Name: Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Öğrenin, ubiquitin ve ubiquitin benzeri post-translasyonel modifikasyon profillerini lentivirüs kullanarak nasıl oluşturulur. Bu yöntem, çift etiketli protein saflaştırma ile hastalıklarla ilişkili değişiklikleri belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma La Ligue Contre le Cancer tarafından HV ve MS'e ve ARC (dernek pour la recherche sur le cancer) tarafından PS, INCa (institute national du cancer) ve Canceropole PACA to JI tarafından desteklendi. IBISA (Infrastructures Biologie Santé et Agronomie), Plateforme Technologique Aix-Marseille, Cancéropôle PACA, Provence-Alpes-Côte d'Azur tarafından desteklenen Marsilya Proteomics (marseille-proteomique.univ-amu.fr) kütle spektrometresi tesisi Région, Institut Paoli-Calmettes ve Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille.

1. 6His-Bayrak-Ubl ifade kararlı hücre hatları nesil
NOT: HEK-293T hücrelerinin pCCL-6HF-Ubl, pVSVG ve delta-Helper ile birlikte transfeksiyonu.
<ol><li>0. Gün: Tohum 293T hücreleri 6-iyi plaka elde etmek için 50-70% ertesi gün biraraya.</li>
	<li>1. Gün: Lentivirüs üretimi için transfeksiyon reaktifi ve protokolü kullanarak 1 μg pCCL-6HF-Ubl veya pCCL-GFP, 1 μg pVSVG ve 1 μg delta-Helper vektörleri karışımı ile co-transfectP-70 konfluent hücreler. Transfeksiyon 6 saat sonra, transekedilecek hücrelere karşılık gelen taze bir orta değiştirin. Bir gün sonra (transdüksiyonun başladığı gün) -20'lik bir kesişme elde etmek için 6 kuyuplakasına geçirilecek hücreleri tohumlayın.</li>
	<li>2. Gün: Transfeksiyondan 24 saat sonra, merceksi viral partiküller içeren ortamı geri alın ve 0,45 μm filtreler kullanarak filtre uygulayın. Gerekirse, lentiviruses ikinci bir parti üretmek için bu noktada taze orta ekleyin. Lentivirüsler içeren bir hücre transdüktör (-20) için orta değiştirin. NOT: Lentiviral ortam transdüksiyondan önce +4 °C'de birkaç gün tutulabilir veya -80 °C'de aylarca saklanabilir.</li>
	<li>Hücreleri standart bir kuluçka makinesinde (37 °C, %5 CO2)24 saat ile 72 saat arasında lentivirüslerle kuluçkaya yatırın ve sonra ortamı taze standart bir tüp olarak değiştirin. Mümkünse, transdüksiyonun verimliliğini değerlendirmek için ters floresan mikroskop kullanarak GFP ifadesini kontrol edin: hücre ifade yüzdesi ve hücre başına göreceli ifade düzeyi. Floresan saptanmazsa, ifadenin transdüktör hücre türüne bağlı olarak daha uzun sürmesi nedeniyle ek 2-3 gün bekleyin.</li>
	<li>GFP kontrolü pozitifse, anti-Flag antikor kullanarak immünoresans ve Batı leke tarafından 6HF-Ubl bir ifade kontrolü gerçekleştirmek için yeterli olana kadar tüm hücreleri büyümek.</li>
</ol>2. Modifiye proteinlerin çift saflaştırılması
NOT: Tampon 1: 6 M Guanidinium-HCl, 0.1 M Na2HPO4/NaH2PO4, pH 8.0, 0.5% Triton X-100. Tampon 2: 50 mM NaH2PO4,150 mM NaCl, 1% Tween20, 5% Gliserol, pH 8.0. Tampon 3: 100 mM NH4HCO3, pH 8.0.
<ol><li>Hücre lisisi: Hazır olduktan sonra kültür yemeklerini en az bir kez oda sıcaklığında fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve hücre lisise devam edin veya alternatif olarak sıvı N2'de flaş dondurulup -80 °C'de saklayın. Lysis için, RT'de 15 cm'lik bir tabağa 2 mL Tampon 1 ekleyin. 50 mL konik santrifüj tüplerinde (son hacim yaklaşık 20 mL) tüm lysatları kurtarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.</li>
	<li>Sonicate 30 s için üç kez lysate 1 dk duraklama ile ayrılmış.</li>
	<li>15 dk için 15.000 x g sonicated lysates santrifüj.</li>
	<li>Supernatant'ı bir hücre süzgeci (40 μm) kullanarak yeni bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Örneklerin konsantrasyonunu belirleyin ve gerekirse aynı miktarda protein ve aynı hacim elde etmek için ayarlayın. 50 ve 100 mg (MiaPaCa-2 hücreleri için 15 cm çapında 10 tabak) arasında toplam miktarda protein kullanın.</li>
	<li>Protein 1 mg başına boncuk 2 μL kullanarak, Ni2 +-NTA boncuk ekleyin.</li>
	<li>RT'de 2.5 saat boyunca 30 rpm'de döndürün.</li>
	<li>5 dk için 500 x g boncuk pelet.</li>
	<li>Boncukları 1 mL Tampon 1 ile yıkayın, numuneleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın, ardından tüpleri buzüzerinde aktarın. Sonraki tüm adımları buzda veya 4 °C'de gerçekleştirin.</li>
	<li>10 mM imidazol içeren 1 mL buz gibi Tampon 2 ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Bağlı proteinleri eleştirmek için, 250 mM imidazol içeren 600 μL Tampon 2 ekleyin ve 4 °C'de 2 saat döndürün.</li>
	<li>1 dk. Süpernatantları yeni, önceden soğutulmuş, 1,5 mL tüplere aktarın ve 50 μL anti-Flag M2 antikor konjuge boncuk ekleyin.</li>
	<li>4 °C'de 2,5 saat boyunca 30 rpm'de döndürün, ardından 500 μL Tampon 2 ile 2 kez, 500 μL Tampon 3 ile 2 kez yıkayın.</li>
	<li>Son elüsyon için, 0,1 g/μL'de bayrak peptidiçeren 100 μL Tampon 3 ekleyin ve 4 °C'de 1,5 saat döndürün.</li>
	<li>1 dk için 500 x g'da santrifüj edin ve süpernatantları yeni önceden soğutulmuş tüplere aktarın.</li>
	<li></ol> <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg"> <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg"> <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg"> <img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg"><ol><li> </li><li> </li><li> <var></var></li><li> </li><li><img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/60402/60402eq1.jpg"> </li></ol>

<ol><li>Prabakaran, S., Lippens, G., Steen, H., Gunawardena, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modification%3A+Nature%27s+escape+from+genetic+imprisonment+and+the+basis+for+dynamic+information+encoding%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Systems+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Post-translational modification: Nature's escape from genetic imprisonment and the basis for dynamic information encoding.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2012).</li>
<li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+function+of+ubiquitin-like+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Origin and function of ubiquitin-like proteins.</a> Nature. 458 (7237), 422-429 (2009).</li>
<li>Kirkpatrick, D. S., Weldon, S. F., Tsaprailis, G., Liebler, D. C., Gandolfi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+identification+of+ubiquitinated+proteins+from+human+cells+expressing+His-tagged+ubiquitin%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic identification of ubiquitinated proteins from human cells expressing His-tagged ubiquitin.</a> Proteomics. 5 (8), 2104-2111 (2005).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+approach+to+understanding+protein+ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A proteomics approach to understanding protein ubiquitination.</a> Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).</li>
<li>Matsumoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+the+human+ubiquitin-related+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of the human ubiquitin-related proteome.</a> Proteomics. 5 (16), 4145-4151 (2005).</li>
<li>Hjerpe, R., Rodríguez, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+approaches+for+characterizing+ubiquitinated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Efficient approaches for characterizing ubiquitinated proteins.</a> Biochemical Society Transactions. 36 (5), 823-827 (2008).</li>
<li>Bonacci, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+new+mechanisms+of+cellular+response+to+chemotherapy+by+tracking+changes+in+post-translational+modifications+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of new mechanisms of cellular response to chemotherapy by tracking changes in post-translational modifications by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Journal of Proteome Research. 13 (5), 2478-2494 (2014).</li>
<li>Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin-like+protein+conjugation+and+the+ubiquitin-proteasome+system+as+drug+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (1), 29-46 (2011).</li>
<li>Hoeller, D., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+ubiquitin+system+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting the ubiquitin system in cancer therapy.</a> Nature. 458 (7237), 438-444 (2009).</li>
<li>Silva, J. C., Gorenstein, M. V., Li, G. Z. Z., Vissers, J. P. C., Geromanos, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+proteins+by+LCMSE%3A+a+virtue+of+parallel+MS+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition.</a> Molecular & Cellular Proteomics. , (2006).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+assessment+of+the+ubiquitin-modified+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome.</a> Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Biz ana ubikitin aile üyeleri tarafından modifiye protein profilleri oluşturmak için sağlam ve güvenilir bir metodoloji geliştirdik. Nitekim, biz başarıyla ubiquitin tarafından PTMs profilleri oluşturmak için bu protokolü uyguladık, ve ayrıca SUMO ve Nedd8 tarafından, ve bir tedavi ile ilişkili değişiklikleri tespit etmekiçin 7, belirli bir genin aşırı ifade veya nakavt yanıt olarak (veri değil gösterilen) ve çeşitli kemoterapötik ilaçlara dirençli fenotip edinilen hücrelerde.
<p class="jove_c...

Burada önerilen yöntem, belirli bir durumla ilişkili potansiyel değişiklikleri (tedavi, farklılaşma, vb.) belirlemek için kültürlü memeli hücrelerinden ubikitin aile üyeleri tarafından aracılık edilen PtM'leri incelemek için ayrılmıştır. Ptm'ler proteinlerin fonksiyonlarının düzenlenmesinin son adımını temsil eder1. Nitekim, bir kez çeviri makineleri tarafından üretilen, çoğu değilse tüm proteinler kendi aktivitesini modüle PTM'ler farklı türde uğrar, moleküler etkileşimleri, ve hücre içi konumu1. PtM bolluk arasında proteinlerin ubiquitin ailesi tarafından aracılık olanlar, ubiquitin kendisi ve tüm ubikitin benzeri, tüm hücre içi veya kısmen sitoplazmik proteinleri düzenlemek için potansiyele sahip2. Kendileri protein oldukları için, her biri belirli düzenleyici işlevlerle ilişkili homojen ve heterojen çeşitli topolojilerin homojen ve heterojen zincirlerini oluşturarak birbirlerine konjuge edilebilirler2. Bu karmaşık makineyi çözmek ve anlamak için araçlara ihtiyaç vardır. Birçok yaklaşımlar dünya çapında, kendi avantajları ve dezavantajları olan geliştirilmiştir ve burada kültürlü hücreler için uygun yüksek performanslı bir öneriyoruz.
Bu yöntemin en büyük avantajı doğruluğudur. Nitekim, izole modifiye proteinlerin saflığı son derece iki etiket (6His ve Bayrak) ve iki adım prosedürü kombinatoryal kullanımı ile geliştirilmiş ve bu nedenle tek bir etiket füzyon ub / Ubl3çok daha seçici olduğunu,4. 6His etiketinin varlığı, tamamen inkar eden bir durumda arınmanın ilk adımını sağlar ve böylelikle ubikitin bağlayıcı etki alanları veya her yerde bulunanlara bağlanan diğer proteinler içeren proteinlerin birlikte saflaştırılmasından kaçınır. Bu teknik bir sorun ya spesifik antikorlar5 veya tandem ubiquitin bağlayıcı elemanları (TUBEs)6kullanarak ubiquitinated proteomların yakınlık saflaştırma dayalı birçok diğer yaklaşımlar tarafından karşılaşılan bir teknik sorundur . Daha da önemlisi, bu teknik her yerde belirli bir tür arınma lehine önyargılı değildir, bu bazı diğer yaklaşımlar için durum olabilir gibi, poliubiquitinations hem mono ve farklı türde tespit edildi beri7. Sonuç olarak, bir kez bulundu, ubiquitination bir değişiklik ilgili her yerde tam türünü belirlemek için standart biyokimyasal yaklaşımlar tarafından daha ayrıntılı olarak incelenmesi gerekecektir.
Son olarak, bu protokolün bir diğer teknik avantajı, normal hücresel davranışa müdahale etmeden etiketli değiştiriciifadelerinin makul düzeyde olan kararlı ifade hücre çizgileri oluşturan lentivirüslerin kullanımıdır.
Ubikitinasyonun önemli bir rolü proteazomal bozulma için proteinleri hedeflemek ise, şimdi potansiyel olarak en hücre içi veya kısmen hücre içi proteinler için birçok düzenleyici özelliklere sahip olduğu bilinmektedir1. Bu fonksiyonların sayısı daha proteinler gibi birçok ubiquitin varlığı ile artar, proteinlerin hemen hemen her hücre mekanizması nı düzenleyen bir aile oluşturan1. Onların değişiklikler hücre biyolojisi üzerinde köklü etkisi olabilir ve yol açabilir veya patolojikdurumlarakatılabilir 8 , kanser gibi9. Bu nedenle, araçlar bu geniş manzara keşfetmek ve yeni terapötik hedefler olarak hizmet verebilir patolojik bir durum ile ilişkili değişiklikleri belirlemek için gereklidir.
Bu protokol, ub/Ubl etiketli eksojeni ifade etmek için transeksedilmesi gerektiğinden kültürdeki hücrelere adanmıştır. Oluşturulduktan sonra, bu kararlı hücre çizgileri 2D veya 3D veya ksenogreft kültüründen Ubl profilleri oluşturmak için kullanılabilir, böylelikle PTM profilleri çalışmak için uygulanabilir farklı deneysel modellerin ufkunu genişleterek.

<table><tbody><tr><td>ANTI-FLAG M2 Afinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220-5ML</td>, tüm <td>Bayrak etiketli proteinleri</td></tr><tr><td>bağlar anti-Flag M2 antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3165</td>, <td>ub / ubl Hücre süzgeci 40 ve mikro'nun 6His-Flag etiketli ifadesini tespit etmek için</td></tr><tr><td>; m</td><td>Falcon</td><td>352350</td>, <td>guanidin parçalanmış hücrelerden yüzen peleti çıkarmak için</td></tr><tr><td>Bayrak peptidi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3290</td><td>elute bayrağı, bayrak önleyici boncuklardan</td></tr> proteinler <tr><td>etiketli proteinler Guanidin hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50933</td>, <td>hücre lizatındaki tüm proteinleri denatüre etmek için kullanılan kaotropik ajan</td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td>, <td>Ni-NTA boncuklarından 6His bağ proteinlerini nülüe eder</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>ThermoFisher</td><td>L3000015</td>, <td>lentivirüsler üretmek için HEK-293T hücrelerini transfekte etmek için</td></tr><tr><td>Lobind tüpleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666491</td><td>değerli malzemenin emilimini önler</td></tr><tr><td>Membran Filtre, 0.45 & m</td><td>Millipore</td><td>,</td> 6His <td>etiketinin lentiviral süpernantant</td></tr><tr><td>Ni-NTA</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>saflaştırılmasını filtrelemek için HAWP04700F1</td></tr></tbody></table>

ubiquitin ve ubiquitin benzeri bağımlı post-translational modifikasyonlar ve Önemli değişikliklerin belirlenmesi profilleme

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Proteinlerin ubikitin (ub) ve ubiquitin benzeri (ubl) bağımlı post-translational modifikasyonları protein stabilitesini, aktivitesini, etkileşimlerini ve hücre içi lokalizasyonunu kontrol ederek hücre içinde temel biyolojik düzenleyici rolleri oynar. Hücrenin sinyallere yanıt vermesine ve çevredeki değişikliklere uyum sağlamasına olanak sağlar. Bu mekanizmalar içinde değişiklikler nörodejeneratif hastalıklar ve kanserler gibi ciddi patolojik durumlara yol açabilir. Burada açıklanan tekniğin amacı, kültürlü hücre çizgilerinden ub/ubls bağımlı PTM profillerinin hızlı ve doğru bir şekilde oluşturulmasıdır. Farklı koşullardan elde edilen farklı profillerin karşılaştırılması, örneğin bir tedavi tarafından indüklenenler gibi belirli değişikliklerin tanımlanmasına olanak tanır. Lentiviral aracılı hücre transdüksiyonu, değiştiricinin (ubiquitin veya SUMO1 veya Nedd8 gibi bir ubl) iki tag (6His ve Bayrak) sürümünü ifade eden kararlı hücre çizgileri oluşturmak için gerçekleştirilir. Bu etiketler her yerde saflaştırma ve bu nedenle hücrelerden her yerde proteinlerin izin verir. Bu iki aşamalı bir arınma işlemi ile yapılır: İlki 6His etiketi kullanılarak denatüre koşullarında gerçekleştirilir ve ikincisi bayrak etiketi kullanılarak yerel koşullarda gerçekleştirilir. Bu, daha sonra sıvı kromatografi spektrografi ve tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) teknolojisi ile tanımlanan ve yarı-nicelleştirilmiş modifiye proteinlerin son derece spesifik ve saf izolasyonuna yol açar. Excel yazılımını kullanarak MS verilerinin kolay enformatik analizi, arka plan sinyallerini ortadan kaldırarak PTM profillerinin oluşturulmasını sağlar. Bu profiller, standart biyokimya teknikleri ile doğrulanmalarından başlayarak, daha spesifik olarak incelenecek belirli değişiklikleri belirlemek için her durum arasında karşılaştırılır.

GFP ve 6HF-Ub ifade hücreleri oluşturmak için kültür memeli hücrelerinin transdüksiyon Daha sonra MiaPaCa-2 hücrelerini nakletmek için kullanılacak lentivirüsler üretmek için, 70% confluent HEK-293T hücreleri üç vektör, pCCL-6HF-Ubiquitin veya GFP / Delta-Helper / pvSvG eşit miktarda transfected vardır. 24 saat üretimden sonra merceksi viral partiküller içeren ortam geri kazanılır ve süzülür. Bu noktada transfeksiyonun verimliliğini, ters bir mikroskop üzerinde 293T hü...

Bu protokol, bu tür çeviri sonrası modifikasyonların (PtM'ler) bir tedavi veya fenotip gibi belirli bir durumla ilişkili değişikliklerini belirlemek için ubiquitin (Ub) ve ubiquitin benzeri (Ubls) spesifik proteomların oluşturulmasını amaçlamaktadır.

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Bu protokol, spesifik tanımlanmış proteinleri tanımlayarak ve yarı nicelleştirerek ubiquitin ve ubiquitin benzeri post-translational modifikasyonların profillerini oluşturmanın kolay bir yoludur. Bu tekniğin en büyük avantajı, lentivirüslerin bir hafta içinde kararlı bir ifade hücresi hattı oluşturmak için kullanılması ve proteinleri özel olarak arındırmak için iki etiket in kullanılmasıdır. Aslında, bu tür post-çevirisel değişiklikler çoğu biyolojik fonksiyonlarda yer alır ve bu mekanizmanın değişiklikleri çoğu hastalıkta bulunur.Bu nedenle, bu değişikliklerin belirlenmesi prognostik ve/veya tanı ve tabii ki moleküler hedefler olarak kullanılabilir. Ubiquitin ökaryotik hücrelerde en korunmuş protein biridir ve bu onların hayatta kalmak için gerekli. Bu nedenle, bu tür bir yöntem memelilerden mayaya kadar her ökaryotik modele uygulanabilir.Ancak, bizim lentiviral sistem hücrelerin çalışma ile sınırlıdır. Tüm işlem bazen uzun kuluçka süresi ile oldukça uzun olduğundan, bir yerine iki gün içinde bunu yapmak mümkündür. Nikel boncuklardan elde edilen ler eksi 20'de ve Bayrak boncuklarını eklemeden önce dondurulabilir.Bu protokol, arınmanın nihai başarısını garanti altına almak ve böylece çeviri sonrası modifikasyon profilinin doğru kurulmasını garanti etmek için aralarında bazılarının kritik olduğu birçok adım içerir. Prosedürün gösterilmesi mirna Swayden ve Aurelie Dobric, laboratuvar iki doktora öğrencileri tarafından yapılacaktır. Başlamak için, tohuma% 10 FBS ile DMEM kuyusu başına iki mililitre ile altı iyi bir plaka HEK 293T hücrelerinin altıncı 0,5 kez 10 ekleyin ve 37 derece santigrat, % 5 karbondioksit ve% 100 nem kuluçka.Ertesi gün, 50-70% biraraya elde edilir. Kolör hücreleri pCCL-6HF ubiquitin benzeri veya pCCL-GFP bir mikrogram, PBS VG bir mikrogram ve lentivirus üretimi için bir transfeksiyon reaktifi ve protokol kullanarak delta yardımcı vektörlerin bir mikrogram karışımı ile hücreleri. Altı saatlik transfeksiyondan sonra, ortamı, transekedilecek hücrelerin ortamına karşılık gelen yeni bir ortama dönüştürün.%10-20'lik bir gün birleşimini elde etmek için, standart kültür ortamları ile altı kuyulu bir plaka içinde geçirilecek hücreleri tohumlayın. Transfeksiyondan 24 saat sonra, merceksi viral partiküller içeren ortamı geri alın ve 0,45 mikronfiltre kullanarak filtre uygulayın. Lentivirüsler içeren filtrelenmiş ortam tarafından transe edilecek hücrelerin orta sını değiştirin.Hücreleri 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le bir kuluçka makinesinde 24 ila 72 saat boyunca lentivirüslerle kuluçkaya yatırın ve sonra ortamı taze, standart bir maddeyle değiştirin. Transdüksiyonun verimliliğini değerlendirmek için ters floresan mikroskop kullanarak GFP ifadesini kontrol edin. Floresan algılanmamışsa, iki ila üç gün daha bekleyin.GFP kontrolü yeşil floresan ile pozitif ise, burada gösterildiği gibi, immünofloresan tarafından 6-His-FLAG ubiquitin gibi bir ifade kontrolü gerçekleştirmek için yeterli olana kadar tüm hücreleri büyümek, ve batı leke anti-FLAG antikor kullanarak. Hücreleri 15 santimetrelik tabaklarda büyüttükten sonra, kültür yemeklerini en az bir kez oda sıcaklığında fosfat tamponlu tuzlu ile yıkayın. Hücre lisis başlamak için, oda sıcaklığında her 15 santimetrelik çanak içine tampon bir iki mililitre ekleyin.50 mililitrelik konik santrifüj tüpler içine tüm lysates kurtarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. 30 saniye boyunca üç kez listates sonicate, bir dakikalık bir duraklama ile ayrılmış. 15 dakika boyunca 15, 000 kez g sonicated lysates santrifüj.Süpernatantı 40 mikronluk bir süzgeçle yeni bir tüpe aktarın. Sonication ve santrifüj den sonra lysates filtre lemek çok önemlidir. Bunu yapmamak birçok spesifik olmayan proteinin saflaştırılmasına neden olabilir, böylece arka planı artırabilir ve PTM profilinin boyutunu güçlü bir şekilde azaltabilir.50 ile 100 miligram arasında eşit miktarda proteini yeni Falcon tüplerine aktarın. Protein bir miligram başına boncuk iki mikrolitre miktarı ile her tüp içine nikel iyon NTA boncuk ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında 2,5 saat boyunca 30 rpm'de döndürmek için bir rotator üzerine yerleştirin.Sonra boncukları 5dakika boyunca 500 kez g'ye alın. Boncukları bir mililitre tampon tüple yıkayın ve numuneleri 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpü buza yerleştirin.On milimolar imidazol içeren bir mililitre buz gibi tampon iki ile iki kez yıkayın. Elute bağlı proteinler için, tampon iki 250 milimolar imidazol içeren 600 mikrolitre ekleyin ve dört santigrat derece iki saat döndürün. Bir dakika için 500 kez g santrifüj ile boncuk peletleme sonra, yeni bir önceden soğutulmuş 1.5 mililitretüp supernatant aktarın ve anti-FLAG M2 antikor konjuge boncuk 50 mikrolitre ekleyin.4 santigrat derecede 2,5 saat boyunca 30 rpm'de döndürün. Sonra tampon iki 500 mikrolitre ile iki kez yıkayın, sonra tampon üç 500 mikrolitre ile iki kez. Son elüsyon için, mikrolitre başına 0,01 mikrogram da FLAG peptid içeren tampon üç 100 mikrolitre ekleyin ve 1 1/2 saat boyunca dört santigrat derecede döndürün.Bir dakika için 500 kez g santrifüj sonra, yeni bir önceden soğutulmuş tüp için supernatant aktarın. SDS-PAGE'e yüklemek için 10 mikrolitre alın ve arıtma kalitesini kontrol etmek için jelin gümüş boyamasını gerçekleştirin. Arınma iyi görünüyorsa, LC-MS tarafından bırakılan %90'ı analiz edin.Normalleştirme gerçekleştirmek için, ubiquitin ve GFP için ilaç tedavi hücreleri ve tedavi edilmemiş hücreler arasındaki değerleri normalleştirmek için formülleri kullanın. Arka planı kaldırmak için, her iki durumda da tanımlanan her protein için belirli değerler elde etmek için, kontrol numunesi GFP değerlerini ubikitin örneklemlerinde değerlerden çıkarın. Her yerde bulunan varyasyonu elde etmek için, bir ilaç tarafından indüklenen PtM'lerin pozitif ve negatif varyasyonları için eksi 100 ile artı 100 arasında bir puan alın.İşlenen ve işlenmemiş örneklerin belirli değerleri arasındaki fark, kontroldekiler de dahil olmak üzere tüm değerlerin toplamına bölünür ve 100 ile çarpılır. PTM'nin baskıyı temsil eden eksi 50'nin altındaki veya PTM'nin indüksiyonuna neden olan 50'nin üzerindeki varyasyonlar anlamlı kabul edilir. 50'nin üzerindeki sıfır ve %100 değerleri arasında bir güven değeri elde etmek için bu formülü kullanın genellikle emin olarak kabul edilir.İndüksiyon ve bastırma değerlerinin daha güzel bir dağılımını elde etmek ve hem varyasyon hem de güven parametrelerini göz önünde bulundurmak için varyans ve güven değerlerini çarpmak için bu formülü kullanın. Bu çalışmada, kültür memeli hücrelerinin transdüksiyonu GFP ve 6-histidin FLAG ubiquitin ifade hücreleri oluşturmak için elde edilmiştir. Lentiviral transdüksiyonun etkinliği ilk olarak GFP'ye bağlı hücrelerin GFP floresansı inceleyerek kontrol edildi.FLAG-ubikitin ekspresyonu, transekte hücrelerin yüzdesini gösteren bir anti-FLAG antikor kullanılarak immünoresans boyama ile yapıldı. Eksojen FLAG-ubiquitin ekspresyon düzeyini kontrol etmek için transeksed hücrelerden lysates SDS-PAGE tarafından analiz edildi ve ardından anti-FLAG antikorlu batı lekesi incelendi. Her yerde bulunan proteinlerin saflaştırılmasından sonra, son elüsyonun %10'u SDS-PAGE ve jelin gümüş boyama sıyrıklarının miktarını ve bütünlüğünü kontrol etmek için kullanılmıştır.Arka plan GFP örnek çıkarma tespit 364 proteinler önemli ölçüde üzerinde bir skor ile her yerde 50%A gen seti zenginleştirme analizi bu ubikitinated proteinlerin dahil oldukları biyolojik süreçleri vurgulamak için yapılmıştır. Her yerde gemsitaten indüklenen değişikliklerden oluşan potansiyel etkileşim ağları. Bu, ilgili proteinlerin artmış veya azalmış her yerde bulunan etkilerinden güçlü bir şekilde etkilenen işlevsel etkileşim ağlarının tanımlanmasına yol açmıştır.Ayrıca gemsitain tedavisinden sonra PCNA'nın her yerde arttığı doğrulandı. Her iki elution adımından sonra bazı boncukların aktarılmasını önlemek çok önemlidir, çünkü arka planda önemli bir artışa neden olabilir. Bu yordam, farklı koşulları karşılaştırarak, belirli değişikliklerin tanımlanmasını sağlayacak belirli çeviri sonrası değişiklikler üretecektir.İlk sonraki adım biyokimyasal yaklaşımlara dayalı ilgi değişiklikleri en azından doğrulamak olacaktır. Biz pankreas kanseri hücrelerinin yeni yolları ve mekanizmaları belirlemek için ubiquitin tabanlı, post-çevirisel değişiklikler keşfetmek için bu yöntemi geliştirdi. Bu protokol ve dünya çapında geliştirilen diğer yana farklı biyolojik süreçleri deşifre etmek için başarıyla istihdam edilmiştir.Lentivirüsler en azından BL-2 laboratuvarında kullanılmalıdır. Guanidin güçlü bir denaturing ajanıdır ve dikkatli kullanılmalıdır. Sonicator da kulaklar için zararlı olabilir ve aşağıdaki öneriler in kullanılması gerekir.

profiling-ubiquitin-ubiquitin-like-dependent-post-translational

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Ubikitinasyon üç enzimlerin kümesi tarafından yürütülen bir anahtar posttranslasyonel modifikasyonu. Bu değişiklik ilgili genler Mutasyonlar birçok farklı insan hastalıkları ile ilişkilidir. Burada, kültür hücrelerinde protein ubikuitinasyon tespit protokolleri...

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Geçerli protokol işlevsel homolog deubiquitinating enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem göstermektedir. Uzman problar kovalent enzim değiştirme ve saptama için izin verir. Bu yöntem, yeni tedavi hedefleri tespit etmek potansiyele sahiptir.

Hücre Kuşakları ve Doku Örneklerinde Deubiquitinating Enzim aktivitesinin ölçülmesi için bir yöntem

Birden çok araştıran, endojen translasyonel modifikasyonlar hedef protein için son derece zor olabilir. Burada açıklanan teknikleri belirli PTM hedeflemede, benzeşim matrisler bir hedef için asetilasyon, ubiquitination, SUMOylation 2/3 ve tirozin fosforilasyon değişiklikleri algılamak için geliştirilen bir en iyi duruma getirilmiş lizis tampon ve filtre sistemi kullanmak protein tek ve akıcı bir sistem kullanarak.

Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan

Kompleks biyolojik örneklerden her yerde bulunan proteinlerden kaynaklanan diGly peptidlerin arıtılmı, saptanması ve tanımlanması için bir yöntem salıyoruz. Sunulan yöntem çoğaltılabilir, sağlam ve ubiquitinome analizinin derinliği düzeyine göre yayınlanmış yöntemleri geride bırakır.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

Ubiquitination hücresel süreçlerde önemli roller oynar ve sıkıca deubiquitination tarafından koordine edilen bir post-translational modifikasyon olduğunu. Her iki reaksiyon kusurları insan patolojileri altında yatan. Biz arıtılmış bileşenleri kullanarak in vitro mayası ve deubiquitination reaksiyonu yürütmek için protokoller sunuyoruz.

Nükliosomal Histones in vitro Ubiquitination ve Deubiquitination bulguları

Bu yöntem, ubiquitin zincir topolojislerindeki küresel değişikliklerin değerlendirilmesini açıklar. Değerlendirme, kütle spektrometresi tabanlı hedefli proteomik yaklaşımın uygulanmasıyla gerçekleştirilir.

Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi

Bu iş akışı, nicel küresel proteomik analiz için aynı anda birden fazla protein çeviri sonrası modifikasyonun (PtM) zaman ve maliyet-etkin zenginleşmesinin performansını açıklar. Protokol, ptm çapraz konuşmasına biyolojik kavrayışlar kazandırmak için birden fazla konjuge antikorla peptid düzeyinde PTM zenginleştirme, ardından da veri bağımsız iktisap kütle spektrometresi analizini kullanmaktadır.

Niceleme ve Site Yerelleştirmesi Için İki Çeviri Sonrası Modifikasyonun Eşzamanlı Affinity Zenginleştirmesi

Memeli hücrelerinde belirli bir substratın ubikitilasyon testi ve bir E3 ubikitin-ligazının ubikitilasyon testi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. HEK293T hücre hatları protein aşırı ekspresyonu için kullanıldı, poliubikitillenmiş substrat immünopresipitasyon ile hücre lizatlarından arındırıldı ve SDS-PAGE'de çözüldü. Bu post-translasyonel modifikasyonu görselleştirmek için immünoblotlama kullanıldı.

Memeli Hücre Lisatlarında E3 Ubikitin-ligaz ile Substrat Ubikitilasyonunun Değerlendirilmesi

Mevcut protokol, topoizomeraz inhibitörleri ve formaldehit tarafından indüklenen ubikitilasyon, SUMOylation ve ADP-ribozilasyon dahil olmak üzere DNA-protein çapraz bağlarını (DPC'ler) ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını (PTM'ler) tespit etmek ve ölçmek için değiştirilmiş bir yöntemi vurgulamaktadır, böylece DPC'lerin ve PTM'lerinin oluşumu ve onarımının incelenmesine izin verir.

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

Burada kullanılan deney, geleneksel Çin tıbbının küçük molekülleri ile protein hedefleri arasındaki etkileşimi tahmin etmek ve doğrulamak için prob teknolojileriyle birleştirilmiş bir moleküler yerleştirme yöntemini göstermektedir.

Moleküler Yerleştirme ve Deubikitinasyon Enzim Probu Teknolojisine Dayalı UCHL3 Aktivitesini İnhibe Etmek için Geleneksel Çin Tıbbı Bileşiklerinin Taranması

Ubiquitinasyon, hücre içi protein fonksiyonlarının kritik bir düzenleyicisidir. Burada, memeli hücrelerinde substrat protein ubiquitinasyon seviyelerini tespit etmek için iki hücre lizisi yöntemini tanımlıyor ve ubiquitinasyon seviyelerini analiz etme etkinliklerini karşılaştırıyoruz. HEK293T hücrede protein aşırı ekspresyonu, geçici transfeksiyonla indüklenmiş ve ubiquitinated proteinler western blot analiziyle tespit edilmiştir.

SMAD2/SMURF2 modeli kullanılarak memeli hücre lizatlarında ubiquitinasyon tespiti için karşılaştırmalı stratejiler

Öğrenin, ubiquitin ve ubiquitin benzeri post-translasyonel modifikasyon profillerini lentivirüs kullanarak nasıl oluşturulur. Bu yöntem, çift etiketli protein saflaştırma ile hastalıklarla ilişkili değişiklikleri belirlemeye yardımcı olur.

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Daha fazla video keşfet