Name: Fare Mesane Tümörü Organoidlerinin Kültürü, Manipülasyonu ve Ortotopik Transplantasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Öğrenin fare mesane tümörü organoidlerinin kültürü, genetik manipülasyonu ve ortotopik transplantasyonu yöntemlerini. Bu protokol kanser biyolojisi ve tümör mikroçevresi araştırmaları için güçlü bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, Kore Ulusal Araştırma Vakfı'nın K.S.'ye verdiği hibelerle desteklenmiştir: NRF-2017R1A2B4006043, NRF-2017M3C7A1047875, NRF-2017R1A5A1015366, Yaratıcı Ekonomi Lider Teknoloji Geliştirme Programı (SF317001A), POSCO (2018Y060) ve BK21 Plus Araştırma Bursu.

Tüm prosedürler POSTECH Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi yönergeleri (IACUC numarası: POSTECH-2019-0055) tarafından onaylandı ve yürütüldü.
1. Mesane Tümörü Organoidlerinin Tüp Kültürü
<ol><li>Murin mesane tümöründen mesane tümörü organoidleri kurmak (Şekil 1A). NOT: BBN'ye bağlı fare mesane tümörleri oluşturma prosedürü Shin ve ark.'da özetlenmiştir.17.<ol><li>6 ay boyunca fare reklam libitum için karanlık bir şişede% 0.1 BBN içeren su sağlayın. BBN içeren suyu haftada 2 x değiştirin. NOT: 8-10 haftalıkken vücut ağırlığı yaklaşık 25 g olan bir C57BL/6 erkek fare kullanıldı. BBN içeren su, tek bir kafeste en fazla beş fareye verilebilir.</li>
		<li>6 ay sonra, karbondioksit teneffüs kullanarak fare ötenazi ve tüm mesane tümörü izole. 90 mm Petri kabına aktarın.</li>
		<li>Steril cerrahi makas kullanarak kanser olmayan parçaları ve nekrotik bölgeleri çıkarın ve mesane tümörü parçalarını soğuk 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile 2-3 kez yıkayın. Parçaları toplayın ve yeni bir 90 mm Petri kabına aktarın.</li>
		<li>10 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineeeesulfonic asit (HEPES) ile Dulbecco'nun modifiye edilmiş minimum esansiyel ortamının (DMEM) 1 mL'sini ekleyin.</li>
		<li>Sterilize jilet kullanarak tümör dokusunu mümkün olduğunca küçük parçalara (0.5-1 mm3)dolaştırın.</li>
		<li>10 mM HEPES, 250 μg/mL kollajenaz tip I, 250 μg/mL kollajenaz tip II ve 250 U/mL termolizin ile 9 mL DMEM ekleyin. Bir kuvözdeki orbital shaker üzerinde kıymalı tümör dokusunu 1,5-2 saat kuluçkaya yatırın (37 °C, %5 CO2) parçaları hücre süspansiyonuna ayrıştırın. Hücre süspansiyonuna 50 mL'lik bir tüp aktarın. NOT: Fareden alınan tümörün boyutu 1 cm3'tenbüyükse, termolizin miktarı 2 kat daha fazla ysa veya kuluçka süresini artırın.</li>
		<li>Tüpü 4 °C'de 5 dk 400 x g'de santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin.</li>
		<li>5 mL amonyum-klorür-potasyum (ACK) kullanarak kırmızı kan hücrelerini tedavi etmek için peleti yeniden askıya alın. Tüpü 3-5 dakika oda sıcaklığında (RT) kırmızı kan hücrelerinin tam olarak dolana kadar kuluçkaya yatırın. NOT: Kırmızı kan hücreleri gözlenmezise, lysing işlemini atlamayın.</li>
		<li>Tüpe 20 mL DMEM ekleyin. Tüpü 4 °C'de 5 dk 400 x g'de santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin.</li>
		<li>Peleti tek hücrelere ayırmak için 1 mL%0,25 Tripsin-EDTA ve 10 μM Y-27632 dihidroklorür (Y-27632) ile tekrar askıya alın. Tüpü 37 °C'lik su banyosunda 5 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: Tek hücrelere tam dissosyasyon onaylamak için bir mikroskop altında tümör gözlemleyin. Hücre parçaları devam ederse, pipet süspansiyon daha fazla.</li>
		<li>% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile 10 mL DMEM kullanarak tripsinnötral. Sindirilmemiş enkazı temizlemek için hücre süspansiyonuna 50 mL'lik yeni bir tüpüzerindeki 100 m hücreli süzgeçten süzün.</li>
		<li>Tüpü 4 °C'de 5 dk 400 x g'de santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin.</li>
		<li>150 μL buz gibi büyüme faktörü kullanarak 24 kuyuplakasını katlayınve 24 kuyu plakasını 30 dakika boyunca bir kuvöze (37 °C, %5 CO2)yerleştirin. NOT: Kullanmadan önce katılaşmayı önlemek için temel membran matrisini 4 °C'de eritin ve bakımını edin.</li>
		<li>1 mL DMEM kullanarak peleti yeniden askıya alın ve hemositometre kullanarak hücreleri sayın. 3-4 x 104 tümör hücrelerini buz üzerinde 1,5 mL'lik bir mikrotüpe aktarın.</li>
		<li>Mikrotüpü 4 °C'de 3 dk 400 x g'da santrifüj edin ve süpernatantı dikkatlice atın.</li>
		<li>500 μL önceden ısınmış organoid ortam(Tablo 1) ve 10 μM Y-27632 ile hücreleri yeniden askıya alın ve kaplanmış kuyuya aktarın. 24 kuyu plakasını bir kuvöze yerleştirin (37 °C, %5 CO2).</li>
		<li>Ekstra mesane tümör hücreleri 1,5 mL cryovials% 10 FBS,% 1 penisilin / streptomisin içeren DMEM 1 mL ile stoklanabilir ve% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile. Bir cryovial dondurma kabına yerleştirin ve -80 °C dondurucuya konteyner aktarın. Bir gece dondurucuda sakladıktan sonra, cryovials uzun süreli depolama için sıvı nitrojen içine aktarın.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış organoid ortamın 500 μL'sini kullanarak her 2 günde bir ortamı değiştirin (Şekil 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>Alt kültür mesane tümörü organoidleri. NOT: Mesane tümörü organoidlerinin çapı 100-150 μm'ye ulaştıklarında geçirilmesi önerilir.<ol>
<li>Tümör organoidleri ile 24 kuyu plaka organoid orta kollajenaz / dispase 500 μL ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı bodrum membran matris ve orta. 37 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatın ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpe toplayın. NOT: Bir mikroskop altında bodrum membran matris izole organoidler inceleyin. Organoidler bazal membran matrisinden ayrılmazlarsa, kuluçka süresini veya pipeti daha fazla artırın.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış DMEM 5 mL ekleyin, 400 x g'de tüpü 4 °C'de 3 dk santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış 1 mL tripsin-EDTA ve 10 μM Y-27632 kullanarak peleti yeniden askıya alın. 37 °C'lik su banyosunda 5 dk kuluçka. Hücreleri yukarı ve aşağı kuvvetle pipetlendirin ve %10 FBS ile 5 mL DMEM kullanarak tripsini nötralize edin.</li>
		<li>Tüpü 4 °C'de 3 dk 400 x g'da santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış organoid ortamın 1 mL'sini kullanarak peleti yeniden askıya alın ve tek tümör hücresi sayısını sayın.</li>
		<li>Adımları 1.1.14−1.1.18'i yineleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Lentivirus aracılı Transdüksiyon Kullanarak Mesane Tümörü Organoidlerinin Genetik Manipülasyonu (Şekil 2A)
<ol><li>GFP ifade lentiviral parçacıklar üretin.<ol>
<li>0. günde, hücre hattı kültür ortamında 10 cm hücre kültür plakası başına5-6 x 10 6 hücre yoğunluğunda hek 293T hücreleri (yani% 10 FBS ve% 1 penisilin/ streptomisin ile DMEM).</li>
		<li>1. günde, GFP içeren transfer plazmidi (8 g), lentiviral ambalaj plazmidi (10 μg pCMVR 8.74 ve pMD2.G 3 μg) ve 1 mL azaltılmış serum ortamı(Malzeme Tablosu)dahil olmak üzere DNA transfeksiyon çözeltisini hazırlayın.</li>
		<li>Üreticinin talimatlarına göre toplam plazmidin 1 μg'inde 3 μL transfeksiyon reaktifi(Malzeme Tablosu)ekleyin ve pipetleme ile hafifçe karıştırın. RT'de 20 dakika kuluçkaya yatve 9 mL DMEM ilave edin ve %10 FBS ile.</li>
		<li>HEK 293T hücreleri ile hücre kültürü plakasındaki kültür ortamını aspire edin. DNA transfeksiyon çözeltisinin 10 mL'sini HEK 293T hücrelerine dikkatlice aktarın ve 37 °C'de bir hücre kültürü kuluçka makinesine inkübedin.</li>
		<li>3. günde, transfeksiyon verimliliğini belirlemek için floresan mikroskobu (488 nm'de uyarma ve 512 nm'de emisyon) altındaki hücreleri gözlemleyin. Tüm hücre popülasyonundaki hücrelerin neredeyse %90-%100'ü GFP'yi ifade etmelidir.</li>
		<li>Supernatant toplamak (virüs içeren) ve 0.45 μm polyethersulfone (PES) filtre ile supernatant filtrrate. NOT: PES filtresi gibi düşük protein bağlayıcı bir filtre kullanın.</li>
		<li>Virüsü yoğunlaştırdık, 98.768 x g'de virüs supernatantını ultrasantrifüjde 4 °C'de 2 saat salıncak kova rotorunda(Malzeme Tablosu)santrifüj edin ve supernatant'ı dikkatlice atın.</li>
		<li>2,5 mL soğuk organoid ortamda peletrere resuspend.</li>
		<li>Uzun süreli depolama için, 250 μL'lik lentiviral ortam kriyojenik şişelere dönüştürülür ve sıvı nitrojen kullanarak onları tutturun. Dondurulmuş viral stokları -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mesane tümörü organoidlerinin lentivirus aracılı transdüksiyonunu gerçekleştirin.<ol>
<li>Gün 2, yukarıda açıklandığı gibi tümör organoidler bölünmüş (adım 1.2) 12 h lentivirus aracılı transdüksiyon önce.</li>
		<li>3. günde, 37 °C'lik su banyosunda virüs içeren bir aliquot'u (adım 2.9) hızlı bir şekilde eritin ve 10 μM Y-27632 ve 8 μg/mL hekaksimebromür içeren 250 μL organoid ortamı ekleyin.</li>
		<li>24 kuyu plakasındaki organoid ortamı tümör organoidleri ile değiştirin ve bir kuluçka makinesinde 12-16 saat (37 °C, %5 CO2)için 500°L virüs içeren orta ve inkübatör ekleyin.</li>
		<li>4. günde, 500 μL taze organoid ortam ile orta değiştirin. NOT: 12-16 saat inkübasyondan sonra, merceksivirüs ve heksadimethrine bromür içeren ortam sitotoksik olduğu için ortam değiştirilmelidir.</li>
		<li>6. günde, transdüksiyondan 3 gün sonra tümör organoidlerinden gelen GFP sinyalini floresan mikroskobu altında izleyin(Şekil 2B).</li>
		<li>10. günde, genetiği değiştirilmiş tümör organoid hatlarını korumak için, 1.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Mesane Organoidinin Ortotopik Transplantasyonu (Şekil 3A)
<ol><li>Mesane tümörü organoidlerini ortotopik transplantasyona hazırlayın.<ol>
<li>Transplantasyon dan önce mesane tümörü organoidlerini 5-7 gün boyunca kültüre ait olarak, yukarıda açıklandığı gibi (adım 1.2).</li>
		<li>Tümör organoidleri ile 24 iyi plaka organoid orta kollajenaz / dispase 500 μL ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı bodrum membran matris ve orta. 37 °C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpe toplayın.</li>
		<li>Önceden ısıtılmış DMEM 5 mL ekleyin, 400 x g'de tüpü 4 °C'de 3 dk santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin.</li>
		<li>1 mL DMEM ile peleti yeniden askıya alın ve çözeltiyi 90 mm Petri kabına aktarın.</li>
		<li>Mikroskop altında, bir p200 mikropipet kullanarak 10-100 tümör organoidleri almak ve buz üzerinde bir mikrotüp içine toplamak.</li>
		<li>Tüpü 4 °C'de 3 dk 400 x g'da santrifüj edin ve süpernatantı dikkatlice atın.</li>
		<li>Fareler ameliyata hazır olana kadar hücre peletini buzüzerinde saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Submukozal mesane duvarı nakli NOT: Bu yordam Fu ve ark18tarafından yayınlanan protokolden değiştirilmiştir.<ol>
<li>Yeni bir ortama alışmak için denemeden en az 1 hafta önce 8 ila 10 haftalık erkek çıplak fare (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl) hazırlayın. Enrofloksasin (5 mg/kg) deri altı 24 saat ameliyattan önce enjekte edin.</li>
		<li>Tezgah yüzeyini sabun ve suyla temizleyin. Cerrahi işlem öncesinde cerrahi aletleri otoklavve ve steril aletler kullanarak cerrahi gerçekleştirin.</li>
		<li>29 G insülin şırıngasını, pipet uçlarını ve bazzar matriksini buzüzerinde saklayın. Anestezi uygulanmadan önce ketoprofen (5 mg/kg) subkutan olarak uygulayın.</li>
		<li>Bir indüksiyon odasında% 4 izofluran ile fare anestezi. Genel anestezi sağlandıktan sonra fareyi bir supine pozisyonda yerleştirin ve %2 buharlaşmış izofluran maske teneffüs ederek anesteziyi koruyun. NOT: Anestezi süresi 30 dk'nın üzerindeyse, korneanın kurumasını önlemek için pamuklu bir bez kullanarak her iki göze de göz merhemi uygulayın.</li>
		<li>Steril bir gazlı bez ile povidon-iyot uygulayın ve% 70 etanol ile aşağı silin. Her seferinde yeni bir gazlı bez veya pamuklu bez ile 3x tekrarlayın.</li>
		<li>Tek kullanımlık, steril cerrahi perdeler kullanarak anüs ve cerrahi alanı kaplayın.</li>
		<li>Büyütme için bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, steril cerrahi makas ile deri ve alt orta hat karın kas duvarında küçük bir enine kesi (1,5 cm'den küçük) olun. Karın boşluğundan mesane maruz ve tuzlu batırılmış pamuk lu bezler ile destek. NOT: Mesane idrarla doluysa, hafifçe basıncı azaltmak için mesaneye hafifçe basın.</li>
		<li>Organoid peletlerin (adım 3.1.7) %50 yüksek konsantrasyonlu bazal membran matrisi içeren 80 μL organoid ortamda(Malzeme Tablosu)resuspend.</li>
		<li>Organoid süspansiyonu, 29 G insülin şırıngasını bir kesişme mikroskobu altında kullanarak mesane kubbesinin ön yönüne enjekte edin.</li>
		<li>Antibakteriyel emilebilir sütür ile karın duvarının iç tabakasını kapatın ve sonra 4-0 naylon sütür ile dış tabakakapatın. Cerrahi bölgeyi povison-iyot ve %70 etanol ile dezenfekte edin.</li>
		<li>Farenin kızılötesi ışınlayıcı 10-15 dk. Bilinci ve hareketliliği yeniden kazanana kadar fareyi izleyin.</li>
		<li>Ameliyattan bir gün sonra farenin genel durumunu ve anastomoz sızıntısını kontrol edin. Ketoprofen (5 mg/kg) ameliyat sonrası 3 gün boyunca günde bir kez uygulayın ve ameliyat sonrası 10 gün boyunca günde bir kez enrofloksasin (5 mg/kg) tedavi edin.</li>
		<li>Kesi bölgesi iyileştiğinde (ameliyattan 10-14 gün sonra), dikişleri çıkarın. Tümör organoid enjeksiyonundan sonra 2-3 hafta boyunca fare mesane tümörü büyümesini izleyin.</li>
		<li>Mesane tümörü büyüme gözlenirse, karbondioksit inhalasyon kullanarak fare ötenazi, ve tüm mesane tümörü hasat. Soğuk DPBS(Şekil 3B)16kullanarak yıkayın.</li>
		<li>Mesane tümörü histolojisini analiz etmek için hematoknin ve eozin (H ve E) boyama(Şekil 3B)16kullanarak dokunun parafin gömülü kısmını lekelemek.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Sanli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Bladder cancer.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17022(2017).</li>
<li>Stenzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+muscle-invasive+and+metastatic+bladder+cancer%3A+update+of+the+EAU+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22European+Urology%22%5BJournal%5D)">Treatment of muscle-invasive and metastatic bladder cancer: update of the EAU guidelines.</a> European Urology. 59 (6), 1009-1018 (2011).</li>
<li>Barretina, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cancer+Cell+Line+Encyclopedia+enables+predictive+modelling+of+anticancer+drug+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity.</a> Nature. 483 (7391), 603(2012).</li>
<li>Caponigro, G., Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+preclinical+testing+of+cancer+therapeutic+hypotheses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 179(2011).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407(2018).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246(2016).</li>
<li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+discovery%22%5BJournal%5D)">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-517 (2018).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ductal+pancreatic+cancer+modeling+and+drug+screening+using+human+pluripotent+stem+cell-and+patient-derived+tumor+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ductal pancreatic cancer modeling and drug screening using human pluripotent stem cell-and patient-derived tumor organoids.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1364(2015).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+liver+cancer%E2%80%93derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human primary liver cancer–derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424(2017).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+living+biobank+of+breast+cancer+organoids+captures+disease+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+mammalian+Hedgehog+signaling+to+the+stroma+determines+the+molecular+subtype+of+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of mammalian Hedgehog signaling to the stroma determines the molecular subtype of bladder cancer.</a> eLife. 8, 43024(2019).</li>
<li>Shin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origin+of+bladder+neoplasia+and+tissue+dynamics+of+its+progression+to+invasive+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular origin of bladder neoplasia and tissue dynamics of its progression to invasive carcinoma.</a> Nature Cell Biology. 16 (5), 469(2014).</li>
<li>Fu, C. L., Apelo, C. A., Torres, B., Thai, K. H., Hsieh, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bladder+wall+injection%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%29%22%5BJournal%5D)">Mouse bladder wall injection.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (53), e2523(2011).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.

Bu protokol, kanserojen kaynaklı murine mesane tümörlerinden elde edilen mesane tümörü organoidlerinin kültür ve bakımı için deneysel prosedürleri açıklamaktadır.
Bu protokolde, yordamların bazı sorun giderme gerekebileceği birkaç deneysel adım vardır. İlk olarak, başlangıçta tohumlanan tümör hücrelerinin sayısı kritik bir faktördür, çünkü kültürdeki tümör hücrelerinin sayısının azlığı (<2 x 104 hücre) çoğunlukla tümör hücreleri arasındaki etkileşimeksikliği nedeniyle hücre ölümüne yol açmaktadır. Buna karşılık, çok fazla hücre ile başlayan (>5 x 104 hücreleri) tohumlama aşırı kalabalık organoidler yol açar, her organoid kötü büyüme ile kültürleri işleme zorluk la sonuçlanır. Deneysel koşulları optimize etmek için başlangıçta farklı sayıda hücreye sahip birden fazla plakanın kurulması kuvvetle önerilmektedir. İlk tümör hücrelerinin doğru sayıda belirlenmesi ve en yüksek hücre canlılığı elde etmek ve başarılı mesane tümör organoidler kurmak için çok önemlidir. Ayrıca, passaging olmadan 2 hafta boyunca uzun vadeli kültürde, çoğu tümör organoidler büyümeyi durdurmak, potansiyel organoidlerin merkezinde besin yetersiz kaynağı ve bazal membran matris büyüme faktörü nün tükenmesi nedeniyle. Bu nedenle, zamanında organoidler subculturing tümör organoid kültürünü korumak için kritik bir adımdır.
İkinci olarak, yüksek titrekli lentiviral partiküllerin üretimi tümör organoidlerinin etkili genetik manipülasyonu için önemlidir. Virüs titretine bağlı sorunları gidermek için, lentiviral yapılar değişen verimlilikte viral parçacıklar üretme eğiliminde olduğu için virüs titrelerinin her seferinde viral transdüksiyondan önce belirlenmesi kuvvetle önerilmektedir. Tümör organoidleri viral enfeksiyon sonrasında düşük canlılık sergilerse, viral titrelerin potansiyel olarak çok yüksek olması muhtemeldir. Bu durumda daha düşük miktarda virüs kullanılması kuvvetle önerilmektedir. Üçüncü olarak, BBN'ye bağlı mesane tümörü organoidlerinin ortotopik nakli sırasında mesane duvarının bütünlüğünün korunması çok önemlidir. Enjeksiyonun mesane duvarı tabakasına girerek mesanenin lümenine ulaşması durumunda deney sonlandırılmalı ve atılmalıdır. Mümkünse ultrason görüntüleme sistemi ile mesane tümörü büyümesinin izlenmesi önerilir.
Mevcut tekniklerin bir sınırlama bu organoidlerde tümör mikroçevre veya stroma yokluğudur. Bu sorunun üstesinden gelmek için, tümör organoidlerinin ortotopik transplantasyonunun yerli tümör mikroçevresini taklit etmek için in vivo sistemi kullanması kuvvetle önerilmektedir. Gelecekte tümör stromasının diğer bileşenleri ile tümör organoidlerinden oluşan 3 Boyutlu in vitro organoid sistemlerin geliştirilmesi gerekecektir.
Tekniğimizin en önemli etkilerinden biri, tümör organoidlerinin ortotopik transplantasyonunda, sadece 10 mesane tümörü organoidinin mesanede tümör büyümesine neden olmasıdır. 5 x 105-1 x 106 tek mesane tümör hücresi gerektiren konvansiyonel tümör transplantasyonu deneylerine kıyasla yöntemlerimiz çok daha verimli ve sağlamdır. Bir diğer önemli fark ise, organoidlerin kısa saç tokası RNA, CRISPR-Cas9 sistemi veya ilgi genleri içeren lentiviral yapılar gibi çeşitli lentiviral vektörler kullanılarak çeşitli şekillerde manipüle edilebiliyor olmasıdır. Bu mevcut organoid teknoloji eklemek için güçlü araçlar olacaktır. Genel olarak, burada sunulan deneysel yaklaşımlar 2D mesane kanseri hücre hatları kullanarak yerine mesane kanseri patogenezanlayışımızı artırabilir in vitro tümör modellerinin kurulmasını kolaylaştırabilir.
Bu yöntem, kanserojen kaynaklı murin mesane tümöründen elde edilen mesane tümörü organoidlerini saptayabildi. Makale, genetik modifikasyonların uygulandığı ve mesane tümörü organoidlerinde stably olarak sürdürülen lentivirus aracılı deneysel prosedürlerin bir açıklamasını sunmaktadır. Buna ek olarak, tümör organoidlerinin ortotopik transplantasyonu için bir prosedür dahildir. Mevcut in vivo kanser modelleri ile birlikte, bu teknik mesane tümörigenezmoleküler temeli çalışma için yararlı bir araç olacaktır.

Mesane kanseri en yaygın idrar yolu kanseri, yaklaşık 165.000 hasta yılda ölüyor1. Mesane kanseri çeşitli türleri arasında, kas-invaziv ürotelyal karsinom agresif bir fenotip sergiler, ve 5 yıllık sağkalım oranı daha düşüktür 50%2. İnvaziv ürotelyal tümörler için yeni tedavi seçenekleri son birkaç on yıl içinde genişletilmedi1.
Kanser hücre hatları yaygın ilaç taraması için kullanılmıştır3. Kanser hücresi hatlarında çok sayıda ilaç adaylarında olumlu sonuçlar gözlenmiş olmasına rağmen, klinik çalışmalarda kötü sonuçlar bildirilmiştir4. In vitro iki boyutlu (2D) kültür ortamlarına adaptasyonun artmasının ardından, hücre hatlarındaki yerli tümörleri yeniden kapamak giderek zorlaşmak güçleşmiştir. Hayvan kanseri modelleri veya hasta kaynaklı tümör ksenogreftleri mesane kanseri hücre hatlarında gözlenen sınırlamaları gidermek için kullanılabilir. Ancak, hayvan kanseri modelleri zaman ve kaynak yoğun. Bu nedenle, geliştirilmiş hastalık modelleri yıllardır talep üzerine olmuştur ve yeni bir model sistemi, organoidler, mevcut modellerin eksiklikleri aşmak için geliştirilmiştir5.
Organoid, in vitro in vivo organının fizyolojik özelliklerini özetleyen çok hücreli bir 3D yapıdır. Normal ve tümör organoidleri pluripotent veya erişkin kök hücrelerden ve primer tümör hücrelerinden elde edilebilir, sırasıyla5,6. Son birkaç yıl içinde, tümör organoidler çeşitli tümör dokularının çok sayıda kurulmuştur7, kolondahil8 ,9, mesane10, pankreas11,12, prostat13, karaciğer14, ve meme15 tümör dokuları. Bu tür tümör organoidleri orijinal tümörlerini fenotipik ve genetik olarak taklit ederler. In vivo tümör dokularına olan benzerlikleri ve sayısız pratik uygulamaları nedeniyle, araştırmacılar kanser patogenezinin incelenmesinde yeni hastalık modelleri olarak benimsemişlerdir.
Burada kanserojen kaynaklı murine invaziv ürotelyal tümör den tümör organoidlerinin kurulması için prosedürler ortaya konur16. N-butyl-N-(4-hidroksibütil) nitrozamin (BBN) farelerde invaziv ürotelyal karsinom neden bir kanserojen olarak kullanılır17 ve tümör organoidler, hangi fare kas-invaziv mesane tümörlerinin patolojik özelliklerini sergileyen, BBN kaynaklı idrar kesesi kanseri16. Genetik tümör organoidleri işlemek için yöntem mesane kanseri gelişiminin moleküler temelini incelemek için bir model sistemi geliştirmek için lentivirus aracılı transdüksiyon kullanılarak gösterilmiştir. Buna ek olarak, mesane kanserinde doğal mesane ortamının rolünü araştırmak için bir mesane içine ortotopik organoidler nakli için bir yöntem açıklanmıştır.

<table><tbody><tr><td>0.45 ve mikro; m şırınga filtresi (PES membranı)</td><td>Kırlangıç SLHP033RS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm kültür plakası</td><td>Eppendorf</td><td>0030-702-115</td><td></td></tr><tr><td>90 mm Petri kabı</td><td>SPL</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>100 & mikro; m hücreli süzgeç</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik tüp</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>24 oyuklu plaka</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>29 G 1/2 insülin şırıngası</td><td>SHINA</td><td>B299473538</td><td></td></tr><tr><td>3 mL şırınga</td><td>Norm-ject</td><td>N7. A03</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik boru</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>A8301</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>stok konsantrasyonu: 25 mM</td></tr><tr><td>Mutlak etanol</td><td>Daejung</td><td>4023-2304</td><td></td></tr><tr><td>Emilebilir sütür</td><td>Henry Schein</td><td>039010</td><td></td></tr><tr><td>Gelişmiş DMEM/F-12</td><td>Termo</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum-klorür-potasyum (ACK) parçalama tampon</td><td>Thermo</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>stok konsantrasyonu: 50X</td></tr><tr><td>BBN(N-butil-N-(4-hidroksibutil) nitrozamin)</td><td>Tokyo Kimya Endüstrisi</td><td>B0938</td><td></td></tr><tr><td>Mavi naylon 5/0-13mm</td><td>AILEE</td><td>NB521</td><td></td></tr><tr><td>C57BL Fare</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl (çıplak fare)</td><td>Charles River</td><td>194</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz tip I</td><td>Thermo</td><td>17100017</td><td>stok konsantrasyonu: 20 mg/mL</td></tr><tr><td>Kollajenaz tip II</td><td>Thermo</td><td>17100015</td><td>stok konsantrasyonu: 20 mg/mL</td></tr><tr><td>Kollajenaz/dispas</td><td>Sigma</td><td>10269638001</td><td>stok konsantrasyonu: 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Cyrovial</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco'nun modifiye edilmiş minimum esansiyel ortamı)</td> <td>Gibco</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimetil sülfoksit)</td> <td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyu)</td> <td>Welgene</td><td>LB 001-02</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloksasin (Baytril)</td> <td>Bayer Healthcare</td><td>DIN: 02169428</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Fetal sığır serumu)</td> <td>Millipore</td><td>ES009B-KC</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>100X</td></tr><tr><td>HEK 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit)</td> <td>Welgene</td><td>BB001-01</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Hana Pharm Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen (Anafen)</td><td>Merial</td><td>DIN: 02150999</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel büyüme faktörü azaltılmış (GFR) Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>plakada organoid kültür kullanımı</td></tr><tr><td>Matrigel yüksek konsantrasyonlu (HC)</td><td>Organoid nakli için</td> <td>Corning</td><td>354248</td> kullanımı</tr><tr><td>1.5 mL mikrotüp</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>LT1 transfeksiyon reaktifi</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>murin EGF (epidermal büyüme faktörü)</td> <td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>stok konsantrasyonu: 100 &; g/mL</td></tr><tr><td>N-asetil-L-sistein</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>stok konsantrasyonu: 200 mM</td></tr><tr><td>Nikotinamid</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td>stok konsantrasyonu: 1M</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCMV.R 8.74</td><td>Addgene</td><td>22036</td><td>Ambalaj plazmid</td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100X</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Zarf plazmid</td></tr><tr><td>Polibren (heksadim etrin bromür)</td> <td>Sigma</td><td>H9286</td><td>stok konsantrasyonu: 2 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>pSiCoR</td><td>Addgene</td><td>11579</td><td>Lentiviral plazmid</td></tr><tr><td>Tıraş bıçağı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tuzlu su tamponu</td><td>JW Pharmaceutical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW41Ti sallanan kova rotoru</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermolysin, Bacillus thermoproteolyticus</td><td>Millipore</td><td>58656-2500KUCN</td><td>stok konsantrasyonu: 250 KU/mL</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25)</td> <td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj tüpü</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihidroklorür</td><td>Abmole</td><td>M1817</td><td>stok konsantrasyonu: 10 mM</td></tr></tbody></table>

fare mesane tümörü organoidlerinin kültürü, manipülasyonu ve ortotopik transplantasyonu

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

Mevcut kanser modelleri üç boyutlu (3D) tümör mimarisi nin eksikliği ve insan kanseri ile düşük alaka gibi sınırlamalar göstermiştir çünkü gelişmiş tümör modellerinin gelişimi uzun teşvik edilmiştir. Araştırmacılar son zamanlarda bir kültür çanak yerli bir tümörün özelliklerini taklit edebilir tümör organoidler olarak adlandırılan bir 3D in vitro kanser modeli geliştirdik. Burada, kanserojen kaynaklı bir murin mesane tümöründen mesane tümörü organoidlerinin kurulması için yapılan deneysel işlemler, kültür, geçiş ve in vitro olarak ortaya çıkan 3Boyutlu tümör organoidlerinin bakımı da dahil olmak üzere ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Buna ek olarak, lentivirus aracılı transdüksiyon kullanarak genetik mühendisliği için kurulan mesane tümörü organoid hatları işlemek için protokoller açıklanmıştır, tümör içine yeni genetik unsurların verimli giriş için optimize koşulları da dahil olmak üzere organoidler. Son olarak, daha fazla analiz için mesane mesane duvarına mesane tümör organoidlerinin ortotopik nakli için prosedür ortaya konur. Bu makalede açıklanan yöntemler daha iyi tedavi seçenekleri nin geliştirilmesi için mesane kanseri için bir in vitro model kurulmasını kolaylaştırabilir.

Fare mesane tümör organoidlerinin in vitro kültürü ~1 cm3 BBN kaynaklı tümörden ayrıştırılabilen tümör hücrelerinin sayısı en az 4 x 105 hücredir. Hücreler başlangıçta bazal membran matris tohumlu olduğunda, kanser olmayan hücreler ve enkaz görülebilir. Enkaz yavaş yavaş alt kültür devam ederek seyreltildi. Şekil 1B, farklı zaman noktalarında kültürlü organoidlerin görüntülerini gösterir. Tümör hücreleri tümör organoidleri oluşturmazsanız, hücreler dissosyasyon adımı sırasında potansiyel olarak ölüdür. Böyle bir durumda, enzim ile kuluçka süresi de dahil olmak üzere dissosiation prosedürleri hücre canlılığını artırmak için ayarlanması gerekir.
Lentivirus aracılı genetik manipülasyon kullanarak mesane tümörü organoidlerinde GFP ekspresyonu Mesane tümörü organoidleri başarılı lentiviral enfeksiyon ile güçlü GFP sinyalleri sergilediler(Şekil 2B). Konsantrasyondan sonra, toplam 250 μL virüs içeren ortam, bazal membran matrisinde 3 x 104 <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60469/60469fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60469/60469fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60469/60469fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60469/60469fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60469/60469fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60469/60469fig03large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Bu protokol, kanserojen kaynaklı murin mesane kanserinden elde edilen mesane tümörü organoidlerinin üç boyutlu in vitro kültürünü oluşturmak için ayrıntılı deneysel adımlar sağlar. Paslanma, genetik mühendislik ve tümör organoidlerinin ortotopik transplantasyonlarını içeren kültür yöntemleri tanımlanmıştır.

Fare Mesane Tümörü Organoidlerinin Kültürü, Manipülasyonu ve Ortotopik Transplantasyonu

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Tümör organoidleri yaygın tümör biyolojisi çalışmak için bir in vitro kanser modeli olarak kullanılmaktadır. Protokolümüz, kanser biyolojisinde çeşitli yönlerini incelemek için kritik bir araç olarak hizmet veren mesane tümörü organoidlerini izole etmek, kültürü ve genetik olarak manipüle etmek için ayrıntılı bir prosedür sağlamaktadır. Protokolümüzü kullanarak, mesane tümörü organoidlerini genetik olarak manipüle edip ilgi alanımızın genini ifade edebiliriz ya da yok edebiliriz.Ayrıca, ortotopik transplantasyon yöntemimiz ile sağlam bir tümör mikroçevre tümör organoidleri oluşturabiliriz. Prosedürü gösteren Yubin Kim, bizim laboratuvardan bir lisansüstü öğrenci olacaktır. Murine mesane tümöründen mesane tümörü organoidleri oluşturarak başlayın.Tümör parçalarına DMEM'de bir mililitre 10 milimolar HEPES ekleyin ve sterilize jiletle dokuyu doğuzlayın. Hücre süspansiyon içine parçaları ayrıştırmak için, HEPES ile DMEM dokuz mililitre ekleyin, kollajenaz tip bir ve iki, ve tümör parçaları için termolizin, ve 37 santigrat derece ve orbital shaker üzerinde% 5 karbondioksit 1,5 ila iki saat kuluçka. Kuluçkadan sonra, hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.Tüpü 400 kez g'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin. ACK lysing tampon beş mililitre pelet resuspend ve herhangi bir kırmızı kan hücreleri lyse için oda sıcaklığında tüp kuluçka 3-5 dakika. Bu arada, 150 mikrolitre buz gibi büyüme faktörüile 24 kuyuluk bir kuyuyu katlayın ve plakayı 30 dakika boyunca bir kuluçka makinesine yerleştirin.Hücrelerle birlikte tüpe 20 mililitre DMEM ekleyin ve santrifüjü tekrarlayın. Süpernatant aspire ve bir mililitre pelet resuspend 0.25% tripsin EDTA ve 10 mikromolar Y-27632 dihidroklorür. Tüpü 37 derecelik bir su banyosunda beş dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra %10 FBS ile 10 mililitre DMEM ekleyerek tripsini nötralize edin. Sindirilmemiş enkaz kaldırmak için yeni bir 50 mililitrelik tüp üzerinde 100 mikrometre hücre süzgeci ile hücre süspansiyon filtre. Tüpü 400 kez g'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin.Sonra dmem bir mililitre ile pelet resuspend ve bir hemositometre ile hücreleri saymak. Dört tümör hücresine 3-4 kez 10 tane buz üzerinde 1,5 mililitrelik mikrotüp aktarın ve 400 kez g dört santigrat derece üç dakika santrifüj. Dikkatle supernatant kaldırmak ve önceden ısıtılmış organoid orta ve 10 mikromolar Y-27632 500 mikrolitre hücreleri yeniden askıya.Hücre süspansiyonuna daha önce hazırlanmış membran matrisine iyi kaplanmış şekilde aktarın ve 24 kuyuluk plakayı tekrar kuvöze yerleştirin. Orta yı her iki günde bir 500 mikrolitre önceden ısıtılmış organoid ortamla değiştirin. Lentivirus aracılı transdüksiyondan 12 saat önce tümör organoidlerini ayırın.Ertesi gün, hızlı bir şekilde 37 derece Santigrat su banyosunda aliquot içeren bir virüs eritmek. 10 mikromolar Y-27632 ve hexadimethrine bromür mililitre başına sekiz mikrogram ile organoid orta 250 mikrolitre çözülmüş virüs ekleyin. 24 kuyulu plakadaki organoid ortamı orta içeren virüsün 500 mikrolitresiyle değiştirin ve 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte 12 ila 16 saat boyunca plakayı kuluçkaya yatırın.Ortotopik transplantasyon için mesane tümörü organoidleri hazırlamak için, 24-iyi plaka organoid orta kollajenaz dispase 500 mikrolitre ekleyin. Pipet bodrum membran matris ve orta yukarı ve aşağı sonra 37 santigrat derece 20 dakika boyunca plaka kuluçka. Kuluçkadan sonra, hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe toplayın ve beş mililitre önceden ısıtılmış DMEM ekleyin.Sonra 400 kez g dört santigrat derece üç dakika için tüp santrifüj ve supernatant aspire. Bir mililitre DMEM ile peleti yeniden askıya alın ve çözeltiyi 90 milimetrelik Petri kabına aktarın. Bir mikroskop altında, p200 pipet ile 10 ila 100 tümör organoidler almak ve buz üzerinde bir mikrotüp içine toplamak.Mikrotüpü santrifüj edin ve supernatant'ı dikkatlice çıkarın. Sonra fareler ameliyat için hazır olana kadar buz üzerinde pelet korumak. Submukozal mesane duvarı naklinden önce, şırıngaları, pipet uçlarını ve bazal membran matrisini kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun.Fare anestezi edildikten sonra, bir supine pozisyonda yatıyordu ve% 2 buharlaşmış izofluran maske teneffüs ile anestezi korumak. Steril bir gazlı bez ile povidon iyot uygulayın ve% 70 etanol ile aşağı silin. Steril cerrahi makas ile alt orta batık karın deri ve kas duvarında küçük bir enine kesi yapın.Karın boşluğundan mesane maruz ve tuzlu bir tuzlu pamuklu bez ile destek. %50 yüksek konsantrasyonlu bazal membran matriks içeren 80 mikrolitre organoid ortamda organoid peletleri yeniden askıya alın ve insülin şırınga kullanarak mesane kubbesinin ön yönüne süspansiyon enjekte edin. Kesiyi 4-0 naylon dikişle kapatın ve cerrahi bölgeyi povison iyot ve %70 etanol ile dezenfekte edin.Farenin kızılötesi ışınlayıcı altında 10 ila 15 dakika boyunca kurtarmasına izin verin. Sonra bilinci yeniden kazanana kadar fareyi tekrar izleyin. Fare mesane tümörü organoidleri kuruldu ve dokuz gün boyunca kültürlendi.Tümör hücreleri tümör organoidleri oluşturmuyorsa, dissosyasyon adımı sırasında potansiyel olarak öldürülürler ve enzimatik sindirim süresinin ayarlanması gerekebilir. Mesane tümörü organoidleri başarılı lentiviral enfeksiyon ile güçlü GFP sinyalleri sergiledi. Konsantrasyondan sonra, toplam 250 mikrolitre media içeren virüs, bazal membran matrisindeki 30.000 tek tümör hücresini enfekte etmeye ve %90 ila %100 enfeksiyon verimliliğini korumaya yetti.Mesane tümörü allografları ortotopik transplantasyondan üç hafta sonra alındı ve h&E boyama ile tümör histolojisi incelendi. Tümör organoidlerinin ortotopik nakli 2-3 hafta boyunca mesane tümörü olarak büyüyebilir. Bu prosedürü takiben, araştırmacılar ortaya çıkan tümör organoidlerinin immünohistokimyasını yapabilir veya ilgi çeken genler için kantitatif RT-PCR gerçekleştirebilirler.Bu deneyler tümör organoidlerini daha da karakterize edebilir. Protokolümüz, mesane kanseri tümörigenezde yer alan çeşitli genlerin spesifik fonksiyonlarını incelemek için tümörlerin in vivo özelliklerini korurken, fare modeline göre kanser hücrelerindeki genleri kolayca manipüle etmemizi sağlar.

culture-manipulation-orthotopic-transplantation-mouse-bladder-tumor

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Fare mesane duvar enjeksiyon orthotopically mesane kök hücre ve kanser biyolojisi incelemek için yararlı bir yaklaşımdır. Bu hassas mikrocerrahi yöntemi dikkatli tekniği ve uygulamaları ile hakim olabilir.

Fare mesane Duvar Enjeksiyon

Kateterizasyon, yerel koterizasyon ve yanık sitelerine karsinom hücreleri sonraki yapışma ile minimal invaziv bir moda dişi farelerde mesane tümörleri kurulur.

Murin Mesane Kanseri bir Ortotopik Model

Ultrason ve bioluminescent görüntüleme ile intravezikal teslim Sarna ve izleme tümör büyümesinin antitümör etkileri değerlendirmek için ortotopik mesane tümörü modeli oluşturmak.

Bir Ortotopik Mesane Tümörü Model ve intravezikal Sarna Tedavisinin Değerlendirilmesi

Bu videoda, organ ortamının gelişmekte olan tümörler üzerindeki rolünü incelemek için kültürlenmiş mesane tümörü organoidlerinin murin mesanesine ortotopik transplantasyonunu açıklıyoruz.

Mesane Tümörü Organoid Modeli: Mesane Organoidlerinin Alıcı Murin Mesanesine Ortotopik Transplantasyonu İçin Bir Yöntem

Bu videoda, kanser hücrelerini bir fare modelinin mesanesine iletmenin intravezikal prosedürünü açıklıyoruz. Bu prosedür, terapötik stratejiler geliştirmek için kullanılabilecek bir ortotopik mesane tümörü modeli oluşturmaya yardımcı olur.

Ortotopik Mesane Tümörünün Fare Modelinde Modellenmesi: Kanser Hücrelerinin Murin Mesanesine İntravezikal Uygulanması İçin Bir Prosedür

Kaynaklı organ içine kanser hücrelerinin implantasyonu yeni tedaviler değerlendirmek için yararlı bir ön-klinik modeli olarak hizmet edebilir. MB49 mesane karsinom hücreleri intravezikal Damla damla akıtma sonrası mesane içinde yetiştirilebilir. Bu protokol, tümör implantasyonu ve adenoviral teslimat amacıyla fare mesane kateterizasyon gösterir.

Gene Teslim Çalışmaları Ortotopik Mesane Kanseri Modeli

Primer fare kolon tümörü organoid kurmak için basit bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem kolon tümör hücreleri hayatta kalmak ve epitel normal bir kolon yok ise, sınırlı büyüme faktörleri içeren ortamlarda organoids içine büyümeye bu özelliği kullanır.

Birincil Fare Colon Tümörler in vitro organoid Kültür

Birincil invaziv kadavradan mesane kanseri zenograftlarını aşılamak için kurulan teknik laparotomi ve mesane seferberlik gerektirir. Bu prosedür, fareler üzerinde önemli morbidite uğratan teknik açıdan zor ve zaman alıcıdır. Bu nedenle perkütan yaklaşım ultrason rehberlik kullanarak, yüksek hassasiyet geliştirdi.

Kemirgen Ortotopik Mesane ksenogratflarının Minimal İnvaziv kurulması

Bu protokol, dişi C57BL / 6J fareler, tümör büyümesi izlenmesinde sıçangil ortotopik mesane tümörlerinin üretimini tarif eder.

Bir Fare Ortotopik Mesane Tümör Modeli ve Tümör Tespit Sistemi

Hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar), translasyonel kanser araştırmalarında, hastalığın hem genetik hem de fenotipik heterojenliğini ve kişiselleştirilmiş anti-kanser tedavilerine yanıtı yansıtan güçlü bir araçtır. Burada, fenotipik analizlerin ve ilaç yanıtlarının değerlendirilmesine hazırlık olarak insan primer mesane kanseri PDO'ları üretmek için konsolide bir protokol detaylandırılmıştır.

Hassas Tıp Araçları Olarak Mesane Kanseri Organoidleri Kültürü

Bu protokol, ilgilenilen genlerde delesyon barındıran fare ürotelyal organoidlerinin üretilmesi ve karakterizasyonu sürecini açıklar. Yöntemler arasında fare ürotelyal hücrelerinin toplanması, bir CMV promotörü ile Cre ekspresyonunu yönlendiren adenovirüs ile ex vivo transdüksiyon ve in vitro ve in vivo karakterizasyon bulunmaktadır.

Eski Vivo Fare Ürotelyal Hücrelerinde Adenovirüs-Cre Aracılı Gen Delesyonlarının Organoid Modeli

Öğrenin fare mesane tümörü organoidlerinin kültürü, genetik manipülasyonu ve ortotopik transplantasyonu yöntemlerini. Bu protokol kanser biyolojisi ve tümör mikroçevresi araştırmaları için güçlü bir model sunar.

Fare Mesane Tümörü Organoidlerinin Kültürü, Manipülasyonu ve Ortotopik Transplantasyonu

Daha fazla video keşfet