Name: Endojen IRF5 Dimerizasyon Yerli Poliakrilamid Jel Elektroforez İmmünblot Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Öğrenin, yerli poliakrilamid jel elektroforez immünblot analizi ile CAL-1 hücrelerinde endojen IRF5 dimerizasyonunu nasıl değerlendireceğinizi. Bu protokol, bağışıklık yanıtlarında IRF5 biyolojisini incelemek için güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışma Croucher Vakfı ve City Üniversitesi başlangıç fonları fon tarafından desteklendi. Chow laboratuvarının tüm üyelerine deney ve makalenin eleştirel okuması ile ilgili yardımları için teşekkür ederiz.

NOT: Burada açıklanan protokol, TLR7/8 için bir agonist olan resiquimod (R848) ile tedavi edilen CAL-1 pDC hücre hattını kullanır. Bu protokol RAW 264.7 (murine makrofaj hattı), THP-1 (insan monositik hücre hattı), BJAB (insan B hücre hattı), Ramos (insan B hücre hattı) ve MUTZ-3 (insan dendritik hücre hattı)23dahil olmak üzere diğer insan ve murine hücre tipleri, uygulanmıştır.
1. CAL-1 Hücrelerinin Uyarılması
<ol><li>%5 fetal sığır serumu (FBS), 25 mM HEPES ve 1x mercaptoetanol (yani tam RPMI 1640 orta) içeren 20−25 mL RPMI 1640 orta ile steril koşullarda 37 °C ve %5 CO2'de Bir T75 şişesinde CAL-1 hücre kültürlerini koruyun.</li>
	<li>Hücreleri 50 mL konik bir tüpe aktarın. NOT: CAL-1 hücreleri yapışık değildir. Yapışık hücre tipleri için, standart tripsinizasyon hücreleri hasat yapılabilir.</li>
	<li>Hücreleri 200 x g'de 5 dk oda sıcaklığında (RT) santrifüj edin. Homojen tek hücreli süspansiyon elde etmek için tam RPMI 1640 ortamının 8 mL'sinde süpernatantı çıkarın ve hücre peletini yeniden askıya alın.</li>
	<li>Hemositometre kullanarak hücreleri say. Her kuyuda 4 mL önceden ısıtılmış komple RPMI 1640 orta ile 6 kuyu plakası iyi başına 1 x 106 hücre yoğunluğunda hücreleri tohumlayın. 37 °C'de 20−24 saat ve %5 CO2'de inkübün le biraraya gelmesi %90−95'e (yaklaşık 1,5 x 106 hücreye karşılık gelen) ulaşabilirsiniz.</li>
	<li>6 kuyu plakasının (1 μg/mL nihai konsantrasyonu) her biri için 4 μL 1 mg/mL R848 ekleyerek hücreleri uyarın. Ayrıca R848 tedavisi olmadan hücreler ile iyi bir uyarılmamış kontrol kurmak.</li>
	<li>R848'in plakayı yan yana hafifçe sallayarak eşit şekilde dağıldığından emin olun. Daha sonra, 37 °C ve% 5 CO2kuvözde 2−16 saat için hücreleri kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>2. Hücresel Proteinlerin Çıkarılması
<ol><li>Hücre süspansiyonlarını 6 kuyu plakasından 5 mL santrifüj tüpe aktarın.</li>
	<li>Sentrifüj 200 x g için 5 dk RT. Süpernatant çıkarın ve homojen tek hücreli süspansiyon elde etmek için fosfat tamponlu salin (PBS) 1 mL hücre pelet yeniden askıya.</li>
	<li>Hücre süspansiyonuna 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>4 °C'de 0,5−1 dk için 12.000 x g'de kısa bir süre aşağı doğru döndürün ve süpernatantı dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>6,25 mL 1 M Tris-HCl pH 7,4 (25 mM nihai konsantrasyonu), 5 M NaCl 7,5 mL (150 mM nihai konsantrasyon), 0,5 mL 0,5 mL 0,5 MED (1 mM nihai konsantrasyon), 2,5 mL NP-40 (son konsantrasyon% 1) içeren lysis tamponunu hazırlayın ve 7.5 mL gliserol (%5 nihai konsantrasyon) deiyonize su (ddH2O) 250 mL içinde. Kullanmadan hemen önce lysis tamponuna 1x'lik son konsantrasyona 100x proteaz inhibitörü tek kullanımlık kokteyl ekleyin. Hazırlanan lysis tamponu buz üzerinde saklayın. NOT: Proteaz olmadan lysis tampon 4 °C'de saklanabilir.</li>
	<li>Hücre peletini 30 μL buz gibi lisis tamponunda yeniden askıya alın ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak karıştırın.</li>
	<li>15−20 dk boyunca buz üzerinde kuluçka.</li>
	<li>4 °C'de 15−20 dk için 12.000 x g'de santrifüj ile lysate'yi netleştirin. Supernatant'ı yeni bir önceden soğutulmuş 1,5 mL santrifüj tüpe aktarın. Özleri her zaman buzda saklayın. NOT: Hücre lisatları -20 °C veya -80 °C'de saklanabilir. Örnekleri kaynatmayın.</li>
	<li>Bradford reaktifini kullanarak protein konsantrasyonu ölçün.</li>
</ol>3. IRF5 Dimerization Analizi Yerli SAYFA
<ol><li>Üst (-) ve alt (+) oda elektroforez tamponlarını hazırlayın. Üst oda tampon 1x yerli PAGE çalışan tampon% 0.3 sodyum deoksikolat (NaDOC) oluşur ve alt oda tampon çalışan sadece 1x yerli PAGE oluşur. NOT: Her yeni çalışma için taze bir üst oda tampon hazırlayın.</li>
	<li>Kuyuları bozmadan %3−%12 yerli PAGE jelini suyla iyice durulayın. Jeli mini jel tankına ayarlayın ve tarak çıkarın. Jeli 4 °C'lik soğuk bir odada veya 150 V'de 30 dk boyunca buz üzerinde pişirin. NOT: Prerunning jel çalışmasını engelleyebilir aşırı amoni ve persülfat iyonları kaldırır.</li>
	<li>Prerun sırasında, 4x yerli örnek tampon ile buz üzerinde tutulan hücresel proteinlerkarıştırarak yükleme için örnekleri hazırlamak.</li>
	<li>Prerun'dan sonra, numune başına son hacmi 10−15 μL olan 10−15 μg protein yükleyin. NOT: Proteinin aşırı yüklenmesi bulaşmaya neden olabilir.</li>
	<li>30 dk için 85 V jel çalıştırın, sonra 2 saat için 150 V. NOT: Farklı laboratuvarlar tarafından kullanılan ekipman ve hücre hatlarındaki farklılıklar göz önünde bulundurularak, bu protokolü optimize etmek için protein numunelerinin konsantrasyonu, voltaj ve çalışma süresinde küçük değişiklikler yapılabilir. Çalışma süresini artırırken ön çalıştırma ve çalışma gerilimini düşürmek dimer çözünürlüğünü ve sonuç tutarlılığını artırmaya yardımcı olabilir.</li>
	<li>Jeli RT'de 30 dakika boyunca SDS çalışan tampon (25 m Tris pH 8.3, 250 mM Glisin, %0.1 SDS) ile ıslatın. NOT: Ajitasyon gerekmez. Bazen, bandın yoğunluğu esas olarak IRF5 monomerik formunu etkileyen deoksikolat (DOC) varlığında verimsiz transferi nedeniyle yüklenen protein miktarı ile orantılı olmayabilir. Aktarımdan önce sds çalışan tampon jel ıslatma bu sorunu çözer. Jel kırılgan. Jelin alt kısmından (yani, daha yüksek yüzde) aşırı özenle işlayın.</li>
</ol>4. IRF5 İmmünoblot Analizi
<ol><li>Yaklaşık 5 dakika boyunca metanol içinde ıslatarak poliviniliden diflorür (PDVF) membran etkinleştirin.</li>
	<li>Yönünü belirtmek için membranın bir köşesinde bir kesim yapın. Transfer sandviçini, içinde hava kabarcıklarının sıkışmadığından emin olmak için üretici protokolünde belirtilen sıralı sıraya göre ekstra özenle monte edin.</li>
	<li>Transfer kasetini tanka yerleştirin ve 20 V'de 1 saat buzüzerinde aktarın. NOT: Sallanan bir çalkalama ile sonraki adımlarda tüm kuluçka ve yıkıntıgerçekleştirin.</li>
	<li>Aktarım tamamlandıktan sonra membranı plastik pratisyen lerle kasetten çıkarın. RT'de 45 dakika boyunca membranı bloke eden tampon (TBS) bloğunu kapatın. NOT: %5 BSA içeren TBS arabelleği engelleme tamponu olarak da kullanılabilir.</li>
	<li>Membranı Tablo 1'delistelenen primer antikorile inkübe edin. Membranı 1x TBST yıkama tamponu (20 mM Tris, pH 7.0, 150 mM NaCl ve %0.1 Ara 20) ile 3 dakika boyunca yıkayın. Yıkama 2x tekrarlayın.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Dillüasyon</td>
			<td>Dillüasyon arabelleği</td>
			<td>Kuluçka</td>
			<td>Yorum</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer antikor (Anti-IRF5)</td>
			<td>1/1,000</td>
			<td>TBS engelleme arabelleği</td>
			<td>Rt'de 4 °C veya 2 saat gece</td>
			<td>Seyreltilmiş antikorlar % 0.02 sodyum azit varlığında 4 °C'de depolanırsa birkaç kez tekrar kullanılabilir.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sekonder antikor (Anti-tavşan)</td>
			<td>1/10,000</td>
			<td>TBS engelleme arabelleği</td>
			<td>RT'de 45 dk</td>
			<td>Seyreltilmiş antikorlar % 0.02 sodyum azit varlığında 4 °C'de depolanırsa birkaç kez tekrar kullanılabilir.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="5">
NOT: Üreticiler arasında değiştiği için seyreltmenin optimize edilmesi gerekir.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: İmmünoblotlama işleminde kullanılan antikorların özellikleri.
<ol start="6"><li>Membranı Tablo 1'delistelenen ikincil antikorla kuluçkaya yatırın. Membranları 1x TBST yıkama tamponunda 3 dk yıkayın. Yıkama 2x tekrarlayın.</li>
	<li>Uygun bir jel dokümantasyon sistemi kullanarak lekeyi tazyik.</li>
</ol>

<ol><li>Takaoka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integral+role+of+IRF-5+in+the+gene+induction+programme+activated+by+Toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors.</a> Nature. 434 (7030), 243-249 (2005).</li>
<li>Ren, J., Chen, X., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKKbeta+is+an+IRF5+kinase+that+instigates+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">IKKbeta is an IRF5 kinase that instigates inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17438-17443 (2014).</li>
<li>Negishi, H., Taniguchi, T., Yanai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interferon+%28IFN%29+Class+of+Cytokines+and+the+IFN+Regulatory+Factor+%28IRF%29+Transcription+Factor+Family%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">The Interferon (IFN) Class of Cytokines and the IFN Regulatory Factor (IRF) Transcription Factor Family.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 10 (11), (2018).</li>
<li>Clark, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+Promoters+of+IRF5+Respond+Distinctly+to+Stimuli+and+are+Affected+by+Autoimmune-Risk+Polymorphisms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Four Promoters of IRF5 Respond Distinctly to Stimuli and are Affected by Autoimmune-Risk Polymorphisms.</a> Frontiers in Immunology. 4, 360(2013).</li>
<li>Bo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+arthritis+patient+antibodies+highly+recognize+IL-2+in+the+immune+response+pathway+involving+IRF5+and+EBV+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid arthritis patient antibodies highly recognize IL-2 in the immune response pathway involving IRF5 and EBV antigens.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1789(2018).</li>
<li>Duffau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+Inflammatory+Arthritis+by+Interferon+Regulatory+Factor+5+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatolpgy%22%5BJournal%5D)">Promotion of Inflammatory Arthritis by Interferon Regulatory Factor 5 in a Mouse Model.</a> Arthritis and Rheumatolpgy. 67 (12), 3146-3157 (2015).</li>
<li>Feng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irf5-deficient+mice+are+protected+from+pristane-induced+lupus+via+increased+Th2+cytokines+and+altered+IgG+class+switching%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Irf5-deficient mice are protected from pristane-induced lupus via increased Th2 cytokines and altered IgG class switching.</a> European Journal of Immunology. 42 (6), 1477-1487 (2012).</li>
<li>Richez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN+regulatory+factor+5+is+required+for+disease+development+in+the+FcgammaRIIB-%2F-Yaa+and+FcgammaRIIB-%2F-+mouse+models+of+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IFN regulatory factor 5 is required for disease development in the FcgammaRIIB-/-Yaa and FcgammaRIIB-/- mouse models of systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of Immunology. 184 (2), 796-806 (2010).</li>
<li>Tada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+5+is+critical+for+the+development+of+lupus+in+MRL%2Flpr+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 5 is critical for the development of lupus in MRL/lpr mice.</a> Arthritis and Rheumatology. 63 (3), 738-748 (2011).</li>
<li>Weiss, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF5+controls+both+acute+and+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">IRF5 controls both acute and chronic inflammation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 11001-11006 (2015).</li>
<li>Schoenemeyer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interferon+regulatory+factor%2C+IRF5%2C+is+a+central+mediator+of+toll-like+receptor+7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The interferon regulatory factor, IRF5, is a central mediator of toll-like receptor 7 signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (17), 17005-17012 (2005).</li>
<li>Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regulation+of+MyD88-activated+interferon+regulatory+factor+5+by+K63-linked+polyubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional regulation of MyD88-activated interferon regulatory factor 5 by K63-linked polyubiquitination.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (24), 7296-7308 (2008).</li>
<li>Lopez-Pelaez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+IKK%CE%B2-catalyzed+phosphorylation+of+IRF5+at+Ser462+induces+its+dimerization+and+nuclear+translocation+in+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Protein kinase IKKβ-catalyzed phosphorylation of IRF5 at Ser462 induces its dimerization and nuclear translocation in myeloid cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17432-17437 (2014).</li>
<li>McGettrick, A. F., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localisation+and+trafficking+of+Toll-like+receptors%3A+an+important+mode+of+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+Immunology%22%5BJournal%5D)">Localisation and trafficking of Toll-like receptors: an important mode of regulation.</a> Current Opinion Immunology. 22 (1), 20-27 (2010).</li>
<li>Baccala, R., Hoebe, K., Kono, D. H., Beutler, B., Theofilopoulos, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-dependent+and+TLR-independent+pathways+of+type+I+interferon+induction+in+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">TLR-dependent and TLR-independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity.</a> Nature Medicine. 13 (5), 543-551 (2007).</li>
<li>Gilliet, M., Cao, W., Liu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells%3A+sensing+nucleic+acids+in+viral+infection+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (8), 594-606 (2008).</li>
<li>Kawai, T., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+Receptors+and+Their+Crosstalk+with+Other+Innate+Receptors+in+Infection+and+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Toll-like Receptors and Their Crosstalk with Other Innate Receptors in Infection and Immunity.</a> Immunity. 34 (5), 637-650 (2011).</li>
<li>Liu, Z., Davidson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taming+lupus-a+new+understanding+of+pathogenesis+is+leading+to+clinical+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Taming lupus-a new understanding of pathogenesis is leading to clinical advances.</a> Nature Medicine. 18 (6), 871-882 (2012).</li>
<li>del Fresno, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-beta+production+via+Dectin-1-Syk-IRF5+signaling+in+dendritic+cells+is+crucial+for+immunity+to+C.+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Interferon-beta production via Dectin-1-Syk-IRF5 signaling in dendritic cells is crucial for immunity to C. albicans.</a> Immunity. 38 (6), 1176-1186 (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+Levels+of+Interferon+Regulatory+Factor+5+%28IRF5%29+and+Related+Inflammatory+Cytokines+Associated+with+Severity%2C+Prognosis%2C+and+Causative+Pathogen+in+Patients+with+Community-Acquired+Pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Science+Monitor%22%5BJournal%5D)">Expression Levels of Interferon Regulatory Factor 5 (IRF5) and Related Inflammatory Cytokines Associated with Severity, Prognosis, and Causative Pathogen in Patients with Community-Acquired Pneumonia.</a> Medical Science Monitor. 24, 3620-3630 (2018).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+recognition+by+GEF-H1+controls+IKKepsilon+mediated+activation+of+IRF5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microbial recognition by GEF-H1 controls IKKepsilon mediated activation of IRF5.</a> Nature Communications. 10 (1), 1349(2019).</li>
<li>Almuttaqi, H., Udalova, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+targeting+IRF5%2C+a+key+regulator+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in targeting IRF5, a key regulator of inflammation.</a> FEBS Journal. 286 (9), 1624-1637 (2019).</li>
<li>Chow, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+and+Overlapping+Immune+Programs+Regulated+by+IRF3+and+IRF5+in+Plasmacytoid+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential and Overlapping Immune Programs Regulated by IRF3 and IRF5 in Plasmacytoid Dendritic Cells.</a> The Journal of Immunology. 201 (10), 3036-3050 (2018).</li>
<li>Cheng, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Activation+of+IFN+Regulatory+Factor+%28IRF%29-3+and+IRF-5+Transcription+Factors+during+Viral+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential Activation of IFN Regulatory Factor (IRF)-3 and IRF-5 Transcription Factors during Viral Infection.</a> The Journal of Immunology. 176 (12), 7462-7470 (2006).</li>
<li>Chang Foreman, H. C., Van Scoy, S., Cheng, T. F., Reich, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+interferon+regulatory+factor+5+by+site+specific+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Activation of interferon regulatory factor 5 by site specific phosphorylation.</a> PLoS One. 7 (3), 33098(2012).</li>
<li>Lin, R., Yang, L., Arguello, M., Penafuerte, C., Hiscott, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRM1-dependent+nuclear+export+pathway+is+involved+in+the+regulation+of+IRF-5+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A CRM1-dependent nuclear export pathway is involved in the regulation of IRF-5 subcellular localization.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (4), 3088-3095 (2005).</li>
<li>Stone, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+5+activation+in+monocytes+of+systemic+lupus+erythematosus+patients+is+triggered+by+circulating+autoantigens+independent+of+type+I+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 5 activation in monocytes of systemic lupus erythematosus patients is triggered by circulating autoantigens independent of type I interferons.</a> Arthritis and Rheumatology. 64 (3), 788-798 (2012).</li>
<li>De, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+Cell-Intrinsic+Role+for+IRF5+in+TLR9%2FBCR-Induced+Human+B+Cell+Activation%2C+Proliferation%2C+and+Plasmablast+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">B Cell-Intrinsic Role for IRF5 in TLR9/BCR-Induced Human B Cell Activation, Proliferation, and Plasmablast Differentiation.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1938(2017).</li>
<li>Fabie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF-5+Promotes+Cell+Death+in+CD4+T+Cells+during+Chronic+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">IRF-5 Promotes Cell Death in CD4 T Cells during Chronic Infection.</a> Cell Reports. 24 (5), 1163-1175 (2018).</li>
<li>Cushing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRAK4+kinase+activity+controls+Toll-like+receptor-induced+inflammation+through+the+transcription+factor+IRF5+in+primary+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">IRAK4 kinase activity controls Toll-like receptor-induced inflammation through the transcription factor IRF5 in primary human monocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (45), 18689-18698 (2017).</li>
<li>Li, C., Arakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+protein+analysis%3A+Bovine+serum+albumin+as+a+model+protein%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Application of native polyacrylamide gel electrophoresis for protein analysis: Bovine serum albumin as a model protein.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 125, 566-571 (2019).</li>
<li>Iwamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+IRF-3%2F-7+kinase+and+NF-kappaB+in+response+to+double-stranded+RNA+and+virus+infection%3A+common+and+unique+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Induction of IRF-3/-7 kinase and NF-kappaB in response to double-stranded RNA and virus infection: common and unique pathways.</a> Genes to Cells. 6 (4), 375-388 (2001).</li>
<li>Subhadarshanee, B., Mohanty, A., Jagdev, M. K., Vasudevan, D., Behera, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+charge+dependent+separation+of+modified+and+hybrid+ferritin+in+native+PAGE%3A+Impact+of+lysine+104%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Surface charge dependent separation of modified and hybrid ferritin in native PAGE: Impact of lysine 104.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1865 (10), 1267-1273 (2017).</li>
<li>Reynolds, J. A., Tanford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Dodecyl+Sulfate+to+Proteins+at+High+Binding+Ratios+-+Possible+Implications+for+State+of+Proteins+in+Biological+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios - Possible Implications for State of Proteins in Biological Membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 66 (3), 1002(1970).</li>
<li>Manning, M., Colon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+protein+kinetic+stability%3A+resistance+to+sodium+dodecyl+sulfate+suggests+a+central+role+for+rigidity+and+a+bias+toward+beta-sheet+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure.</a> Biochemistry. 43 (35), 11248-11254 (2004).</li>
<li>Balkhi, M. Y., Fitzgerald, K. A., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKKalpha+negatively+regulates+IRF-5+function+in+a+MyD88-TRAF6+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">IKKalpha negatively regulates IRF-5 function in a MyD88-TRAF6 pathway.</a> Cellular Signalling. 22 (1), 117-127 (2010).</li>
<li>Paun, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+murine+interferon+regulatory+factor+5+%28IRF-5%29+and+its+role+in+the+innate+antiviral+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of murine interferon regulatory factor 5 (IRF-5) and its role in the innate antiviral response.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (21), 14295-14308 (2008).</li>
<li>Yasuda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+dendritic+cell+type+I+IFN+production+induced+by+human+IgG-RNA+immune+complexes+is+IFN+regulatory+factor+%28IRF%295+and+IRF7+dependent+and+is+required+for+IL-6+production%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Murine dendritic cell type I IFN production induced by human IgG-RNA immune complexes is IFN regulatory factor (IRF)5 and IRF7 dependent and is required for IL-6 production.</a> The Journal of Immunology. 178 (11), 6876-6885 (2007).</li>
<li>Steinhagen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF-5+and+NF-kappaB+p50+co-regulate+IFN-beta+and+IL-6+expression+in+TLR9-stimulated+human+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IRF-5 and NF-kappaB p50 co-regulate IFN-beta and IL-6 expression in TLR9-stimulated human plasmacytoid dendritic cells.</a> European Journal of Immunology. 43 (7), 1896-1906 (2013).</li>
<li>Gratz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+production+induced+by+Streptococcus+pyogenes-derived+nucleic+acids+is+required+for+host+protection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Type I interferon production induced by Streptococcus pyogenes-derived nucleic acids is required for host protection.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1001345(2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada açıklanan protokol, endojen IRF5'in hem monomerik hem de dimerik formlarını birbirinden ayıran değiştirilmiş bir yerel SAYFAdır. Özel görüntüleme akış sitometri tekniği23,27,28,30kullanarak endojen IRF5 aktivasyonu tespiti raporlama birkaç çalışma olmuştur. Bu protokol, aktivasyonun ilk olayları sırasında endojen IRF5 etkinleştirme durumunu değerlendirmek için yaygın bir teknik ve olağan...

İnterferon düzenleyici faktör 5 (IRF5) bağışıklık yanıtının düzenlenmesinde önemli bir rol oynayan önemli bir transkripsiyon düzenleyicisidir, özellikle pro-inflamatuar sitokinlerin ve tip I interferansların (IFNs) 1,2 ,3. IRF5'in yanlış regülasyonu, sistemik lupus eritematozus, multipl skleroz, romatoid artrit,vb.ile ilişkili IRF5 lokusundaki çeşitli polimorfizmler ile belirgin olarak, çok sayıda otoimmün hastalıkta katkıda bulunan birfaktördür. 5,6,7,8,9,10. Bu nedenle, endojen IRF5 aktivasyon durumu için sağlam bir algılama analizi fizyolojik olarak ilgili hücresel bağlamda IRF5 düzenleyici yolları ve downstream etkilerini anlamak için çok önemlidir.
IRF5, monositler, dendritik hücreler (DC), B hücreleri ve makrofajlar 1,11ile ifade edilir. Diğer IRF aile transkripsiyon faktörlerinde olduğu gibi, IRF5 gizli durumunda sitoplazmada bulunur. Aktivasyon üzerine, IRF5 fosforile edilir ve homodimerler oluşturur, bu da daha sonra çekirdeğe dönüşür ve tip I IFN'leri ve pro-inflamatuar sitokinleri kodlayan genlerin belirli düzenleyici unsurlarına bağlanır ve sonunda bu genlerin ekspresyonunu indükler1 ,2,11,12,13. IRF5 çeşitli Toll benzeri reseptörlerin (TLR), TLR 7, TLR 8 ve TLR 9, endozos lokalize ve sinyal 1 için MyD88 kullanın gibi doğuştan gelen bağışıklık yanıtları düzenler1 ,11,14. Bu TLR öncelikle tek iplikçikli RNA (ssRNA) ve bir enfeksiyon15, 16,17,18semptomatik olan metillenmemiş CpG DNA gibi yabancı nükleik asit türlerini tanımak . IRF5 bakteriyel karşı bağışıklık yanıtlarını düzenleyen gösterilmiştir, viral, ve mantar enfeksiyonları19,20,21. Bağışıklık sisteminde IRF5 etkili ve çeşitli rolü göz önüne alındığında, artırılması veya IRF5 aktivitesi nemlendirici terapötik ajanların gelişimi için yeni bir cadde olarak hizmet verebilir22. Bu nedenle, farklı hücre tiplerinde IRF5 aktivitesini düzenleyen yolların ve mekanizmaların ayrıntılı araştırılmasına olanak sağlamak için endojen IRF5'in aktivasyon durumunu izlemek için bir protokol geliştirmek önemlidir.
Bilgimiz dahilinde, bu protokolün geliştirilmesinden önce endojen IRF5 aktivasyonu için biyokimyasal veya jel elektroforetik test yayınlanmamıştır. Fosforilasyon IRF5 aktivasyonunun önemli bir ilk adımı olarak gösterilmiştir ve IRF5 aktivitesi için önemli olan serin kalıntısının keşfi ve onayına yol açan fosfospesifik IRF5 antikor geliştirilmiştir13. Ancak, antikor immünoppresipitated veya overexpressed23fosforilize IRF5 açıkça algılarken, elimizde bütün bir hücre lysate IRF5 fosforilasyon tespit etmek için başarısız (veri gösterilmez). Dimerization IRF5 aktivasyonunun bir sonraki adımıdır ve bu adımı araştıran bugüne kadar yapılan birçok önemli çalışma, genellikle normalde IRF511,12 ifade etmeyen alakasız hücre tiplerinde, epitop etiketli IRF5'in aşırı ekspresyonuna dayanıyordu. ,24,25. Önceki çalışmalar, dimerized IRF5 her zaman çekirdek içine translocate olmayabilir ve bu nedenle mutlaka tam olarak aktif olmadığını göstermiştir25,26. Endojen IRF5 nükleer lokalizasyonu için bir tizin görüntüleme akışı sitometri27ile IRF5 aktivasyonunu değerlendirmek için geliştirilmiştir. Bu test, özellikle primer veya nadir hücre tiplerinde28,29 ve bu alandaki bilgiyi büyük ölçüde ilerleten IRF5 aktivitesini anlamak için çok önemli olan çalışmalarda uygulanmıştır. Ancak, bu test araştırmacılar için yaygın olarak mevcut olmayan özel bir alete dayanır. Ayrıca, IRF5 düzenleyici yollarını incelerken ve yukarı akım düzenleyicileri ve yol bileşenlerini tanımlarken aktivasyonun ilk adımlarını araştırmak genellikle gereklidir. Bu çalışma, IRF5'in moleküler biyoloji araçları ile donatılmış laboratuvarlarda yapAbilen erken aktivasyon olayları için sağlam ve güvenilir bir biyokimyasal tahlil sağlamaktadır. Burada açıklanan protokol, özellikle IRF5 nükleer lokalizasyonun görüntüleme akışı sitometrik analizi gibi ortogonal tahlillerle birleştirildiğinde, IRF5 eylemlerinin yollarını ve mekanizmalarını araştırmada çok yararlı olacaktır23, 27,28,30.
Yerli poliakrilamid jel elektroforez (yerli PAGE) protein kompleksleri analiz etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir31,32. Sodyum dodecylsülfat poliakrilamid jel elektroforezinin (SDS-PAGE) aksine, yerli PAGE proteinleri şekil, boyut ve yük bazında ayırır. Ayrıca denatürasyon olmadan doğal protein yapısını korur31,33,34,35. Sunulan protokol, yerel PAGE'in bu özelliklerinden yararlanır ve IRF5'in hem monomerik hem de dimerik formlarını algılar. Endojen fosforlu IRF5'i algılayabilen uygun bir ticari antikor bulunmadığından, bu yöntem erken aktivasyon olaylarını saptayabında özellikle önemlidir. Daha önce, yayınlanan çeşitli çalışmalari IRF5 dimerization değerlendirmek için yerli PAGE kullanılır. Ancak, bu çalışmaların çoğunluğu aktivasyon durumu2,13,24,36,37 analiz etmek için ekzojen epitop etiketli IRF5 aşırı ekspresyonu bağlı . Bu çalışma, iRF5 aktivitesinin işlevi için çok önemli olduğu gösterilmiştir bir insan plazmasittoid dendritik hücre (pDC) hattında değiştirilmiş bir yerli PAGE tekniği ile endojen IRF5 dimerization analiz etmek için adım adım protokol sunar1, 38,39,40. Aynı teknik diğer hücrehatları23uygulanmıştır.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Yaşam Teknolojileri, HK</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>300 W/250 V güç kaynağı 230 V AC</td><td>Yaşam Teknolojileri, HK</td><td>PS0301</td><td></td></tr><tr><td>Anti-IRF5 antikoru</td><td>Bethyl Laboratuvarları, ABD</td><td>A303-385</td><td></td></tr><tr><td>BIOSAN Rocker Shaker (soğuk oda kasası)</td><td>EcoLife, HK</td><td>MR-12</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Tamponu, pH 8, 0,5 M 4x 100 mL</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td>15575020</tr><tr><td>Gliserol 500 mL</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15514011</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Yaşam Teknolojileri, HK</td><td>15527013</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Fare IgG DyLight 800 Konjuge Antikor</td><td>LAB-A-PORTER / Rockland, HK</td><td>610-145-002-0.5</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG DyLight 800 Konjuge Antikor</td><td>LAB-A-PORTER / Rockland, HK</td><td>611-145-002-0.5</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitör kokteylini durdurun (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific, HK</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies, HK</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey Engelleme Tamponu (TBS)</td> <td>Gen Şirketi, HK</td><td>927-50000</td><td></td></tr><tr><td>Mini Tank leke modülü kombinasyonu; Transfer modülü, aksesuarlar</td><td>Yaşam Teknolojileri, HK</td><td>NW2000</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE %3-12 jeller, 10 kuyulu kit</td><td>Yaşam Teknolojileri, HK</td><td>BN1001BOX</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Çalışan Tampon 20x</td><td>Yaşam Teknolojileri, HK</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Numune Tamponu 4x</td><td>Yaşam Teknolojileri, HK</td><td>BN2003</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Alternatifi, Nonilfenil Polietilen Glikol</td><td>Kalay Askı/ Calbiochem, HK</td> <td># 492016-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PBS 7.4</td><td>Yaşam Teknolojileri, HK</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Poliviniliden diflorür (PVDF) membran</td><td>Biyo-gen / Merck Millipore, HK</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>Protein tahlil kiti II (BSA)</td> <td>Bio-Rad, HK</td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>R848</td><td>Invivogen, HK</td><td>tlrl-r848</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Yaşam Teknolojileri, HK</td><td></td><td></td>61870127</tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>ThermoFisher</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat & ge; %97 (titrasyon)</td><td>Kalay Askı/Sigma, HK</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Life Teknolojileri, HK</td><td>15504020</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Kalay Asma/Sigma, HK</td><td>#P9416-100ML</td><td></td></tr></tbody></table>

endojen irf5 dimerizasyon yerli poliakrilamid jel elektroforez İmmünblot analizi

Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis Immunoblot Analysis of Endogenous IRF5 Dimerization

İnterferon düzenleyici faktör 5 (IRF5) bağışıklık yanıtını düzenleyen önemli bir transkripsiyon faktörüdür. Toll benzeri reseptör miyeloid diferansiyasyon primer yanıt geni 88 (TLR-MyD88) sinyal yolu aşağı aktive edilir. IRF5 aktivasyonu fosforilasyon içerir, dimerizasyon, ve çekirdek içine sitoplazma sonraki translokasyon, hangi sırayla çeşitli pro-inflamatuar sitokinlerin gen ekspresyonuna neden olur. IRF5 aktivasyonu için bir algılama tayini IRF5 fonksiyonları ve ilgili yolları incelemek için gereklidir. Bu makalede, CAL-1 insan plazmasitoid dendritik hücre (pDC) hattında endojen IRF5 aktivasyonunu saptamak için sağlam bir teşp açıklanmaktadır. Protokol, IRF5'i monomer ve dimer formlarında ayırt edebilen modifiye nondenaturing elektroforez testinden oluşur ve böylece IRF5 aktivasyonunu analiz etmek için uygun maliyetli ve hassas bir yaklaşım sağlar.

Anti-IRF5 antikorlu immünoblot (IB) CAL-1 hücrelerinde uyarılmamış veya 1 μg/mL R848 ile uyarılmamış olarak 2 saat(Şekil 1)uygulandı. Hücre lisatları hazırlandı ve ana SAYFA yapıldı. Uyarılmamış CAL-1 hücrelerinde, IRF5 yerel SAYFADA monomerik formuna karşılık gelen tek bir bant olarak algılandı. CAL-1 hücrelerinin R848 ile 2 saat tedavi edilmesi üzerine, IRF5 monomer seviyesi, IRF5'in dimerik formuna karşılık gelen yavaş göç eden bir bandın birikiminde eşzamanlı bir artışla azaldı.
<p c...

CAL-1 plazmasitoid dendritik hücre hattında endojen interferon düzenleyici faktör 5 dimerizasyon analizi için bir yerli Batı leke yöntemi tanımlanmıştır. Bu protokol diğer hücre satırlarına da uygulanabilir.

Endojen IRF5 Dimerizasyon Yerli Poliakrilamid Jel Elektroforez İmmünblot Analizi

Interferon regulatory factor 5 (IRF5) is a key transcription factor for regulating the immune response. It is activated downstream of the Toll-like ...

Bu protokol, stimülasyonun erken olayları sırasında endojen IRF5 aktivasyonunu değerlendirmek için ticari olarak elde edilebilen reaktifler ve araçlarla birlikte yaygın olarak kullanılan bir teknik kullanır. Kolayca diğer hücresel bağlamda IRF5 biyoloji sondalama için uygulanabilir. Yerel SAYFA yaygın olarak kullanılan bir teknik olsa da, net, sağlam, yorumlanabilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek teknik olarak zor olabilir.Ticari çalışan bir arabellek ve jel sistemi kullanarak değişkenliği en aza indirmek için yardımcı olur. Detaylara dikkat etmek esastır ve deneyim, iyi sonuçlar elde etmede başarının anahtarıdır. Bu değiştirilmiş yerel SAYFA protokolü, başarının anahtarı olan ince ayrıntılarla birlikte birçok adım içerir.Görsel gösteri araştırmacılar için yararlı olacağını bu ayrıntıları gösterebilir. 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit, tam RPMI 1640 orta ile bir T75 şişesinde CAL-1 hücre kültürünü koruyun. Hücreleri uyarmaya hazır olduğunuzda, 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 200 x g'de beş dakika santrifüj edin.Supernatant çıkarın ve homojen tek hücreli süspansiyon elde etmek için orta pelet yeniden askıya. Daha sonra hücreleri hemositometre ile hesaplayın ve her kuyuda dört mililitre önceden ısıtılmış ortama sahip altı kuyulu bir tabakta her 1,000, 000 hücrelik bir yoğunlukta tohumlayın. Hücreleri 20 ila 24 saat boyunca kuluçkaya yatırın ve birleşimin ertesi gün %90 ila %95'e ulaşmasını bekleyin, her mililitre De'ye dört mikrolitre mikrolitre ekleyerek hücreleri uyarın, hücrelerle kontrol iyi bir şekilde bırakmayı ve R848 tedavisi yapmayı unutmayın.R848'i eşit olarak dağıtmak için plakayı yavaşça bir taraftan diğer yana sallayın, ardından hücreleri 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte 2 ila 16 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, hücre süspansiyonlarını plakadan 5 mililitrelik santrifüj tüplere aktarın. Hücreleri 200 x g'de beş dakika santrifüj edin, sonra süpernatantı çıkarın ve pbs'nin bir mililitresinde peleti yeniden askıya alın.Hücre süspansiyonuna 1,5 mililitrelik bir tüp aktarın ve 12,000 x g'de 4 santigrat derecede 30 ila 60 saniye aşağı döndürün, sonra da supernatant'ı dikkatlice çıkarın. El yazması yol tarifine göre lysis tamponu hazırlayın ve kullanıma hazır olana kadar buzüzerinde tutun. 30 mikrolitre likit buz gibi lysis tamponu ve pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için hücre pelet yeniden askıya alın.Sonra 15-20 dakika buz üzerinde tüp kuluçka. 4 santigrat derecede 15 ila 20 dakika 12, 000 x g'de santrifüj yaparak lysate'yi netleştirin ve süpernatantı önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve ekstreleri her zaman buzda tutmayı unutmayın. Daha sonra, Bradford Reagent kullanarak protein konsantrasyonu ölçün.El yazması yönlere göre üst ve alt hazneli elektroforez tamponlarını hazırlayın ve kuyuları bozmadan %3-12 yerli PAGE jelini suyla iyice durulayın, sodyum deoksikolat alırken ekstra özen alınmalıdır. Kimyasalın işlenmesi için laboratuvar önlüğü, emniyet gözlükleri ve maske gibi koruma için PPE gereklidir. Daha sonra, Mini Jel Tank içine jel ayarlayın, tarak çıkarın, hazırlanan üst ve alt oda elektroforez tamponlar ekleyin ve önceden 4 derece santigrat soğuk oda veya buz üzerinde 150 volt 30 dakika çalıştırın.Bu arada, 4X Yerli Örnek Tampon ile buz üzerinde hücresel proteinler karıştırarak yükleme için örnekleri hazırlamak. Ön çalışma tamamlandıktan sonra, her kuyuya 10 ila 15 mikrogram protein yükleyin ve jeli 85 voltta 30 dakika çalıştırın ve ardından 150 voltta iki saat çalıştırın. Daha sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca sds çalışan tampon jel ıslatın.Yaklaşık beş dakika boyunca metanol içinde ıslatarak polivinilidendiol diflorür membran etkinleştirin. Yönünü belirtmek için membranın bir köşesinde bir kesim yapın ve transfer sandviçini üreticinin protokolüne göre monte edin. Transfer kasetini tanka yerleştirin ve 20 voltta bir saat buz üzerinde aktarın.Daha sonra membranı plastik forsepslerle kasetten çıkarın ve oda sıcaklığında tamponu bloke ederek membranı 45 dakika boyunca sallanan bir çalkalayıcıda engelleyin. Daha sonra, membranı bir gecede 4 derece veya oda sıcaklığında iki saat boyunca birincil antikorla kuluçkaya yatırın ve sallarken 1XTBST yıkama tamponu ile üç dakika yıkayın. Daha sonra tekrar 45 dakika oda sıcaklığında 1XTBST yıkama tampon kullanarak ikincil antikor ile membran kuluçka, yıkar tekrar.Sonra uygun bir jel dokümantasyon sistemi kullanarak leke tazyik. Bu protokol kullanılarak R848 ile uyarılan veya uyarılamayan CAL-1 hücreleri immünoblot ile analiz edildi. Uyarılmamış CAL-1 hücrelerinde, IRF5 yerel SAYFADA monomerik formuna karşılık gelen tek bir bant olarak algılandı.Uyarılmış hücreler için, IRF5 monomer düzeyi azalırken, dimer düzeyi arttı. IRF5'te çeşitli yapılarla transfece edilmiş 293 T hücresi üzerinde anti-IRF5 antikoriçeren bir immünoblot yapıldı. Anti-IRF5 antikorözgülüğünü gösteren transfected kontrol hiçbir IRF5 tespit edildi.Monomerik IRF5'e karşılık gelen tek bir bant sadece 293 T hücrelerinde aşırı ifade veren IRF5'te tespit edildi. IRF5 aktive edici proteinleri kodlayan yapılar birlikte transfeced edildiğinde, IRF5'in dimerik formuna karşılık gelen yavaş hareket eden bir bant ortaya çıktı. Ancak RIG-I ile ilgili bir protein olan NMDA5, IRF5 dimerizasyonunu tetiklememiştir.Bis-Tris gradyan jellerin kullanımı, büyük olasılıkla IRF5 monomerik ve dimeric formları ayrılmasına izin bu jel elektroforetik sistemlerin özel pH ve kimyasal bileşimi nedeniyle çok önemlidir. Ayrıca, denatüre olmayan yerli numune tamponunda hücre lysatlarının lysing ve korunması yerli protein yapılarını korur. Burada yerli PAGE asitleri için özel bir ticari olarak kullanılabilir bir kullanılır.Bu büyük ölçüde iltifat ek bir yöntem, IRF5 nükleer translokasyon değerlendirmek için ImageStream görüntüleme akış sitometri sistemi kullanmaktır, hangi madde dir Ki dimerizasyon sonra IRF5 aktivasyonu. Protokolümüzle birleştirildiğinde, IRF5 etkinleştirmesinde yer alan adımları doğrulamak için başka bir tür test görevi göredehizmet eder. Inflamatuar yanıt önemli bir düzenleyici olmak, IRF5 enfeksiyon ve bağışıklık önemli bir rol oynar, otoimmün hastalıklar, kanser, ve diğer birçok hastalık insan sağlığı için önemli.IRF5 ve ilgili transkripsiyon faktörlerini hedef alan terapötiklerin geliştirilmesine yönelik çalışmalar da vardır. Bu protokol, çeşitli alanlardaki araştırmacıların IRF5 biyolojisini anlamalarına ve araştırmalarına olanak sağlayacaktır.

native-polyacrylamide-gel-electrophoresis-immunoblot-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

SiO Kantitatif, yüksek verimli, gerçek zamanlı ve etiket ücretsiz biyomoleküler algılama (DNA, protein,...

Biyomoleküler Algılama istihdam İnterferometrik Yansıtma Görüntüleme Sensörü (IRIS)

Virüs enfeksiyonlarına karşı doğal savunma örüntü tanıma reseptörleri (PRR'ler) tarafından tetiklenir. İki sitoplazmik PRR'ler Rig-I ve viral imza RNA'lar, değişim konformasyon, oligomerleşip ve antiviral sinyalini etkinleştirmek için PKR bağlamak. Yöntem, uygun yapısal anahtarlama ve bu sitoplazmik PRRS en oligomerizasyonu izlemek için izin tarif edilmiştir.

Antiviral Pattern Recognition reseptörler Rig-I Ve PKR By Limited Proteaz Sindirim ve Yerli PAGE izlenmesi aktivasyonu

Burada RNA / protein etkileşimleri analiz etmek için bir protokol mevcut. elektroforetik hareketlilik kayma deneyi (EMSA), yerli jel elektroforez sırasında RNA / protein kompleksleri ve serbest RNA ayırıcı geçiş dayanmaktadır. Bir radyo-etiketli bir RNA probu kullanarak, RNA / protein kompleksleri otoradyografi ile görselleştirilebilir.

IRE / IRP Örnek: RNA-protein Etkileşimleri Çalışmaları elektroforetik hareketlilik Shift Testi (EMSA)

Burada, IRF3 transkripsiyon faktörünün fosforilasyona bağlı aktivasyonunun ayrıntılı bir analizine izin veren bir prosedürü açıklıyoruz. Bu, yüksek çözünürlüklü bir SDS-PAGE ve çoklu fosfospesifik antikorlar kullanılarak immünoblotlara bağlı bir doğal PAGE'nin kombinasyonu ile elde edilir.

Bir Yüksek Çözünürlüklü Yöntem IRF3 fosforilasyonu bağımlı Aktivasyon Monitör

Hücre içi depolardanCa2+ salınımına aracılık eden homo-tetramerik bir iyon kanalı olan ryanodin reseptörünün oligomerizasyonu, iskelet ve kalp kası kasılması için kritik öneme sahiptir. Burada, proteinlerin kendi kendine birleşmesini tespit etmek ve homo-oligomer stokiyometrisini belirlemek için tamamlayıcı in vivo ve in vitro yöntemler sunuyoruz.

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

IRF5 inhibitör peptit ile tedavi edilen C57Bl/6J kontrol farelerinden, sıkı derili farelerden ve sıkı derili farelerden kardiyak hücre dışı matrisin izolasyonunu açıklıyoruz. Ayrıca, IRF5 inhibitör peptit ile tedavi edilen C57Bl / 6J, sıkı ciltli fareler ve sıkı ciltli farelerden izole edilen damarlar üzerindeki vazodilatasyon çalışmalarını da açıklıyoruz.

İzole Kapların vazodilatasyon ve Sıkı cilt Fare Ekstraselüler Matrix İzolasyonu

Sunulan iki antikor tabanlı protein-protein etkileşimi araştırma tekniği vardır: ayirt ve immunoprecipitation. Bu teknikler proteinlerin hücresel sinyal yollar roman bileşenleri keşfi ve anlayış protein dinamikleri arasında fiziksel etkileşimleri çalışmak için uygundur.<br...

Protein-protein etkileşimlerinin Autophagy araştırma çalışma

Rekombinant retroviral integrase ve DNA reaksiyonlar viral DNA uçları taklit eden bir intasome bilinen bir enzimatik etkin kompleks oluşabilir. Intasomes biyokimyasal, yapısal ve Kinetik çalışmalar için kullanılır. Bu protokolü nasıl bir araya getiren ve prototip köpüklü virüs intasomes arındırmak ayrıntılı.

Derleme ve prototip köpüklü virüs Intasomes arıtma

Açıklanan ilgi ve etiket-free kütle spektrometresi belirli bir protein in immünafinite zenginleştirme kullanarak bir nükleer hücre altı fraksiyonu protein etkileşim ortakları tanımlamak için bir proteomik iş akışıdır. İş akışı hücre altı fraksiyonu, immünoprepitasyon, filtre destekli numune hazırlama, çevrimdışı temizleme, kütle spektrometresi ve aşağı akım biyoinformatik boru hattını içerir.

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Protein-protein etkileşimleri, hedef proteinlerin işlevini aydınlatmak için önemlidir ve ko-immünopresipitasyon (co-IP), PPI'leri kolayca doğrulayabilir. Epitop etiketli bir proteini kodlayan bir plazmiti HEK-293 hücrelerine geçici olarak transfekte ettik ve iki hedef proteinin bağlanmasını kolayca doğrulamak için bir immünopresipitasyon yöntemi geliştirdik.

Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Anti-Epitop Etiket Afinite Jeli ile İmmünopresipitasyon

Öğrenin, yerli poliakrilamid jel elektroforez immünblot analizi ile CAL-1 hücrelerinde endojen IRF5 dimerizasyonunu nasıl değerlendireceğinizi. Bu protokol, bağışıklık yanıtlarında IRF5 biyolojisini incelemek için güvenilir sonuçlar sağlar.

Endojen IRF5 Dimerizasyon Yerli Poliakrilamid Jel Elektroforez İmmünblot Analizi

Daha fazla video keşfet