İzole Caenorhabditis elegans Embriyo Blastomerler ve Yapıştırıcı Polistiren Boncuklar ile Mekansal Hücre Temas Desenleri In Vitro Reconstitution
26 Kasım 2019
Çok hücreli sistemlerin doku karmaşıklığı hücre dışı ipuçları ve bireysel hücresel davranışlar arasındaki nedensel ilişkinin belirlenmesini şaşırtmak. Burada, C. elegans embriyo blastomerleri ve yapışkan polistiren boncuklar kullanarak temasa bağlı ipuçları ve bölünme eksenleri arasındaki doğrudan bağlantıyı incelemek için bir yöntem sunuyoruz.
Çok hücreli dokular karmaşık, bu protokol basitleştirilmiş bir şekilde hücresel davranış yeniden oluşturur. Bir şey hücresel iletken proton ve hücresel yanıt arasındaki doğrudan ilişkileri incelemek için bu tekniktir. Bu protokol, hücresel iletken protonları yeniden oluşturmak için kimyasal olarak işlevsel polistiren boncuklar kullanır.
Boncuklar, hücresel yanıt üzerindeki etkilerini test etmek için herhangi bir ilgi proton ile kesilebilir. Bu yöntemi C-Elegance'da fare embriyolarında kullandık. Bu nedenle, bu protokol geniş organizmaların çalışmaları dik olabilir.
Embriyolar yüksek tam klorit tedavisinden sonra kırılgan olduğundan, blastomeri başarılı bir şekilde izole etmeden önce önemli bir uygulama gerekir. Görsel gösteri, blastomer izolasyon yöntemleri sırasında kılcal damarlarınasıl ele alınmalıdır daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. Başlamak için, 1.5 mili litrelik mikro santrifüj tüp karboksilit modifiye polistiren boncuk 10 miligram ağırlığında.
Yıkamak için tüp içine MES tampon bir mililitre ekleyin. Boncukları karıştırmak için tüpü girdap. Tezgah üstü santrifüj ile 2000XG'de tüpü 60 saniye döndürün.
Tamponu dikkatlice dışarı çıkararak süpernatant'ı dicard. Boncukları bir mililitre MES tamponuyla tekrar yıkayın. Yıkamadan sonra, yüzey karboksil gruplarını etkinleştirmek için tüpe 10 miligram EDAC içeren bir mililitre MES tamponu ekleyin.
Boncukları karıştırmak için tüpü girdap. Tüpü oda sıcaklığında 15 dakika döndürün ve kuluçkaya yatırın. 2000XG'de boncukları 60 saniye boyunca aşağı çevirin.
Tamponu dikkatlice dışarı çıkararak supernatant atın ve bir mili litre PBS ile yıkayın. Girdap boncukları karıştırmak ve PBS bir kez daha yıkamatekrar tüp. 0,65 mili-litre Rhodamine Red-X stok çözeltisi bir mili-litre, 10, 100, ve Rhodamine Red-X bin kat seyreltme serisi hazırlayın.
Pippette her seri seyreltme tüpü içine boncuk 20 mikro litre. Tüpleri oda sıcaklığında beş dakika döndürün ve kuluçkaya yatırın. Boncukları bir mili litre PBS ile iki kez yıkayın.
Yıkadıktan sonra, tüpler içine PBS bir mili-litre ekleyin ve altı hafta kadar dört derece santigrat onları saklayın. Canlı görüntüleme için kullanılan bir mikroskop altında boncuk floresan yoğunluğunu kontrol edin. Sağ ve sol el ile 10 mikro-litre kapasiteli bir mikro-kılcal her ucunu tutun.
Mikro kılcal damarı her iki ucuna doğru çekin ve kılcal damarın merkezini bir brülöre getirin ve iki elle çekilmiş kılcal damarlar yapın. Diseksiyon mikroskobu altında, forseps ile elle çekilen kılcal damarların uçlarını kırpın. Embriyo transferi ve yumurta kabuğu kaldırma için iki ucu açılış boyutları yaklaşık iki kez olun ve bir kez embriyo transferi ve yumurta kabuğu kaldırma için C-Elegance Embriyolar kısa erişim uzunluğu.
Çekilen kılcal damarı ağız borulama aletine takın. Pippette 45 mikro litre yumurta tuzu çözeltisi üzerine çok kuyulu bir slayt. 5-10 yetişkin C-Elegance'ı kuyunun üzerine yerleştirin.
Erken C-Elegance Embriyolar elde etmek için c-Elegance vücudunun sağ ve sol iki iğne konumlandırma ve birbirlerine geçmiş iğneler kaydırarak parçalara yetişkinler kesti. Pippette 45 mikro litre hipoklorit çözeltisi kuyunun yanında yumurta tuzu çözeltisi ve sonraki üç kuyuya Shelton's Growth Medium'un 45 mikro litrelik pippette. Bir hücre evresi ve erken iki hücreli evre embriyoları daha büyük boyutlu açıklık ile ağız pippette ile hipoklorit çözeltisine aktarın ve 40 ila 55 saniye bekleyin.
Shelton's Growth Medium ile sonraki üç kuyuya aktararak embriyoları yıkayın. İlk iki kuyunun her birinde bir ila iki saniye. Küçük boyutlu açılış ile elle çizilmiş kılcal kullanarak dikkatle yumurta kabuğu kaldırma için embriyo pippetting tekrarlayın.
Bundan sonra, sürekli iki hücreli embriyonik blastomerler ayırmak için elle çizilmiş kılcal ile pippette. Yumurta kabuğu çıkarıldıktan sonra, patlamayı önlemek için embriyoların aşağı yukarı borulama kuvvetini en aza indirin. Bir kapak tutucuüzerine bir coverslip yerleştirerek bir görüntüleme odası hazırlayın ve onu stabalize için coverslip kenarları bant.
Kapak tutucuyu çevirin ve hidrofobik kalemle kapak kaymasına bir daire çizin. Hidrofobik marker tarafından çizilen daire içinde Shelton's Büyüme Orta ekleyin ve daire içinde görüntüleme odasına izole blastomer aktarın. Şimdi, daha büyük bir açıklık ile elle çizilmiş kılcal kullanarak coverslip üzerine kimyasal olarak işlevsel boncuk küçük bir hacim dağıtmak.
Boncukizole blastomer eklemek kadar elle çizilmiş kılcal içine üfleyerek boncuk konumunu kontrol edin. Ortamın buharlaşmasını önlemek için kapağı monte edin ve ters mikroskop kullanarak canlı görüntüleme yapın. Bu çalışmada, boncuk floresan sinyal mili-litre Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester gfp miozin-2 ve M-cherihistone ifade transgenik suşu için 0.005 mikro-gram ile tedavi çok zayıftı.
Öte yandan, boncuklardan gelen floresan sinyal mili-litre Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester başına beş mikro gram ile tedavi çok güçlüydü. Rhodamine Red-X Succinimidyl Ester konsantrasyonu 0.5 mili-litre başına mikro gram bu özel transgenik suşu için en uygun oldu. Canlı görüntüleme sırasında iki centrozomun dikey olarak hizalandığı bir uçak tespit edildi.
Bu düzlemin artı veya eksi 90 derecelik açısına sahip düzlem mil düzlemidir. Sitokinez sonrası hücre/boncuk temas arabirimine göre mil yönünün açısı, her iki kız hücresinin de boncuka bağlı olduğunu gösterir ve her iki temas nişangahını da geçen bir çizgide temas yönü olarak kullanılmıştır. Bir embriyo ve yumurta kabuğu ağız pippette tarafından uygulanan bazı dış kuvvetlere nasıl tepki öğrenmek gerekir.
Teorik olarak, herhangi bir hücresel yanıt incelenebilir, örneğin, sülfat özellikleri hücreleri kültürve uzun vadede yapışkan boncuk ile temas tarafından incelenebilir. Bu teknik, temas bağımlı hücre bölünmesi oryantasyon mekanizmasını anlamak için kullanılmıştır. PTF filtre ağız pippette yoluyla hipoklorit çözeltisi dumanı teneffüs önlemek için kullanılmıştır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, C. elegans embriyo blastomerleri ve yapışkan polistiren boncukları kullanarak temasa bağlı ipuçları ile hücresel davranışlar arasındaki doğrudan bağlantıyı araştırmak için bir yöntem sunar. Protokol, hücresel tepkilere hücre dışı sinyallerin daha iyi anlaşılması için çok hücreli sistemlerin karmaşıklığını basitleştirir.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Gelişimsel Biyoloji
Arka Plan
- Çok hücreli dokular karmaşık etkileşimler gösterir.
- Hücresel tepkileri anlamak gelişimsel biyoloji için kritik öneme sahiptir.
- Temasa bağlı ipuçları hücresel davranışlarda önemli bir rol oynar.
- Hücresel davranışı yeniden oluşturmak bu etkileşimlerin incelenmesine yardımcı olabilir.
Çalışmanın Amacı
- Hücresel tepkileri hücre dışı ipuçlarına etkisini incelemek için bir yöntem kurmak.
- Hücresel ortamları yeniden oluşturmak için polistiren boncukları kullanmak.
- Bu yöntemi daha geniş biyolojik içgörüler için C. elegans embriyolarına uygulamak.
Kullanılan Yöntemler
- Kimyasal olarak fonksiyonel polistiren boncukların kullanımı.
- Hücresel davranışı basitleştirilmiş bir şekilde yeniden oluşturma.
- Yöntemin C. elegans embriyolarına uygulanması.
- Çeşitli ipuçların hücresel tepkiler üzerindeki etkilerinin test edilmesi.
Ana Sonuçlar
- Temasa bağlı ipuçlar ve hücresel davranışlar arasında doğrudan bir ilişki gösterildi.
- Polistiren boncukların hücresel tepkiler üzerindeki etkilerini incelemek için kullanımı doğrulandı.
- Bir dizi organizmaya uygulanabilir içgörüler sağlandı.
- Çok hücreli etkileşimlerin daha iyi anlaşılmasına yardımcı oldu.
Sonuçlar
- Yöntem, hücre dışı ipuçları hücresel davranışlarla etkili bir şekilde ilişkilendirir.
- Polistiren boncuklar bu tür çalışmalar için çok yönlü bir araçtır.
- Bu yaklaşım gelişimsel ve hücresel biyolojideki araştırmaları geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables direct interrogation of contact-dependent signaling in a controlled in vitro system, reducing confounding variables from multicellular complexity. By isolating blastomeres and using adhesive beads to define precise spatial contact patterns, researchers can establish causal links between extracellular cues and cellular responses such as division orientation. This supports mechanistic de-risking in early target validation by clarifying how physical microenvironmental inputs regulate cell fate decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Tests hypotheses about how specific cell-contact geometries influence division axis orientation and downstream fate specification.
- Operational Value: Provides a reductionist platform to deconvolute contact-mediated signaling from soluble factor effects.
- Predictive Value: Enables quantitative correlation of contact pattern parameters with cellular phenotypic outputs for target confidence assessment.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible cell-bead interfaces for consistent phenotypic readouts across experimental replicates.
- Scalability: Supports preparation of bead libraries with graded ligand densities to probe dose-dependent contact responses.
- Workflow Integration: Outputs such as spindle orientation angles or division symmetry serve as quantifiable endpoints for automated image-based screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Findings on contact-dependent division orientation inform models of tissue patterning defects relevant to congenital disorders.
- Translational Continuity: Establishes a bridge from in vitro contact mechanism discovery to in vivo validation in developing embryos.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from direct contact modulation versus secondary signaling cascades.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where understanding spatial regulation of cellular behavior informs target selection and lead optimization strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of how adhesive interface composition and geometry regulate mitotic spindle alignment.
- Screening: Enables assay standardization via fluorescently tagged beads and controlled contact geometry for reproducible phenotypic scoring.
- Analytics: Generates quantitative spatial readouts (e.g., division axis angle relative to contact plane) for comparative condition analysis.
- Translational Research: Links in vitro contact response data to in vivo spatial patterning outcomes in embryonic development.
- Enterprise Reuse: The bead functionalization and blastomere isolation workflow can be adapted to other model systems for cross-species target validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in attributing cellular responses to specific spatial contact cues.
- Operational Value: Delivers a robust, reproducible system for generating defined cell-contact microenvironments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by validating targets within physiologically relevant spatial contexts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on evidence of contact-dependent mechanism validity.
Implementation Considerations
- Expertise in microsurgical techniques for blastomere isolation and capillary handling.
- Access to fluorescence microscopy and microfluidic-compatible imaging chambers for live-cell analysis.
- Standardization of bead functionalization protocols (e.g., EDAC activation, Rhodamine labeling) across users and batches.
- Adaptation considerations for applying the method to non-nematode blastomeres or alternative adhesive substrates.
- Practical limitations include embryo fragility post-isolation and the need for optimization of bead concentration and ligand density per cell type.
