 37 °C su banyosuna yerleştirin ve her 2 dakikada bir hafifçe ters çevirin. Serbest yüzen DNA çok gözlenirse, 5 mL DMEM ile 500 μL DNase I ekleyin.</li>
	<li>Mikroskop altında tek hücrelere tübüllerin enzimatik sindirim ini değerlendirin (önce 5 dk sonra, sonra her 2 dakika). Çoğunlukla tek bir hücre tespit edilebiliyorsa, reaksiyonu 5 mL FBS ile durdurun ve 70 m'lik bir kafesten ve ardından 40 μm'lik bir kafesten filtreleyin. NOT: Sindirim için kullanılan 50 mL tüplerin kapaklarının (A, B ve %0,25 tripsin-EDTA) düzgün bir şekilde sıkılmasına dikkat edilmelidir. Su banyosunda kontaminasyon bir sorun ise, parafin film sterilite sağlamak için kapak etrafında sarılmış olabilir.</li>
	<li>55 °C'de frenli 500 x g'deki tek hücreleri 5 dakika süreyle santrifüj edin, zenginleştirme ortamında (Dulbecco Modifiye Kartal Orta F/12 (DMEM/F12) %5 FBS ve %1 P/S içeren yeniden askıya alın ve canlı hücre sayısını sayın. Bu başlangıç hücre popülasyonu. Fix 100 x 103 hücreleri ve germ hücre belirteci UCHL1 için immünositokimya gerçekleştirmek (Ubiquitin C-Terminal Hydrolase L1) olarak açıklanan12 ve bu başlangıç hücre popülasyonundaki germ hücrelerinin yüzdesini belirlemek. NOT: Germ hücre belirteci Promielositik lösemi çinko parmak proteini (PLZF)15 de UCHL1 için uygun bir alternatif olarak kullanılabilir. Başlangıç hücre popülasyonunda beklenen hücre verimi 700-800 x 109/g civarındadır. Bu hücre popülasyonundaki mikrop hücrelerinin yüzdesi %4-5 olmalıdır.</li>
	<li>Bu başlangıç hücre popülasyonunun yaklaşık 20 x 106'sını iki ultra düşük ek 100 mm Petri kapasine (10 x 106 hücre dmem/F12'nin 10 mL'sinde her bir kapta %1 P/S içeren) doku kültürü kuluçka makinesinde 2 gün boyunca (37 °C) yerleştirin , 5% CO2,21% oksijen). Kalan hücrelerle germ hücre zenginleştirme gerçekleştirin. NOT: Optimum canlılık ve hücre kalitesini sağlamak için germ hücre zenginleştirme ve müteakip nicelik gerçekleşirken, başlangıç hücre popülasyonu 2 gün boyunca ultra düşük ek doku kültürü yemeklerinde kültüre yerleştirilir.</li>
</ol>3. Germ hücre zenginleştirme
NOT: Yukarıda açıklanan işlem öncelikle Sertoli hücreleri ve mikrop hücrelerini verir. Farklı yapışma özellikleri, Sertoli hücrelerinin ve mikrop hücrelerinin diferansiyel kaplama ile ayrılmasını sağlar.
<ol><li>Tohum 20-25 x 1010 10 10 00 mm doku kültürü çanak başına başlangıç hücre nüfusunun 6 hücre zenginleştirme orta toplam hacmi (DMEM/ F12 ile% 5 FBS ve% 1 P / S) diferansiyel kaplama için. Hücreleri bir kuvöze yerleştirin (37 °C, %5 CO2,%21 O2) ve 1,5 saat sonra Sertoli hücrelerinin çoğunun tabağa bağlanmasını sağlayın.</li>
	<li>2 plakadan oluşan süpernatant'ı (çoğunlukla mikrop hücreleri içeren) bir 100 mm'lik yeni bir plakayla toplayın ve birleştirin ve kuvöze geri yerleştirin. 1 saat sonra, 2 plakanın supernatantını yeni bir 100 mm plakayla birleştirin. Plakaları bir gece için kuvöze geri yerleştirin. NOT: Supernatants kombine öncelikle mikrop hücreleri içerecektir. Plakalar ile birlikte atılır yapışmış hücreler sertoli ve peritubüler miyoid hücreler gibi öncelikle testis somatik hücrelerdir.</li>
	<li>Aşağıdaki gibi iki kesirler halinde zenginleştirilmiş mikrop hücreleri toplamak. NOT: Zenginleştirilmiş mikrop hücreleri farklı, yapışmaz fraksiyonve hafif yapışmış fraksiyona yapışır. Bu fraksiyonların her ikisi de zenginleştirilmiş germ hücre popülasyonu oluşturur.<ol>
<li>Non adherent fraksiyonu: supernatant toplamak.</li>
		<li>Hafif yapışma fraksiyonu: PBS ile yavaşça plakaları yıkayın, oda sıcaklığında 5 dakika için % 0,25 tripsin-EDTA% 0,25 seyreltme 2 mL ile tedavi, zenginleştirme orta 2 mL ile reaksiyonu durdurmak ve yapışmaz fraksiyonu olarak aynı tüp içinde toplamak. NOT: 0.25% Trypsin-EDTA 1:20 trypsin çözeltisi üretmek için PBS ile seyreltilmiş olması gerekir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre sayacı nı kullanan toplam hücre sayısını sayın, 100 x 103 hücreyi sabitleyin ve12'de açıklandığı gibi germ hücre belirteci UCHL1 için immünositokimya yapın ve bu zenginleştirilmiş hücre popülasyonundaki germ hücrelerinin yüzdesini belirleyin. NOT: Bu hücre popülasyonundaki mikrop hücrelerinin yüzdesi en az %60-70 olmalıdır. Sayısallaştırma için immünositokimya 1 gün gerektirdiğinden, zenginleştirilmiş hücreler optimum hücre kalitesi ve canlılığını sağlamak için süre boyunca %1 P/S ile takviye edilmiş DMEM/F12 ile ultra düşük bir eki 100 mm Petri kabına yerleştirilmelidir.</li>
</ol>4. Tohumlama için hücrelerin hazırlanması
<ol><li>Başlangıç hücresi preparatını hasat etmek için, süpernatantı ultra düşük eki 100 mm'lik tabaklardan 50 mL'lik bir tüpte toplayın. Yapışan hücreleri toplamak için plakaları PBS ile şiddetle yıkayın. Enzimatik sindirime gerek yoktur. NOT: Bazı testis hücreleri, öncelikle Sertoli hücreleri, biraz ultra düşük eki plakaları yapışabilir.</li>
	<li>Başlangıç hücre preparatını ve zenginleştirilmiş mikrop hücrelerini birleştirerek %25'lik mikrop hücrelerini içeren çalışan bir hücre preparatını elde edin. 500 x g'de frenli 500 x g 5 dk, süpernatant atın ve organoid oluşum ortamındaki hücreleri yeniden askıya alın (DMEM/F12 insülin 10 μg/mL, transferrin 5.5 μg/mL, selenyum 6.7 ng/mL, 20 ng/mL epidermal büyüme faktörü , %1 P/S). Hücre yoğunluğunu mL başına 2,4 x 106 olarak ayarlayın. NOT: Buprotokolde kullanılan mikrokuyu plakalarda her kuyu1.200 mikrokuyu içeriyordu.</li>
	<li>Aşağıda açıklandığı gibi başına düşen hücre sayısını hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın. Kuyu başına düşen hücre sayısı = her organoid için kümelenecek mikrokuyu sayısı x hücre sayısı.</li>
	<li>Her biri 1,000 hücreden organoid ler üretmek için her biri 1.200 x 1.000 hücreye sahip tohumlar=) 1.2 x 106 hücre. Hücre süspansiyonundaki hücre yoğunluğunu, hücrelerin 0,5 mL orta hacimde tohumlanmış bir şekilde ayarlayın. Her biri 1.000 hücreden oluşan organoidler için mL başına 2,4 x 106 hücre (0,5 mL'de 1,2 x 106 hücre) yoğunluğu kullanılır.</li>
</ol>5. Hücre almak için mikrokuyuların hazırlanması
NOT: Hücrelerin mikrokuyu yüzeyine yapışmadığından emin olmak için, üretici tarafından satın alınabilecek bir yüzey aktif durulama çözeltisi ile tedavi edin.
<ol><li>Her kuyuya 0,5 mL durulama çözeltisi ekleyin. Hiçbir hava kabarcıkları kuyuda sıkışıp olduğundan emin olun. Hava kabarcıklarını temizlemek için, varsa, 25 °C'de 2 5 dakika frenlerle plakayı 2.000 x g'de santrifüj edin.</li>
	<li>Kabarcıkların mikrokuyulardan çıkarıldığını doğrulamak için, düşük büyütmeli ters mikroskop altında plakayı gözlemleyin. Eğer sıkışmış kabarcıklar gözlenirse, kalan kabarcıkları çıkarmak için 25 °C'de 25 °C'de frenlerle 2000 x g'de tekrar santrifüj edin.</li>
	<li>Kapağı kapağı ile kapak ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka. Tedavi tamamlandıktan sonra durulama çözeltisini çıkarın ve hemen tabağı steril su veya PBS ile yıkayın. Durulama çözeltisi ile tedaviden sonra plakanın kurumaması için.</li>
</ol>6. Testis organoidlerinin üretimi
<ol><li>Her kuyuya 0,5 mL organoid oluşum ortamı (herhangi bir hücre olmadan) ekleyin ve 2.000 x g'de 25 °C'de frenlerle 2 dk.'lık bir hava baloncuklarını temizleyin. Hava kabarcıklarının kaldırıldığını doğrulamak için düşük büyütmeli ters mikroskop altında kuyuyu gözlemleyin. Eğer sıkışmış kabarcıklar gözlenirse, kalan kabarcıkları çıkarmak için 25 °C'de 25 °C'de frenlerle 2000 x g'de tekrar santrifüj edin.</li>
	<li>Çalışma hücresi süspansiyonunun 0,5 mL'sini ekleyin ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak hafifçe karıştırın. 55 °C'de 500 x g'de 5 dakika frenli santrifüj.</li>
	<li>Plakayı 5 gün boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine ve kültüre aktarın. Her gün ortamın yarısını değiştirin.<ol>
<li>Herhangi bir organoid kaybetmeden orta değiştirmek için, menisküs dokunmak ve yavaş yavaş orta çizmek için yavaşça kuyu nun duvarına pipet ucu dokunun ve düşük. Aşağı düşerken menisküs takip emin olun. Taze ortam eklemek için, boru ucunu kuyunun aynı tarafındaki duvara orta çekme ile aynı tarafta takın ve kuyu duvarına hafifçe taze orta ekleyin ve yavaşça duvardan aşağı akmasını bekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Organoidleri kurtarmak için, geniş bir ağız pipeti kullanarak orta yı hafifçe yukarı ve aşağı pipet. Bu, organoidlerin mikrokuyulardan çıkmasını sağlar.</li>
	<li>Organoidleri toplamak, PBS ile yıkamak, germ hücre belirteci (UCH-L1), Sertoli hücre belirteci (GATA Bağlayıcı Protein 4-GATA4), peritübüler miyoid hücre belirteci (α-Smooth Muscle Actin-αSMA) ve Leydig hücre belirteci (Sitokrom) için immünositokimyayı düzeltmek ve gerçekleştirmek P450-CYP450) açıklandığı gibi12 ve bir konfokal mikroskop altında görselleştirmek.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Quadrato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+diversity+and+network+dynamics+in+photosensitive+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids.</a> Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).</li>
<li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture%3A+biology%27s+new+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).</li>
<li>Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+testicular+organoid%3A+a+novel+tool+for+the+study+of+human+spermatogenesis+and+gonadotoxicity+in+vitrodagger%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger.</a> Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).</li>
<li>Strange, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+testicular+organoid+system+as+a+novel+tool+to+study+Zika+virus+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis.</a> Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 82-82 (2018).</li>
<li>Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testicular+organoid+generation+by+a+novel+in+vitro+three-layer+gradient+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system.</a> Biomaterials. 130, 76-89 (2017).</li>
<li>Baert, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Human+Testicular+Cells+Self-Organize+into+Organoids+with+Testicular+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).</li>
<li>Sakib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+organotypic+testicular+organoids+in+microwell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture.</a> Biology of Reproduction. , (2019).</li>
<li>Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Large+Numbers+of+Size-controlled+Tumor+Spheroids+Using+Microwell+Plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), 50665(2013).</li>
<li>Sakib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+organotypic+testicular+organoids+in+microwell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture.</a> Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).</li>
<li>González, R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+Mouse+Monopoly%3A+Studying+the+Male+Germ+Line+in+Domestic+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models.</a> ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).</li>
<li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+germline+stem+cell+niche+unit+in+mammalian+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The germline stem cell niche unit in mammalian testes.</a> Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).</li>
<li>Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Gdnf+Gene+in+peritubular+myoid+cells+disrupts+undifferentiated+spermatogonial+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).</li>
</ol>

Dr. Ungrin'in bir mucit olarak AggreWell teknolojisine finansal bir ilgisi var.

Biz in vivo12testis benzer doku mimarisi ile testis organoidlerin çok sayıda tutarlı, tekrarlanabilir nesil sağlayan basit bir yöntem kurduk. Yaklaşım domuz testis hücreleri kullanılarak geliştirilmiş olsa da, daha geniş fare, insan olmayan primat ve insan testis12için de geçerlidir. Testis organoidleri 8 ,9,10,11 üretmek için farklı yöntemlerbildirilmi...

Son yıllarda, üç boyutlu (3D) organoidler ilgi bir canlanma olmuştur. Bağırsak gibi farklı organlar1, mide2, pankreas3,4, karaciğer5, ve beyin6 başarıyla 3D organoid sistemlere türetilmiştir. Bu organoidler in vivo organlara mimari ve fonksiyonel benzerlikler var ve daha biyolojik olarak monolayer kültürsistemleri7 daha doku mikroçevre çalışması için ilgilidir. Sonuç olarak, testis organoidler de ilgi toplamaya başlamıştır8,9,10,11,12. Şimdiye kadar bildirilen yöntemlerin çoğunluğu karmaşık, non-yüksek iş10 ve ECM proteinleri8,10eklenmesini gerektirir. Bu karmaşıklık aynı zamanda tekrarlanabilirlik ile ilgili sorunlara yol açar. Testis in vivo gibi hücre çağrışımları olan testis organoidlerinin oluşumuna olanak tanıyan basit ve tekrarlanabilir bir yöntem gereklidir.
Biz son zamanlarda bu gereksinimleri12adresine bir sistem bildirdiniz. Domuzu model olarak kullanarak microwell sisteminde santrifüj zorunlu toplama yaklaşımını kullandık. Microwell sisteminde, her kuyu aynı küçük microwells13çok sayıda içerir. Bu üniforma boyutu çok sayıda küresel nesil sağlar. Microwell sistemi, testislere özgü bir mimariye sahip çok sayıda tek tip organoidin üretilebini sağladı. Sistem basittir ve ECM proteinlerinin eklenmesini gerektirmez.

<table><tbody><tr><td>100 mm ultra düşük ataşmanlı doku kültürü kabı</td><td>Corning</td><td>#CLS3262</td><td></td></tr><tr><td>100 mm doku kültürü kabı</td><td>Corning</td><td>#353803</td><td></td></tr><tr><td>Aggrwell 400</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>#34411</td><td></td></tr><tr><td>Yapışma Önleyici Durulama Solüsyonu</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>#07010</td><td></td></tr><tr><td>Clostridium histolyticium'dan kollajenaz tip IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C5138</td><td>Kollajenaz IV S</td></tr><tr><td>olarak adlandırılır Kollajenaz tip IV</td><td>Worthington Worthington-Biochem</td><td>#LS004189</td> sığır pankreasından <td>Kollajenaz IV W</td></tr><tr><td>Deoksiribonükleaz I</td> olarak adlandırılır <td>Sigma-Aldrich</td><td>#DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta/F12</td><td>Gibco</td><td>#11330-032</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Kartal' s Orta - yüksek glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D6429</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Salamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D8537</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Büyüme Faktörü R</td><td>& D Sistemleri</td> <td># 236-EG</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Hücre Süzgeçleri 70 & m</td><td>FisherScientific</td> <td># 352350</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Hücre Süzgeçleri 40 & m</td><td>FisherScientific</td> <td># 352340</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>ThermoFisher Scientific</td> <td># 12483-020</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin-Transferrin-Selenyum</td><td>Gibco</td> <td># 41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P4333</td><td></td></tr><tr><td>Domuz testis dokusu</td><td>Sunterra Farms Ltd (Alberta, Kanada)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Steriflip-GP Steril Santrifüj Tüp Üst Filtre Ünitesi</td><td>Millipore</td><td>#SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>#T4049</td><td></td></tr></tbody></table>

microwell kültürü kullanılarak testis'e Özgü mimariye sahip domuz testis organoidlerinin Üretimi

Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture

Organoidler, doku mimarisini ve organların işlevlerini in vivo olarak özetleyebilen birden fazla hücre tipinden oluşan üç boyutlu yapılardır. Organoidlerin oluşumu temel ve çevirisel araştırmaların farklı yollarını açmıştır. Son yıllarda, testis organoidler erkek üreme biyolojisi alanında ilgi topladı. Testis organoidleri hücre-hücre etkileşimleri, doku gelişimi ve germ hücre niş mikroortamda çalışma için izin ve yüksek iş yapımı ilaç ve toksisite tarama kolaylaştırmak. Testis spesifik doku mimarisine sahip testis organoidlerinin güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde üretilmesi için bir yöntem gereklidir. Microwell kültür sistemi piramit şeklinde mikrowelller yoğun bir dizi içerir. Ergenlik öncesi testislerden elde edilen testis hücreleri bu mikrowelllere santrifüj edilir ve testis-spesifik doku mimarisi ve hücre çağrışımları ile testis organı oluşturmak için kültürlenir. Bu süreç le binlerce homojen organoid üretilebilir. Burada bildirilen protokol, erkek üremesi üzerinde araştırma yapmak ta bir araştırmacının ilgisini çekebilir.

Mikrowelllerde kendi kendine organize edilen 1 haftalık domuz testlerinden izole hücreler(Şekil 1A, Şekil 2), belirgin dış (seminifer epitel) ve iç bölmeler ( interstitium) (Şekil 1B, Şekil 2). İki bölme kollajen IV+ve bazmembran ile ayrılmıştır. UCH-L1+ve mikrop hücreleri ve GATA4+ve Sertoli hücreleri bo...

Burada, ticari olarak mevcut mikrokuyu kültür sistemini kullanarak testis spesifik doku mimarisi ile domuz testis organoidlerinin tekrarlanabilir üretimi için bir protokol sıyoruz.

Microwell Kültürü kullanılarak Testis'e Özgü Mimariye Sahip Domuz Testis Organoidlerinin Üretimi

Organoids are three dimensional structures composed of multiple cell types that are capable of recapitulating tissue architecture and functions of organs ...

Bu protokol, testis morfogenezinin incelenmesi nde ve yüksek tropo ilaç ve toksisite taramalarında kullanılabilen testis organoidlerinin nesline izin verdiği için önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı, son derece tekrarlanabilir olması, nispeten düşük sayıda hücre gerektirmesi ve testis-spesifik mimariye sahip çok sayıda testis organoidi oluşturmak için kullanılabilmesidir. Bu yöntem pluripotent kök hücreler veya gerekli optimizasyonlar ile pankreas adacık hücreleri gibi diğer sistemleri, çalışma için uygulanabilir.Testis dokusu enzimatik sindirim prosedürünü gösteren Anna Voigt, benim laboratuvarımdan doktora öğrencisi olacak. Steril bir kabın içine testis toplamak ve% 1 penisilin streptomisin içeren PBS ile yıkayın. Yıkadıktan sonra testis% 1 penisilin streptomisin içeren PBS ile 100 milimetrelik doku kültür çanak aktarır.Tunica vaginalis ve epididim kaldırmak için otoklav makas ve forseps kullanın. İzole testisi yeni bir 100 milimetrelik tabağa aktarın ve %1 penisilin streptomisin içeren PBS ile iyice yıkayın. Doğrudan tunica altında uzunlamasına eksen boyunca testis kesin.Daha sonra iki forseps kullanarak tunica testis soyma ve 1% penisilin streptomisin ile DMEM 1 mililitre içeren yeni bir 100 milimetre lik çanak içine yerleştirin. Bir ila iki milimetrelik doku parçaları halinde steril makas ile soyulmuş testis kıyma. Doğrama sonra bağ dokusunun beyaz parçaları kaldırmak için steril forceps kullanın.50 mililitrelik bir tüpiçinde a çözeltisine kıyma doku parçalarını aktarın ve colagenaz 4S için mililitre başına 0,4 miligram ve colagenase 4W için mililitre başına 0,8 miligram konsantrasyon elde etmek için DMEM ile 50 mililitreye kadar yerleştirin. Doku parçalarını içeren tüpü 30 dakika boyunca 37 derece su banyosuna yerleştirin. Tüpü her beş dakikada bir yavaşça ters çevirin.30 dakika sonra tüpü 90 kez G'de santrifüj edin ve 25 santigrat derecede 1,5 dakika ara verin. Supernatant atın, ad 40 çözelti B mililitre, ve colagenase 4W mililitre başına 1,2 miligram konsantrasyon elde etmek için DMEM ile 50 mililitre kadar top. Tüpü 30 dakika boyunca 37 derece lik bir su banyosuna yerleştirin ve tüpü her beş dakikada bir hafifçe ters çevirin.Tüpü 90 kez G'de 25 santigrat derecede 1,5 dakika ara verin. Bundan sonra supernatant atın ve% 1 penisilin streptomisin ile PBS ile bir kez yıkayın. Dikkatle üst ve yerden yeni bir 50 mililitretüp içine tübülleri toplamak.50 mililitreye kadar PBS ile tüpü toplayın. 1,5 dakika boyunca 25 santigrat derece molaları ile 90 kez G boruları santrifüj. Supernatant atın ve iki ek kez yıkamak için taze PBS ekleyin.Son PBS yıkama dan sonra supernatant kaldırmak ve pbs beş mililitre seminiferous tübülleri yeniden askıya. Daha sonra, tübüllere %0,25 Tripsin EDTA 15 mililitre ekleyin. Tüpü 37 derece lik bir su banyosuna yerleştirin ve her iki dakikada bir hafifçe ters çevirin.Beş dakika sonra bir doku kültürü plaka üzerinde örnek 10 mikrolitre ile mikroskop altında tek hücrelere tübüllerin enzimatik sindirim değerlendirmek. Her iki dakikada bir gözlemlemek için örneği mikroskop altına yerleştirin. Çoğunlukla tek hücreler tespit edilebilirse, reaksiyonu beş mililitre FBS ile durdurun ve 70 mikronluk bir kafesten ve ardından 40 mikronluk bir ağdan filtreleyin.Tek hücreleri 500 kez G'de santrifüj edin ve 25 santigrat derecede beş dakika ara verin. 50 mililitre zenginleştirme ortamında yeniden askıya alın ve hemositometre kullanarak canlı hücre sayısını sayın. Bu başlangıç hücre nüfusunun 20 milyonunun iki ultra düşük eki 100 milimetre Petri kabının her birine aktarılması ve iki gün boyunca %5'i karbondioksit ve %21 oksijen le 37 santigrat derecelik bir doku kültürü kuluçka makinesine inkübatın.Cede 20-25 milyon hücre kalan başlangıç hücre nüfusunun 100 milimetre doku kültürü çanak başına zenginleştirme orta toplam hacmi. Bir kuvöz içine çanak yerleştirin ve 1,5 saat sonra Sertoli hücrelerinin çoğunluğu plaka bağlı olduğundan emin olun. Süpernatants'ı toplamak ve birleştirmek için iki plakayı hafifçe yatırın ve 100 milimetrelik yeni bir plakaya yerleştirin ve kuvöze geri yerleştirin.Bir saat sonra, yine yeni bir 100 milimetreplaka için iki plaka supernatants birleştirir. Tabakları bir gecede kuvöze geri yerleştirin. Sonra iki fraksiyonu, non-yapışık fraksiyonu ve biraz yapışık fraksiyonu zenginleştirilmiş mikrop hücreleri toplamak.Non-adherent fraksiyonu olarak supernatant toplamak. Hafif yapışkan fraksiyonu için pbs ile yavaşça plakaları yıkayın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 0,25% Trypsin EDTA 0,25% seyreltme bir iki mililitre ile tedavi. Zenginleştirme orta iki mililitre ekleyerek reaksiyonu durdurun ve non-adherent fraksiyonu tüp toplamak.Başlangıç hücre preparatını ve zenginleştirilmiş mikrop hücrelerini bir tüpte birleştirerek %25'lik mikrop hücresi içeren bir çalışma hücresi preparatını elde edin. 500 kez G'de santrifüj ve 25 santigrat derecede beş dakika mola verin. Supernatant atın ve mililitre başına 2.4 milyon hücre konsantrasyonuna ulaşmak için organoid oluşumu orta 20 mililitre hücreleri yeniden askıya.Yeni bir tüp hücre içeren çözeltinin bir mililitre ekleyin. Mikro kuyu plakasındaki her kuyuya 0,5 mililitre yüzey aktif madde durulama çözeltisi ekleyin. Hiçbir hava kabarcıkları kuyuda sıkışıp olduğundan emin olun.Hava kabarcıklarını çıkarmak için plakayı 2,000 kez G'de santrifüj edin ve 25 santigrat derecede iki dakika ara verin. Kabarcıkların mikro kuyulardan çıkarıldığını doğrulamak için düşük büyütmeli ters mikroskop altında plakayı gözlemleyin. Tabağı kapaklı olarak kapatın ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.Tedavi tamamlandıktan sonra durulama çözeltisini çıkarın ve hemen tabağı steril su veya PBS ile yıkayın. Her kuyuya 0,5 mililitre organoid formasyon ortası ekleyin ve 2,000 kez G'de 25 santigrat derecede iki dakika mola lar ile kapana kısılmış hava kabarcıklarını temizleyin. Hava kabarcıkları kaldırılmış olduğunu doğrulamak için düşük büyütme ters mikroskop altında kuyu gözlemleyin.Çalışma hücresi süspansiyon0,5 mililitre ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme tarafından karıştırın. 500 kez G'de santrifüj ve 25 santigrat derecede beş dakika mola verin. Hücrelerin mikro kuyularda kümelendiğini doğrulamak için ters bir mikroskop kullanın.Plakayı beş gün boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine ve kültüre aktarın. Her gün ortamın yarısını değiştirin. Organoidler kurtarmak için yavaşça orta yukarı ve aşağı pipet için geniş ağızlı pipet kullanın.Bu organoidler mikro kuyular çıkmak için izin verir. Organoidleri toplayın, germ hücre belirteci, Sertoli hücre belirteci, peritübüler miyoid hücre belirteci ve Leydig hücre belirteci için immün omünokimyayı düzeltin ve gerçekleştirin ve konfokal mikroskop altında görselleştirin. Bu çalışmada, mikro kuyularda kendi kendine düzenlenmiş ve farklı dış ve iç bölmeleri ile küresel olarak organize edilen bir haftalık domuz testislerinden izole edilmiş hücreler.İki bölme kollajen IV pozitif bazal membran ile ayrılmıştır. GATA4 pozitif Sertoli hücreleri ve UCHL1 pozitif mikrop hücreleri bodrum zarının dış bölmesinde ydi. aSMA pozitif peri-tübüler miyoid hücreler bodrum zarının iç boyunca lokalize edildi cyp450 pozitif Leydig hücreleri interstitium merkezinde idi.Bu yapı, Leydig hücrelerinin, peri-tübüler miyoid hücrelerinin interstisyumda, interstisyel bölmede ve mikrop hücrelerinde yer aldığı Situ koşullarına benzer, Sertoli hücreleri seminiferous epitelde bulunur. Organoid ler üretmek için kullanılan hücrelerin optimum kaliteye sahip olmasını sağlamak önemlidir. Enzimatik sindirimin tripsinizasyon aşamasında dikkatli olunmalıdır.Bu prosedürü takiben organoidler germ-hücre farklılaşmasını incelemek veya gen ekspresyonu ve salgılanan protein ler veya hormonlar için analiz etmek için uzun vadeli kültürlenebilir. Testis-spesifik hücre çağrışımları ile organoidler oluşturma yeteneği testis gelişimi ve germ hücre fonksiyonu için önemli hücre-hücre etkileşimleri çalışma için yeni bir in-vitro sistem sağlar.

generation-porcine-testicular-organoids-with-testis-specific

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Biz prostat tümörü diseksiyon odaklanmak, fare prostat kanseri modellerinin otopsi ve diseksiyon için bir yöntem göstermektedir. Fare prostat tümörü organoidlerin oluşturulması için adım adım bir protokol de sunulmaktadır.

Prostat kanseri genetiği Işlenmiş fare modelleri tümör Organoids üretimi

Meme bezi, dış miyoepitelyal ve iç luminal epitel hücrelerinden oluşan çift katmanlı bir yapıdır. Sunulan diferansiyel trippsinizasyon kullanarak organoidler hazırlamak için bir protokoldür. Bu verimli yöntem araştırmacılar ayrı ayrı meme bezi formu ve fonksiyonu rollerini ile ilgili soruları keşfetmek için bu iki hücre türleri işlemek için izin verir.

Diferansiyel Tripsinizasyon a göre Mozaik Meme Organoidlerinin Üretimi

Burada primer neonatal murine testis hücrelerinden testis organoidi üretmek için dört yöntem tanımlanmıştır. Bu teknikler birden fazla araştırma uygulamasına sahiptir ve özellikle testis gelişimi ve fizyolojisi in vitro eğitimi için yararlıdır.

Ekstra Hücresel Matris Tabanlı ve Ekstra Hücresel Matrissiz Murine Testiküler Organoidlerin Üretimi

Bu yazıda, organoidlerin yüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak kültürlenebildiği ve gözlemlenebildiğimm2 başına yüzlerce mikro konteynere sahip yeni bir kültür substratı türü için bir üretim protokolü sunulmaktadır. Hücre tohumlama ve immün boyama protokolleri de detaylandırılmıştır.

Organoidlerin kültürü ve 3D görüntülenmesi için yüksek verimli bir platform

Burada, kriyokorunmuş epitel kriptlerinden domuz bağırsak 3D organoidlerini kültürlemek için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, epitel hücrelerinin apikal tarafına erişime izin veren 3D organoidlerden türetilen hücre monokatmanları oluşturmak için bir yöntem de açıklıyoruz.

Kriyokorunmuş Epitel Kriptlerinden Domuz Yavrusu Bağırsak 3D Organoidlerinin Kültürü ve Hücre Tek Katmanlarının Oluşturulması

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerini kullanarak vasküler organoidler oluşturmak için bir yöntem sunar.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Vasküler Organoid Üretimi

Bu çalışma, ince ve kalın bağırsaklardan türetilen 2D tek katmanlı domuz organoidleri oluşturmak için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Bu tek tabakaların büyümesi, sağlam epitel bütünlüğünü gösteren artan TEER değerleri ile işaretlenir. Ek olarak, bu tek tabakalar, forskolin uygulamasını takiben Ussing odası deneylerinde fizyolojik salgı tepkileri sergiler.

Doğal Bağırsağın Fizyolojik Özelliklerini Yansıtan İki Boyutlu Domuz Bağırsak Organoidleri

Bu çalışma, agaroz kalıplarında mikro kuyular oluşturmak için damga tabanlı bir sistem kullanarak 3D hücre yapıları oluşturmak için uygun maliyetli ve verimli bir metodoloji sunmaktadır. Sistem, tek tip sferoidlerin/organoidlerin oluşumunu teşvik eder, böylece hücre etkileşimlerini iyileştirir. Bu yaklaşım deneysel değişkenliği azaltır ve ilaç testi ve doku mühendisliğindeki uygulamaları destekler.

Yeni Bir Damga Cihazı Kullanılarak İki Boyutlu Hücre Kültürlerinden Üç Boyutlu Sferoidlerin/Organoidlerin Üretilmesi

Fare yumurtalık somatik hücrelerinin stroma ile zenginleştirilmiş bir yumurtalık fraksiyonundan izole edilmesi ve iskelesiz bir yaklaşımla fare yumurtalık somatik organoidleri üretme yöntemlerini açıklıyoruz.

Yumurtalık Mikro Ortamını İnceltmek: Fare Yumurtalık Somatik Hücrelerinin İzolasyon, 2D Kültür ve Organoid Kültürü Yöntemleri

İnsan pluripotent kök hücreler (hPSCs) farklı hastalıkların sayısız tedavi potansiyeline sahiptir. Bu hücrelerin yardımcı vücutta herhangi bir hücre tipinde farklılaşabilmektedir olduğu yatmaktadır. Burada hPSCs arasında pluripotence göstermek için kullanılan deney teratomlar, açıklanmaktadır.

Testis Kapsül içinde teratom Üretimi

Öğrenin, mikro kuyu kültür sistemi kullanarak domuz testis organoidleri üretmeyi. Bu yöntem, testis morfojenezi ve ilaç toksisitesi taramaları için güvenilir bir platform sunar.

Microwell Kültürü kullanılarak Testis'e Özgü Mimariye Sahip Domuz Testis Organoidlerinin Üretimi

Daha fazla video keşfet