Name: Interscapular Beyaz Yağ Ped içine Rat Mammary Epitel Hücre Nakli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Keşfedin sıçan meme epitel hücrelerinin interskapular beyaz yağ pedine nakil yöntemini. Bu teknik, endojen meme bezlerini iç kontrol olarak kullanarak meme kanseri duyarlılığı araştırmalarında hücre özerkliğini incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Hollings Kanser Merkezi Destek Hibe P30 CA138313 ulusal Sağlık Enstitüleri pilot araştırma fonu tarafından finanse edilmiştir<a href="https://www.nih.gov/" target="_blank">(https://www.nih.gov/</a>), ve Güney Carolina Tıp Üniversitesi Patoloji ve Laboratuvar Tıbbı Bölümü fonları. Marijne Smiths'e röportaj açıklamalarını kaydettiği için teşekkür ederiz.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokol, sıçanlarla çalışmak için optimize edilmiş bir meme epitel hücre nakli tekniğini tanımlar. Donör sıçanlardan izole edilmiş meme epitel organoidleri (3-5 haftalık yaş) alıcı sıçanların interskapular beyaz yağ yastığına (ayrıca 3-5 haftalık) aşılanır. Sonuçlar 4-6 hafta sonra, aşılı dokuyu incelemek için ışık mikroskobu kullanılarak yorumlanabilir; ancak, tam bir deney uygulamadan önce transplantasyon ve kurban arasında en uygun süre belirlenmelidir. Çok az veya çok fazla zaman geçtiyse, sonuçlar ne yorumlanabi...

Postnatal meme bezi gelişimi ve duktal morfogenez büyük ölçüde ergenlik başlangıcında hormonal sinyal etkilenir süreçlerdir. Farelerde ve sıçanlarda, meme bezi biyolojisinin yaygın olarak kullanılan model organizmalar, bu süreç yaş yaklaşık 3 hafta başlar, hızlı çoğalma ve farklılaşma olgun parankim oluşumuile sonuçlanır. Olgun meme bezi genişleme ve involution, erken20. Hiperproliferasyon ve kanser gelişimi bağlamında, meme bezi transplantasyon teknikleri 1950'lerde geliştirilmiş ve 1977 yılında Gould ve ark. tarafından katkıda kantitatif metodoloji ile geliştirilmiş2,3,4. Kemirgenlerde transplantasyon tekniğinin iyileştirilmesi, çeşitli tedavilerin ve genetik manipülasyonun normal meme bezi gelişimi ve hastalık durumları üzerindeki etkisini incelemek için hala yaygın olarak kullanılan normal meme bezi biyolojisinin anlaşılmasında önemli ilerlemelere katkıda bulunmuştur.
Birçok hipotez ler üretilmiş ve daha sonra meme bezi nakli kullanılarak test edilmiştir, ilk olarak DeOme ve ark. tarafından 19591. Birkaç on yıl boyunca deneyler tüm yağ pedi yeniden doldurmak için donör meme bezleri nden excised duktal doku eğilimi gösterdi5,6,7 ve meme bezi gelişiminin kritik bir bileşeni bu epitel yapılarda bulunduğunu belirtti. Farelerde daha sonra yapılan çalışmalar, tek bir meme kök hücresi temizlenmiş bir yağ yastığı yeniden doldurmak ve bazal ve luminal meme epitel hücrelerinin tek, ortak atasının keşfine katkıda bulundu gösterdi8,9,10. Bu sonuçlar doğrultusunda, bu transplantasyon plastisite sonucu multilineage-repopulating potansiyeli ile hücrelerin havuzu artırır, aşılanmış hücrelerin fonksiyonel bir memebezi7büyümeye izin,10,11,12,13olduğu ileri sürülmüştür. Daha da önemlisi, kemirgenlerde transplantasyon tekniklerinin kullanımı hücre kültürüne bağlı anormalliklerin14'ün sınırlarını aşar ve genellikle sadece birkaç hafta içinde sonuç verir.
Prosedür aslında farelerde preneoplastik lezyonlar bağlamında açıklanan iken, yakında sıçanlara genişletilmiş ve kanser duyarlılığı bir ölçüsü olarak çokluk kurmak için kanserojen tedavi ile birlikte kullanılan15, ama transplantasyon teknikleri popülaritesi her tür için genetik araçların geliştirilmesi izledi. Transplantasyon içeren fare çalışmaları birçok çeviri bulgular katkıda bulunmuş olsa da, sıçan meme bezinin parankim daha yakından insan benzer16,17 ve östrojen reseptörü-pozitif çalışma için farklı avantajlar sunuyor (ER +) meme kanseri. Meme tümörleri her iki türde de indükleyicidir, ancak hormon duyarlılığı ve gen ekspresyonu profilleri açısından farklılık gösterirler. Birincil bir fark sıçan meme tümörleri ifade ve yumurtalık ve hipofiz hormon reseptörlerinin işlevine bağlıdır, yani, östrojen ve progesteron (PR), insan meme kanseriluma benzer-A alt tipi. Nitekim, meme epitel hücre nakli, bu protokolde açıklandığı gibi, meme kanseri nde yer genetik varyantları incelemek ve meme epitel hücreleri üzerindeki etkilerihücresel özerkliğini belirlemek için kullanılmıştır18.
Tümör biyolojisine ek olarak, normal sıçan meme bezinin duktal epitel dallanma daha yüksek bir düzeyde sergiler ve fare daha stroma daha kalın bir tabaka ile çevrilidir. Meme epitelyal transplantasyon çalışmalarında stromanın önemi iyi belgelenmiştir. Meme epitel yağ stroma ile etkileşim gerekir, ve ideal olarak kendi mezenkim, karakteristik morfogenez geçmesiiçin 19,20. Alıcı meme beziiçine doku aşılama optimal bir ortam sağlar; ancak, endojen epitel varlığı sonuçları etkileyebilir. Endojen epitelin meme bezinin temizlenmesi genellikle fare transplantasyonu tahlillerinde yapılır ve endojen meme dokusunun cerrahi eksizyonu ve/veya meme ucunun çıkarılmasını gerektirir1,21,22. Mümkün olsa da, post-kesişen sıçanlarda meme epitel preclearing yaygın olarak gerçekleştirilen değildir, özellikle post-kesen sıçanlarda büyüyen meme ağacı temizleme etkisizliği nedeniyle. Vücudun başka bir yerinde yağ dokusu bölgeleri nakledilen meme epitel büyümesini destekleyebilir gösterilmiştir beri21,23,24, interscapular beyaz yağ yastığı içine doku aşılayarak sıçanlarda preclearing süreci kolayca önlenebilir.
Bu yazıda açıklanan transplantasyon yöntemi enzimatik olarak ayrıştırılmış meme bezi organoidlerinin (meme duktal epitel ve morfogenez yeteneğine sahip diğer hücre tipleri parçaları) veya laboratuvar sıçanlarının inbred, izojenik veya konjenik suşları interskapular yağ yastığı içine monodispersed hücrelerin enjeksiyonu içerir2. Interscapular yağ yastığı normalde meme dokusu yoksun olduğundan, endojen epitel önceden temizlemek için gerek kalmadan birden fazla transplantasyon siteleri için uygun bir ortam sağlar. Sonuç olarak, konak hayvanın endojen, abdominal-inguinal meme bezleri cerrahi manipülasyona tabi değildir, normal gelişir ve sonuçların yorumlanmasına engel olamaz. Ayrıca, bozulmamış meme bezleri memmary epitel gelişimi ve tümörigenez18,25konak karşı donör etkilerini değerlendirmek için karşılaştırma için kullanılabilir. Tek bir kök hücreden meme bezinin repopülasyonfareler için kullanılabilir olmasına rağmen, henüz sıçan için geliştirilmiş değil, özellikle sıçan meme kök hücreleri için seçmek için antikorların durumu eksikliği nedeniyle25,26,27. Buna rağmen, repopulating potansiyelini ölçmek için monodispersedilmiş meme epitel hücrelerinin nakli başarıyla yapılabilir, ve bu hücreler uygunçerçeve2,3,4aşılı zaman normal gelişecektir . Organoidler birçok amaç için iyi olsa da, monodispersed hücreler kantitatif uygulamalar için gereklidir, örneğin, iyonlaştırıcı radyasyon tedavisi28 aşağıdaki kanser inisiyasyonu için gerekli meme epitel hücrelerinin sayısını belirlemek için veya akış sitometrik olarak seçilmiş meme epitel hücre popülasyonlarının özelliklerini karşılaştırmak için29.
Bugüne kadar, burada açıklanan prosedür meme bezi gelişimi ve meme kanseri gelişimi altında yatan mekanizmaları çalışma genel bir amacı ile sıçanda meme bezi nakli gerçekleştirmek için en sağlam yöntemdir. Genellikle, donör ve / veya alıcı hayvanlar önce farklı değişkenlere maruz kalan, sırasında veya epitel nakli nden sonra. Örnekler kimyasal karsinogenez içeren tek gen çalışmaları içerir30, radyasyon28,31,32, konak / donör genom genetik manipülasyon18, ve hormonal manipülasyon12. Bu protokolde tanımlanan enzimatik ayrışmanın en önemli avantajı, akış sitometrisi, 3-B kültürü, gen düzenleme ve daha fazlasını içeren tamamlayıcı deneyler için epitel organoidleri veya monodispersi hücreleri izole etme fırsatıdır. Bu tekniğin gelecekteki uygulamaları genetik mühendisliği ile donör ve / veya konak doku ek manipülasyon içerecektir. Örneğin, donör hücreler CRISPR-Cas9 gen düzenleme sistemi kullanılarak seçilen herhangi bir genomik lokusta genetik olarak ex vivo değiştirilebilir. Benzer şekilde, alıcı sıçanlar da genetik donör ve alıcı mühendislik genetik faktörler arasındaki etkileşimi incelemek için değiştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>0.2 ve mikro; M şırınga filtreleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-715G</td><td>steril filtreli kollajenaz sindirim ortamı</td></tr><tr><td>1.5 - 2.0 mL mikrosantrifüj tüpleri (steril)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>yeniden süspansiyon hücreleri ve/veya beyin homojenat karışımı</td></tr><tr><td>100 & M hücre süzgeçleri</td><td>Corning</td><td>431752</td><td>filtreli beyin homojenatı</td></tr><tr><td>25 gauge iğneli 100 uL gaz geçirmez şırınga</td><td>Hamilton</td><td>81001 & 90525</td><td>Alıcı hayvanlara greft karışımı enjekte etmek için (donör genotipi/durumu başına 1 adet)</td></tr><tr><td>1000 uL pipet ucu + pipet</td> <td>-</td><td></td> <td>transfer hücreleri/karışımları/doku</td></tr><tr><td>15 mL polipropilen tüp</td><td>Falcon (Corning)</td><td>352196</td><td>beyin homojenat karışımı depolama veya hücre: transplantasyon için homojenat karışımı</td></tr><tr><td>40 & M hücre süzgeçleri</td><td>Corning</td><td>431750</td>, <td>hücre peletini yıkadıktan sonra organoidleri filtreleyen</td></tr><tr><td>50 mL polipropilen tüpler</td>, <td></td><td></td><td>donör meme bezi dokusunun kollajenaz sindirimi için</td></tr><tr><td>60 mm tabaklar</td>, <td>Thermo Scientific Doku</td><td>kıyma için</td><td>130181</td></tr>, <tr><td>Şap Potasyum Sülfat</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>243361/237086</td><td>boyama meme bezi, bütün montaj slaytlar</td></tr><tr><td>Veteriner kullanımı için anestezi buharlaştırıcı</td> <td>-</td><td></td> <td>kurumsal protokolü takip edin</td></tr><tr><td>Beta-dine veya iyot</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Homojenizasyon için borosilikat cam kültür tüpü</td> Beynin homojenizasyonu için <td>Fisher Scientific</td><td>14-961-26</td><td>(homojenizatör için uygun tüp kullanın)</td></tr> <tr><td>Karmin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6152/1022</td><td>boyama meme bezi tüm montaj slaytları</td></tr><tr><td>Hücre sayma aparatı</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kurtarma için temiz hayvan kafesleri</td> <td>-</td><td></td> <td>kurumsal protokolü takip edin</td></tr><tr><td>Kollajenaz Tip 3</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LS004183</td><td>Donör sıçanlardan kıyılmış meme bezi dokusunun enzimatik sindirimi</td></tr><tr><td>Deiyonize su</td><td></td> <td>-</td> <td>kimyasal çözeltiler için</td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Doku, kollajenaz sindirim ortamı ve epitel hücre karışımlarının yeniden süspanse edilmesi için</td><td>GIBCO</td><td>11320033</td></tr><tr><td>EDTA</td> <td>-</td><td></td> <td>monodispersiyon karışımı</td></tr><tr><td>Etanol, 200 Kanıt Decon Labs</td><td></td><td>2705/2701</td><td>meme tam montaj slayt fiksatif, meme tam montaj slayt yıkama, cerrahi insizyon bölgelerinin temizlenmesi (seyreltilmiş)</td></tr> <tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Hipoklon</td><td></td> <td>inaktivasyon çözeltisi</td></tr><tr><td>Gazlı bez</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Buzul asetik asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td> meme <td>tam montaj slayt fiksatif için kullanım (% 100 etanol içinde 1: 4 buzlu asetik asit)</td></tr> <tr><td>HBSS</td><td>GIBCO</td><td>-</td><td>monodispersiyon karışımı</td></tr><tr><td>Isıtma pedleri</td> <td>-</td><td></td> <td>kurumsal protokolü takip edin</td></tr><tr><td>Buz kovaları (x2)</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Yörünge dönüşlü inkübatör</td> <td>-</td><td></td> <td>37 ° C'yi koruyabilmelidir; C, 220-225 RPM'de çalkalama (meme dokusunun kollajenaz sindirimi için)</td></tr> <tr><td>İzofluran anestezisi</td><td></td> <td>-</td> <td>kurumsal protokolü takip edin</td></tr><tr><td>Işık mikroskobu veya dijital kamera</td> <td>-</td><td></td> <td>tüm monte edilmiş meme epitelini görselleştirme ve / veya görüntü elde etme</td></tr><tr><td>Mekanik homojenizatör</td><td>Fisher Scientific-TissueMiser</td><td></td> <td>veya alternatif modeller</td></tr><tr><td>Mineral yağ, saf</td><td>Sigma-Aldrich / ACROS Organics</td><td>8042-47-5</td><td>temizlenmiş meme bezinin uzun süreli depolanması tüm bağlar</td></tr><tr><td>Anestezi buharlaştırıcı için oksijen tankları</td> <td>-</td><td></td> <td>kurumsal protokolü takip edin</td></tr><tr><td>Kağıt havlular veya hassas görev mendilleri</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pozitif yüklü mikroskop slaytları</td><td>Thermo Scientific</td><td>P4981-001</td><td>meme bezi dokusu tüm bağlar</td></tr><tr><td>Ameliyat sonrası analjezik</td> <td>-</td><td></td> <td>Kurumsal protokol</td></tr><tr><td>Hayvanların vücut ağırlığı ölçümlerini ölçeklendirin</td><td></td><td></td><td></td>, ağrı kesici ilaçların uygun dozu</tr><tr><td>Tıraş makinesi</td><td></td><td></td> <td>- elektrikli makaslar veya diğer</td></tr><tr><td>Boyama kavanozları</td> <td>-</td><td></td> <td>kimyasal yıkama başına en az 1, slayt sayısına uygun boyut, cam tercih edilir</td></tr><tr><td>Steril alan örtüleri</td><td>IMCO</td><td>4410-IMC</td><td>transplantasyon sırasında kullanılır</td></tr><tr><td>Steril makas ve forseps x3 (otoklavlanmış)</td> <td>-</td><td></td> <td>donörler ve alıcılar için kullanılan otoklav cerrahi aletler</td></tr><tr><td>Şırıngalar: 5 mL (veya daha büyük)</td> <td>-</td><td></td> <td>kollajenaz sindirim ortamının steril filtrasyonu için</td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Worthington</td><td></td><td>monodispersiyon karışımı</td></tr><tr><td>Sıvılar için atık toplama kabı (dökülmüş veya aspire edilmiş)</td><td>- </td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Yara klipsi aplikatı, klipsler ve çıkarma aleti</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>12020-00</td><td>İnterskapular beyaz ped pedi üzerindeki cilt kesisinin kapatılması</td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisher Scientific</td><td>X3S-4</td><td>temizleme meme bezi boyamadan sonra tüm montaj slaytları</td></tr></tbody></table>

interscapular beyaz yağ ped içine rat mammary epitel hücre nakli

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

1970'lerin başlarında araştırmacılar, meme epitel hücrelerini farelerin kesiler arası beyaz yağ yastığına başarıyla naklettiler. Transplantasyon teknikleri kullanılarak meme epitelinin aşılanması, ergen kemirgen konaktarafından sağlanan hormonal ortamdan yararlanır. Bu çalışmalar ideal meme bezi gelişimi üzerinde çeşitli biyolojik manipülasyonlar etkisini keşfetmek ve meme bezi biyolojisi birçok yönlerini incelemek için uygundur. Yaygın ama sınırlayıcı bir özellik, nakledilen epitel hücrelerinin çevredeki stromadan güçlü bir şekilde etkilenmesi ve endojen epitelile daha fazla rekabet etmiş olmasıdır; yerli meme dokusu kullanmak için, karın-inguinal beyaz yağ yastığı transplantasyon öncesi ev sahibi meme epitel kaldırmak için temizlenmelidir. Fare modeli organizma kullanırken önemli bir engel post-kesilmiş sıçanlarda gelişmekte olan meme ağacı temizleme verimli değildir. Bezsiz yağ pedleri içine nakledildiğinde, donör epitel hücreleri temizlenmiş konak yağ pedi yeniden doldurmak ve fonksiyonel bir meme bezi oluşturabilirsiniz. Interscapular yağ yastığı bu greftler için alternatif bir yerdir. Önemli bir avantajı, duktal yapılar henüz epitel büyümesini teşvik etmek için gerekli olan ve sıçan kolayca erişilebilir normal stroma sağlar olmasıdır. Bu tekniğin bir diğer önemli avantajı minimal invaziv olmasıdır, çünkü büyüyen endojen meme ağacını kaldırma ihtiyacını ortadan kaldırır. Ayrıca, interscapular yağ yastığı aşılama için ayrı siteler için kullanılabilecek bir medial kan damarı içerir. Endojen bezleri bozulmamış kalır çünkü, Bu teknik de nakledilen bezi endojen meme bezi karşılaştırarak çalışmalar için kullanılabilir. Bu yazıda farelerin interscapular beyaz yağ yastığı içine meme epitel hücre nakli yöntemi açıklanmaktadır.

Donör ve alıcı meme bezleri Sıçan meme epitel hücrelerini organ nakli için izole etme ve hazırlama adımları Şekil 1A'dagösterilmiştir. 4 haftalık ken, donör sıçan Endojen meme bezi olgunlaşma başladı ve epitel alum karmin ile boyanmış tüm monte slaytlar üzerinde görüntülenebilir (Şekil 1B). Bu yaştaki bir donör sıçan, transplantasyon için yaklaşık ...

Bu makalede, alıcı hayvanların interscapular beyaz yağ yastığı içine donör sıçan meme epitel hücreleri greft bir transplantasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, meme epitel gelişimi üzerindeki konak ve/veya donör etkilerini incelemek ve ön temizleme ihtiyacını ortadan kaldırmak ve böylece bu tekniğin kullanışlılığını genişletmek için kullanılabilir.

Interscapular Beyaz Yağ Ped içine Rat Mammary Epitel Hücre Nakli

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Bu protokol 40 yılı aşkın bir süredir kullanılmaktadır ve sıçanda meme hücre nakli tahlilleri için tek güvenilir yöntem olmaya devam etmektedir. Bu yöntem yaygın meme kanseri duyarlılık araştırmalarında meme hücresi otonom karşı konak etkileri sorgulamak için kullanılır. Interscapular yağ yastığı aşılama ile, bu yöntem sıçanlarda etkili değildir endojen membran epitel temizlemek zorunda atlatır.Bu nedenle yöntem daha az invaziv ve endojen meme bezleri bir iç kontrol olarak kullanılabilir. Bu işlem başlamak için, sırtına bir ötenazi dişi sıçan yerleştirin ve iğneler ile güvenli. Sprey tüm ventral yüzey% 70 etanol ile.Torasik erişim sağlayan bir sagittal Y şeklinde kesi olun, karın, ve inguinal meme bezleri. Donör sıçan tüm meme bezi dokusunu incelemek ve tüm görünür lenf düğümlerini kaldırmak için makas kullanın. Sonra, meme dokusu ayıklamak için forceps kullanın.500 mikrolitre serumsuz DMEM F12 ortam içeren etiketli 60 milimetrelik bir tabağa yerleştirin ve buzda tutun. Sonra ince meme dokusu kıyma makas kullanın. İlk olarak, dikkatli bir şekilde uygun bir pozisyonda yerleştirmek ve iğneler ile güvenli donör hayvanın vücut açın.Sprey baş ve üst sırt% 70 etanol ile. Kafatasının tabanını bulun ve oksipital konilerlenin altına bir kesi yapın, derinin altına keskin makas yerleştirin ve başın kenarları da dahil olmak üzere kafatasından deriyi kesin. Daha sonra, kemik kesiciler veya güçlü makas kullanın oksipital frontal kemiklere orta hat boyunca kafatası kesmek için mümkün olduğunca yüzeysel ve altta yatan beyin dokusunun imha önlemek için yukarı doğru açılı olarak bıçak tutmak için emin olun.Kemiği soymak için Rongeurs veya güçlü forceps kullanın. Her iki tarafta kemik kırmak için beyincik için aracı lateral yerleştirin. İşitsel kanalı tamamen teşhir ederek menenjlerle olan bağlantılarını kes.Beyni kafatasından çıkarmak ve ağırlığını kaydetmek için kavisli ince uçlu forseps kullanın. Ek donör beyinler için malzemeleri taze bir başlangıç kullanın. Hemen buz üzerinde depolanan ortam eşit miktarda içeren 15 mililitrelik bir tüp aktarın.Düşük hızda 10 ila 15 saniye boyunca beyni homojenize edin. Sonra büyük parçaları kaldırmak için homojen filtre. Sıvıyı ihtiyaç duyulana kadar buzüzerinde saklayın.İlk olarak, 1.000 mikrolitrelik pipet ucunun ucundan bir santimetre kesin ve pipettorun üzerine manuel olarak yerleştirin. Her 60 milimetrelik çanak tan kolajenaz sindirim tüpü için kıyma donör doku aktarmak için kesilmiş bir pipet ucu kullanın. Kıymalı dokuyu bir veya iki kez yukarı ve aşağı boruyla karıştırarak hafifçe karıştırın.Daha sonra numuneleri sallayarak kuvözde yatay bir pozisyonda sabitleyin. 200 ve 220 RPM arasında bir hızda sallayarak 37 santigrat derece 1,5 ila iki saat boyunca sindirmek için örnekler izin verin. Donör meme bezi dokusu tamamen sindirildiğinde, süspansiyonu 1,200 kez g ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin.Bir pelet oluşmuştur sağladıktan sonra, yağ tabakası kaldırmak için bir pipet kullanın veya dikkatle supernatant dökün. Peleti 10 mililitre taze DMEM F12 ortamla hafifçe askıya alın. Hücreleri iyice yıkamak için bu işlemi tekrarlayın.Her donör hayvan için 40 mikrometresüz bir 50 mililitrelik tüp hazırlayın. Süzgeci en az bir mililitre DMEM F12 media ile önceden ısla. Sonra kanal parçaları veya organoidler toplamak için filtre yoluyla hücre süspansiyon geçmek için bir pipet kullanın.Organoidler için, sadece filtrede kalan hücreleri saklayın. Yeni bir 50 mililitrelik tüp üzerinde hücre süzgeci ters ve steril ortam herhangi bir hacim ile durulayın tüm hücreleri toplamak için gerekli. Bundan sonra, bir kez daha hücreleri pelet ve sayma için medya küçük bir hacim içinde resuspend.Tüm nakil alıcıları için, hücre süspansiyonunun eşit hacimli ve her nakil bölgesi için %50 beyin homojenate'i birleştirerek tek bir donör malzeme toplu hazırlayın. İlk olarak, kafatasıtabanını belirleyin ve alıcı bir hayvan üzerinde vertebral sütunun başlangıcı. Omurganın aşağı yaslanmış yolun yaklaşık üçte biri, sırtın üst torasik kısmında iki santimetrelik bir alana üç santimetre tıraş.Daha sonra, ameliyat için kullanılacak steril alanı hazırlamak ve gerekli tüm malzemeleri düzenlemek. Hamilton şırıngalarını steril DMEM F12 ortamlarıyla yıkayın ve hücre kaybını önleyin. Her durum için ayrı bir şırınga içine donör malzemenin tüm hacmi yükleyin.Şırınga tamamen yüklendikten sonra, onu ters çevirin ve iğnenin ucundaki hava kabarcıklarını çıkarmak için pistonu hafifçe bastırın. Prosedür boyunca şırıngayı buzda tutun. Hayvan ın derin uyaranlara karşı tepkisiz kaldığından emin olun.Sonra küçük bir interscapular kesi yapmak için keskin bir cerrahi bıçak kullanın. Oryantasyon için medial kan damarını bulun ve kesinin bir tarafındaki deriyi kaldırmak için forseps kullanın. Yağ yastığıuzak deri tutun ve nakil yapılırken altta yatan kahverengi yağ kaçının.Sonra iğneyi greft bölgesine takın. Hücre karışımının 40 mikrolitresini interskapular beyaz yağ yastığı dokusuna dikkatlice enjekte edin. İğneyi yavaşça çıkar.Dokuyu yerinde tutun ve nakledilen hücrelerin 3-5 saniye yerleşmesine izin verin. Daha önce transplantasyon ikinci yerinde açıklandığı gibi tüm enjeksiyon prosedürü tekrarlayın. Bundan sonra, yara klipleri veya dikişler kullanarak cerrahi yara kapatın ve daha sonra anestezi durdurun.Hayvanı feda ettikten sonra, diseksiyon için hazırlayın. Interskapular yağ yastığında greft bölgelerini ayıran medial kan damarını belirleyin. Tek bir doku parçası olarak tüm pedi çıkar.Tüm montaj için pozitif yüklü mikroskop slayt üzerinde doku yerleştirin. Doku yağlamak için yedi ila 10 gün boyunca% 70 etanol slaytlar yerleştirin. Sonra şap karmin leke hazırlamak ve doku yeterince opak olduğunda slaytlar süreci.İşlem tamamlandığında ve slayttaki doku temizlendiğinde, analiz için slaytların görüntülerini elde etmek için düşük güçlü ışık mikroskobu veya yüksek çözünürlüklü dijital fotoğraf kullanın. Bu çalışmada, meme epitel hücreleri donör sıçanlardan izole meme epitel organoidler alıcı sıçanların interscapular beyaz yağ yastığı içine aşılanır sıçanlar ile çalışmak için optimize edilmiş bir teknik kullanılarak nakledilir. Epitelin varlığı, yokluğu veya bolluğu, deneyin başarısını ve deneysel değişkenlerle ilgili etkilerin özerkliğini belirlemek için değerlendirilebilir.Her faktörün vahşi tip ekarşı nakavt gibi iki düzeyi olan karşılıklı transplantasyon deneyi hipotez testi için dört nakil grubu oluşturacaktır. Burada gösterilen temsili tüm monte interscapular yağ yastığı transplantasyon her iki sitede olumlu epitel outgrowth içerir. Slaytlar analiz edilirken, birçok örnek arasında interscapular yağ yastığı epitel eksikliği prosedür ile teknik bir sorun gösterebilir ve olumsuz bir sonuç olarak ele alınmalıdır.Donör epitel büyüme de endojen meme bezi ile karşılaştırılabilir ve ek sonuçlar kolaylaştırabilir. Burada gösterilen örnekte, yabani tip ve CDKN1B nakavt sıçanlar kullanılarak karşılıklı transplantasyon sonuçları meme bezi gelişimi üzerinde non-meme hücre otonom etkileri önerdi. Donör epitel hücreleri ve organoidler dikkatle hazırlanmış ve alıcı hayvan içine enjekte kadar canlı tutulmalıdır unutmayın.Önceden planlamak ve prosedürü dikkatli ve kesintisiz olarak gerçekleştirmek zorunludur. Meme kanserinin etiyolojisinde veya tedavisinde meme hücre özerkliğini sorgulamak için transplantasyon sonrası primer karsinogenez tahlilleri yapılabilir. Gen düzenleme de genetik donör hücreleri veya alıcı sıçan mühendisi dahil edilebilir.Sıçanlarda meme epitel hücre naklinin tek yöntemi olan bu işlem meme bezi gelişimini ve karsinogenez çalışmalarını kolaylaştırır. Bu teknik özellikle meme kanseri hücreleri ve/veya meme epitel hücreleri arasındaki etkileşimleri konak mikroçevre ile araştırmak için önemlidir. Meme bezi gelişiminde ve meme kanseri araştırmalarında çalışmalara olanak sağlar.Bu tekniği ilk kez deneyenler, maksimum hücre verimi ve canlılığını sağlamak için donör hücre preparatlarını optimize etmeli, daha sonra cerrahi prosedürleri uygulamak ve enjekte etmek için hücre sayılarını belirlemek ve ayrıca deneyler için gerekli cerrahi sonrası kuluçka sürelerini belirlemek için küçük pilot deneyler yapmalıdır.

rat-mammary-epithelial-cell-transplantation-into-interscapular-white

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu makale DeOme KB tarafından geliştirilen yöntemle...

Meme Epitel Nakli Prosedürü

Bu raporda, izole etmek için bir sistem ve fare meme bezi kültür donör hücreleri göstermek ve bu hücrelerin orthotopically nakli stromal analiz etmek için alıcı farelerde meme tümör gelişimi sırasında epitelyal etkileşimler.

C57BL/6J Fare Stromal Cells ve Karsinomu Hücreler Meme Nakli

Bu makalede, meme kanseri hücrelerini meme yağ yastığına enjekte ederek dişi farelerde bir meme kanseri modelinin nasıl oluşturulacağını tartışıyoruz. Örnek protokol ortotopik enjeksiyonu göstermektedir.

Meme Yağ Yastığına Ortotopik Enjeksiyon: Farelerde Meme Kanseri Oluşumu

Video, bir fare modelinde meme kanseri ortotopik aşılama tekniğini göstermektedir. Bu teknik, deri altı veya cerrahi olmayan enjeksiyona kıyasla tümör boyutu ve şeklinde daha az değişkenlik ile yüksek bir tümör oluşumu oranı üretir.

Ortotopik Enjeksiyon: Dokuya Özgü Kanser Hücrelerinin Yetişkin Bir Fareye İmplante Edilmesi

Kanser tümörü çevreleyen dokunun hem de yerel pro- ve anti-inflamatuar aracılar tarafından etkilenir kompleks bir hastalıktır. Bu nedenle, daha çok deri altı modellere göre ortotrop enjeksiyon modelleri, bir şekilde daha iyi taklit eden insan patoloji kanser ilerlemesinin incelemek için yararlı olabilir.

Farelerin Meme Fat Pad içine Meme Kanseri Hücreleri Ortotopik Enjeksiyon Tümör Büyüme Eğitim için.

Bu protokol, adherent / mezenkimal meme epitel hücrelerinden ekstraselüler veziküller (EV) / ekzozomların arıtılması, nicelendirilmesi ve karakterize edilmesine yönelik yöntemleri ve meme bezi oluşturma yeteneğini luminal meme epitel hücrelerine aktarmak için kullanmayı açıklamaktadır. Gövde benzeri meme epitel hücrelerinden türetilmiş EVs / eksozomlar, bu hücre özelliğini EV'leri / eksosomları emen hücrelere aktarabilir.

Membran Bazal Epitelyal Hücreler ile Membran Luminal Hücreler Arasındaki Meme Bezi Oluşturma Yeteneğinin Ekstraselüler Vesiküller / Ekzozomlar Yoluyla Transferi

Bu çalışma, mikroskopik gözlem için tüm montaj dokusu hazırlığının ardından meme yağ padi transplantasyonu yoluyla vasküler endotel kök hücrelerinin (VESC'lerin) çoğalmasını, farklılaşmasını ve damar oluşturma potansiyelini değerlendirmek için yeni bir yaklaşımı göstermektedir. VESC'lerin in vivo davranışlarını araştırmak için bir soy izleme stratejisi de sunulmuştur.

Vasküler Endotelyal Kök Hücrelerin Damar Oluşumunu Görselleştirmek İçin Yeni Bir Göğüs Göğsü Transplantasyon Tekniği

Burada, biz meme kanseri hücrelerinin basit, daha az invaziv ve ele kolay bir şekilde meme yağ yastığı içine implant için bir protokol mevcut ve bu fare orthotopic meme kanseri model uygun meme yağ yastığı yapısına sahip çeşitli yönlerini incelemek için kullanılabilir kanser.

Fareler meme yağ yastığı içine meme kanser hücrelerinin Orthotopic enjeksiyon

Hasta kaynaklı ksinograft (PDX) modelleri ve nakledilebilir genetik olarak tasarlanmış fare modelleri insan hastalığına sadık kalınarak rekapitulate edilir ve temel ve çevirisel meme kanseri araştırmaları için tercih edilen modellerdir. Burada, tümör biyolojisini incelemek ve ilaç yanıtını değerlendirmek için meme tümörü parçalarını meme yağ yastığına ortotopik olarak nakleden bir yöntem açıklanmaktadır.

Meme Kanseri için Preklinik Modeller Olarak Meme Tümörlerinin Ortopedik Transplantasyonu

Meme kanseri metastazını hedef alan adjuvan tedaviyi değerlendiren klinik öncesi modeller eksiktir. Buna değinmek için, de novo pulmoner meme adenokarsinom metastazına ait bir fare modeli geliştirdik, burada adjuvan ortamında (primer tümörlerin cerrahi sonrası rezeksiyonu) uygulanan terapiler önceden tohumlanmış pulmoner metastazları etkilemek için etkinlik açısından değerlendirilebilir.

Klinik Öncesi Bir Murin Modeli İçin Cerrahi Prosedürler ve Metodoloji<emDe Novo</emMeme Kanseri Metastazı

Keşfedin sıçan meme epitel hücrelerinin interskapular beyaz yağ pedine nakil yöntemini. Bu teknik, endojen meme bezlerini iç kontrol olarak kullanarak meme kanseri duyarlılığı araştırmalarında hücre özerkliğini incelemeyi sağlar.

Interscapular Beyaz Yağ Ped içine Rat Mammary Epitel Hücre Nakli

Daha fazla video keşfet